新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (12): 1870-1876.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.12.011

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新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带

王洪，汤明，孟春庆，王寒琪，杨述华，杜靖远，段德宇，邵增务

华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430022

修回日期:2014-01-03 出版日期:2014-03-19 发布日期:2014-03-19
通讯作者: 王洪，主任医师，华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，湖北省武汉市 430022
作者简介:王洪，男，1964年生，湖北省黄冈市人，汉族，1993年同济医科大学毕业，硕士，主任医师，主要从事关节镜及运动医学研究。
基金资助:
湖北省自然科学基金(2009CDB412)

Seeding fresh bone marrow aspirate directly on scaffolds to construct tissue-engineered ligament

Wang Hong, Tang Ming, Meng Chun-qing, Wang Han-qi, Yang Shu-hua, Du Jing-yuan, Duan De-yu, Shao Zeng-wu

Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China

Revised:2014-01-03 Online:2014-03-19 Published:2014-03-19
Contact: Wang Hong, Master, Chief physician, Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
About author:Wang Hong, Master, Chief physician, Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, Hubei Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hubei Province, No. 2009CDB412

摘要/Abstract

摘要：

背景：有关于应用新鲜骨髓吸出物直接局部注射修复韧带部分损伤的报道，少有提及应用新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带的研究报道。
目的：评价将新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带的可行性。
方法：构建丝素纤维/小肠黏膜下层复合支架后，骨髓种植组将骨髓吸出物直接种植于复合支架上；细胞种植组将骨髓间充质干细胞种植于复合支架上；以未接种任何物质的复合支架作为空白对照，检测各组细胞黏附密度、细胞增殖活性及细胞外基质分泌情况。将骨髓种植组复合物植入兔前交叉韧带横断处，12周后取材评价骨髓种植组材料体内生物相容性。
结果与结论：骨髓种植组孵育4 h后的细胞黏附密度、不同时间点细胞增殖率显著高于细胞种植组(P < 0.05)。骨髓种植组及细胞种植组Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌量均显著高于空白对照组(P < 0.05)，但骨髓种植组及细胞种植组两组间Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌量差异无显著性意义。骨髓种植组材料植入兔体内未引起致死性免疫排斥反应及严重炎症反应，未见明显韧带再生及血管化。说明新鲜骨髓吸出物直接种植于支架可构建组织工程韧带，并且体内短期生物相容性良好。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 复合支架材料, 韧带组织工程, 细胞种植方法, 新鲜骨髓吸出物, 体内、外生物相容性, 复合生物型支架, 湖北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: There are several reports about the application of fresh bone marrow aspirate being injected directly to repair partial ligament injury, but the application about fresh bone marrow aspirate directly being planted on scaffolds to build tissue-engineered ligament is rarely mentioned.
OBJECTIVE: To evaluate the feasibility of applying fresh bone marrow aspirate planted directly on scaffolds to construct tissue-engineered ligament
METHODS: We constructed fibroin fiber/small intestinal submucosa composite scaffold, then planting fresh bone marrow directly to built bone marrow seeding group and planting seed cells (bone marrow mesenchymal stem cells) on the scaffold to built cell seeding group. The control group had no treatment. After that, we detected the density of cell adhesion, cell proliferation ability and extracellular matrix secretion. Then, the composite in the bone marrow seeding group was implanted into the broken anterior cruciate ligament in rabbits, and material biocompatibility in vivo was evaluated after 12 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: After 4 hours of incubation, bone marrow seeding group was significantly higher than the cell seeding group in cell adhesion density and proliferation rate (P < 0.05). Bone marrow seeding group and cell seeding group showed higher type I, III collagen secretion compared with the control group (P < 0.05), but the collagen secretion of bone marrow seeding group and cell seeding group showed no significant difference. Composite cell scaffold implantation in vivo did not cause fatal immune rejection and severe inflammatory reaction, and no significant ligament regeneration and vascularization occurred. These findings indicate that fresh bone marrow aspirate can be seeded directly on scaffolds to construct tissue-engineered ligament, and the short-term biocompatibility in vivo is good.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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Key words: biocompatible materials, stents, ligaments, bone marrow

中图分类号:

R318

王洪，汤明，孟春庆，王寒琪，杨述华，杜靖远，段德宇，邵增务. 新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(12): 1870-1876.

Wang Hong, Tang Ming, Meng Chun-qing, Wang Han-qi, Yang Shu-hua, Du Jing-yuan, Duan De-yu, Shao Zeng-wu. Seeding fresh bone marrow aspirate directly on scaffolds to construct tissue-engineered ligament[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(12): 1870-1876.

图/表（结果） 3

2.1 细胞黏附密度的测定 骨髓种植组、细胞种植组的细胞黏附密度分别为(0.38±0.10)×10⁶/cm³，(0.25±0.05)× 10⁶/cm³，两组细胞黏附密度比较差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。
2.2 细胞增殖曲线 骨髓种植组、细胞种植组各时间点数据行成组t 检验，差异有非常显著性意义(P < 0.01，图2)。

2.3 Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维蛋白含量

Ⅰ型前胶原氨基端肽/总胶原比值：培养2，3周时，骨髓种植组、细胞种植组均高于空白对照组(P < 0.05)，骨髓种植组与细胞种植组比较差异无显著性意义(P > 0.05) ，见表2。

Ⅲ型前胶原氨基端肽/总胶原比值：培养2，3周时，骨髓种植组、细胞种植组均高于空白对照组(P < 0.05)，骨髓种植组与细胞种植组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.4 体内生物相容性评价

大体观察：所有12只实验动物均存活，术后一二天即可单侧完全负重站立、跛行，术侧部分负重，5只出现患膝关节肿胀、积液，未行特殊处理，至术后4周仍有2只稍肿胀。3只出现切口处红肿、渗出，予加强换药处理，至术后3周均Ⅰ/甲愈合。

组织病理观察：术后12周，12只实验动物全部处死，切开患膝关节显示：3只关节内多量稍浑浊淡黄色滑液、黏稠；其余关节内仅少量清亮滑液；全部患膝关节内均可见多少不等血凝块附着在支架材料表面，但未见形成明显滑膜包裹结构，表面未见小血管生长；关节内其他结构如关节软骨、半月板、后交叉韧带未见明显异常(图3A)。完整取出重建支架材料，可见材料直径增粗明显、呈暗红色、外观似鱼肉状，材料疏松、柔软、顺应性可，具一定韧性；表面小肠黏膜下层已有小部分降解或与内层丝素纤维材料黏成为整体结构，材料表面未见明显滑膜增生包裹(图3B)；纵切标本镜下观察可见材料内侧丝素纤维结构大部分相互粘连、增粗，无法清晰分辨，近材料表面极少量纤维组织无序排列，内部无纤维长入，少量炎细胞散在分布于材料表面，排列紊乱(图3C)。

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引言

韧带损伤一直是运动医学领域研究的重点和热点，随着现在竞技体育的不断发展和交通事故伤的增多，交叉韧带损伤率和重建率有增无减。美国每年约有200 000例前交叉韧带损伤病例，其中约100 000例需行前交叉韧带重建^[1]。中国尚无准确的流行病学统计数据。敖英芳等^[2]报道，中国现役集训运动员前交叉韧带损伤的总发病率为0.47%。交叉韧带损伤后由于其低的自体修复能力，往往是膝关节功能丧失的先兆，可直接造成关节功能障碍、继发软骨损伤、关节不稳，最终导致骨关节炎等，故尽早进行韧带重建手术实属必要。自体肌腱、同种异体肌腱或人工韧带重建仍然是其首选方式，但均有优劣势。使用自体移植物的最大缺点是给供区带来高达40%的并发症发生率及多韧带损伤时供源有限等缺点^[3]；而同种异体移植物虽然可解决供区问题，但存在免疫排斥、异物反应、传播疾病等并发症可能，且异体肌腱植入后在诱导细胞黏附、再血管化及力学性能的维持等方面均不如自体肌腱^[4]。同时自体及异体肌腱植入后均存在一个移植物强度减弱期，易致移植物松弛甚至再次断裂^[5-6]。而人工韧带如LARS韧带能满足近期力学性能的要求，但远期效果缺乏系统随访资料，且同样存在异物反应、免疫排斥等问题。

组织工程韧带研究可能是解决上述问题的根本途径。间充质干细胞来源丰富，增殖能力强，具有多向分化潜能；大量研究证实与成纤维细胞相比，间充质干细胞具有良好的增殖活性和分泌表达Ⅰ型、Ⅲ型胶原等韧带特异性细胞外基质特性，是应用于组织工程种子细胞的首选^[7]。但体外间充质干细胞的分离、扩增、传代、培养、种植等步骤耗时耗力，并且种植于一般支架后细胞黏附及增值效果不甚理想，因而延长了组织工程韧带构建周期。

近来， Broese等^[8]应用新鲜骨髓吸出物及体外分离培养的人骨髓间充质干细胞分别与肌腱基质支架复合构建组织工程韧带置入生物反应器中，通过检测细胞增殖、细胞活性及Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达量，指出应用新鲜骨髓吸出物种植于基质支架构建组织工程韧带与以往需分离培养种子细胞复合支架构建组织工程韧带效果无显著性差异，阐述了应用新鲜骨髓吸出物直接种植支架的可行性，这种新型的细胞种植方法可能会简化，并且缩短组织工程韧带的构建周期。但是，此研究只涉及细胞支架材料体外的生物学行为，未能阐述复合材料在体内的生物相容性等特性，并且由于肌腱基质支架力学性能欠佳，在组织工程中应用受到一定限制，因此作者设想构建一种新型的力学性能优良、可生物降解的生物型复合支架，通过在支架上分别种植新鲜骨髓吸出物及体外分离培养的间充质干细胞进行体外孵育培养，定期检测材料上细胞黏附、增殖及细胞外基质分泌活性评价体外生物相容性，然后应用此细胞-支架复合物重建家兔横断之前交叉韧带，检测其体内生物相容性，探讨其应用于临床的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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材料方法

设计：重复测量观察实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年2月在华中科技大学同济医学院协和医院中心实验室完成。

材料：

实验动物：SD大鼠、普通级新西兰大白兔均购自协和医院实验动物中心。

实验方法：

小肠黏膜下层制备：参照本实验室前期处理办法，分别经物理及化学方法处理新鲜小肠(取自封闭饲养、检疫健康的猪，体质量大于200 kg)得到厚约1 mm薄层、半透明状、完全脱细胞的小肠黏膜下层^[9]。

丝素纤维精制：参照本实验室前期处理办法，经Na₂CO₃煮沸脱胶法精炼处理初级蚕丝得到基本完全脱去丝胶蛋白的丝素纤维^[9]。三蒸水漂洗后于真空干燥器中干燥，留置备用。

小肠黏膜下层和丝素纤维分层包绕构建复合支架材料：PBS稍湿化处理上述小肠黏膜下层，再将丝素纤维均匀排列于其上，然后用小肠黏膜下层分层包绕丝素纤维形成复合支架材料，控制材料直径约2 mm，长度6.0-7.0 cm，(图1A)。最后将复合支架材料经干燥、钴射线消毒无菌，程序性降温至-80 ℃冻干备用。

新鲜骨髓提取：取6-8周龄雄性SD大鼠12只(体质量不限)，颈椎脱臼处死，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨，剔除所附的软组织并切除骨骺，显露骨髓腔，以肝素 (200 U/mL)充分润湿的20 mL注射器抽吸骨髓2 mL，将收集的骨髓用吸管吹匀后均分为2份，吸管抽吸1 mL用于间充质干细胞的分离培养，剩余的1 mL留待直接种植支架。

大鼠骨髓间充质干细胞分离纯化培养：将上述准备的骨髓直接离心(1 000 r/min，5 min)弃上清液，加入L-DMEM细胞培养液(含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)2 mL重悬，以10⁵/cm²的密度将细胞悬液移入培养瓶，置入37 ℃、体积分数5%CO₂、pH值7.5、饱和湿度的培养箱内培养。第1次于48 h后全量更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，后期待培养液变色时及时半量换液。原代培养有75%融合时可传代，移除培养液，加入0.25%胰蛋白酶1 mL+0.02% EDTA 1mL 于培养瓶中，刚好铺满瓶底，移至倒置显微镜下待大多数细胞核回缩、呈圆形、漂浮时即可加入胰蛋白酶3倍的培养液轻轻吹打终止消化，将消化后的细胞悬液移入离心管内离心(1 000 r/min，5 min)，弃上清液，加入细胞培养液(含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)重悬，静置1 min后，将上清液以2.0×10⁵/cm²的密度移入培养瓶内，置 37 ℃、体积分数5%CO₂、pH值7.5及饱和湿度的培养箱内培养。按1∶2比例传代，培养至第3代后冻存备用。细胞培养各个阶段通过细胞形态学观察及免疫组织化学鉴定细胞表型鉴定为干细胞。

细胞种植于支架材料构建细胞材料复合物：取直径 10 cm培养皿36个，分为3组，每组12皿，做好标记，无菌操作放入上述处理支架材料。骨髓种植组将上述剩余的 1 mL新鲜骨髓吸出物在严格无菌条件下(超净台操作)种植于已消毒无菌的支架材料，构建细胞材料复合物。细胞种植组取第3代80%融合的骨髓间充质干细胞，以 2.0×10⁹L^-1浓度的细胞悬液接种于PBS预湿处理的上述支架材料(预湿液已吸除)，构建细胞材料复合物。以未复合任何成分的上述支架材料作为空白对照组。3组材料加适量 L-DMEM培养液(未加入胎牛血清)，置入37 ℃、体积分数5%CO₂、pH值7.5及饱和湿度的培养箱内孵育4 h后弃去培养基，PBS冲洗2遍后再加入含体积分数10%胎牛血清的全培养基继续培养；三四天换液1次。培养3周后程序性降温至-80 ℃保存，留待后期行体内生物相容性检测。

细胞外基质分泌活性测定：

总胶原的测定：培养3周后，取3组标本常规干燥，取10 mg标本研磨碎，加入0.3 mL蒸馏水、6 mol/L盐酸0.3 mL离心均匀，置入120 ℃高压锅中水解2 h，蒸馏水稀释至 1.5 mL，12 000 r/min离心15 min。取待测液50 μL，加入0.05 mol/L CuSO₄溶液25 μL、10%NaOH溶液25 μL及体积分数6%H₂O₂溶液25 μL，置于60 ℃水浴振荡10 min。加入6 mol/L盐酸50 μL及5%对二甲氨基苯甲醛溶液50 μL，置于50 ℃水浴15 min，冰上冷却后，用酶标仪测定波长 560 nm的值，计算羟脯氨酸含量^[10]。按Grant^[11]的方法，计算胶原含量：胶原(%)=羟脯氨酸(%)×7.46。

Ⅰ型、Ⅲ型胶原含量的测定：通过测定Ⅰ型、Ⅲ型前胶原氨基端肽来反映，将3组样本取出常规干燥后，各取 10 mg立即置入0.6%胶原酶A中溶解48 h后终止反应，大鼠Ⅰ型、Ⅲ型前胶原氨基端肽双抗体夹心ELISA法，用酶联仪在450 nm波长依序测量各孔的A值。以标准物的浓度为横坐标(对数坐标)，A值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的A值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数即为样品Ⅰ型、Ⅲ型前胶原氨基端肽含量，再除以各自样品测定的总胶原含量分别得到Ⅰ型、Ⅲ型前胶原氨基端肽与总胶原的比值。

细胞黏附密度的测定：取做好标记的24孔板，将复合支架材料制成0.2 cm×0.5 cm大小的圆柱体状，无血清培养基适当湿润后置入24孔板内，前8孔直接加入新鲜骨髓吸出物800 µL为骨髓种植组，中间8孔加入骨髓间充质干细胞，调整浓度1.0×10⁸ L^-1的细胞悬液800 µL为细胞种植组，后8孔设为空白对照组。分别加入无血清培养基1 mL，置入37 ℃、体积分数5%CO₂、pH值7.5及饱和湿度的培养箱内孵育4 h后，各组样本先用PBS轻轻冲洗2遍去掉未黏附的细胞，再用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA把黏附的细胞消化下来，分别收集每孔内的细胞，细胞计数板计数。每孔内的黏附细胞除以种植材料体积即为每孔的细胞黏附密度。

MTT 测定细胞增殖活性：将复合支架适形成薄片状，大小适合铺于96孔板中，设32孔为骨髓种植组，每孔加入新鲜骨髓吸出物200 µL；32孔为细胞种植组，加入调整细胞浓度为0.5×10⁷ L^-1的细胞悬液200 µL；32孔为空白对照组，加入200 µL含血清的全培养基。分别置入37 ℃、体积分数5% CO₂、pH值7.5及饱和湿度的培养箱内孵育4 h，PBS轻轻冲洗2遍去掉未黏附的细胞，再加入含体积分数10%胎牛血清的全培养基300 µL继续培养，每三四天换液1次，培养后第1，3，5，7，9，14，21天行MTT检测，各取每组的孔加入5 g/L MTT 20 µL，孵育4 h终止，弃上清，每孔再加入150 µL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解，细胞材料组将材料充分洗涤后取出最后比色时，以空白孔调零，选择490 nm波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A)，以时间为横轴，吸光度值(A)为纵轴描绘细胞增殖曲线。

体内生物相容性评价：取12只普通级成年健康雄性新西兰大白兔，体质量2.0-3.0 kg，投币决定重建膝，选择骨髓种植组支架重建。3%的戊巴比妥行耳缘静脉麻醉，生效后将其固定在兔手术台，术区备皮，1%活力碘术区消毒，铺无菌巾。取经髌骨内侧缘切口长约4 cm，逐层切开皮肤、皮下显露髌骨，适当向上下延长直至显露胫骨结节及股四头肌远侧端，切断髌骨周围支持带，外推髌骨至脱位，切除髌下脂肪垫，屈曲膝关节显露前后交叉韧带，内外侧半月板，仔细辨认前交叉韧带的上下止点并作定位标记后，横断韧带体部(图1B)，Transtibal技术建立胫骨及股骨隧道：屈膝90°，以3.0 mm克氏针自胫骨结节内侧3mm处向前交叉韧带下止点处钻取胫骨骨隧道，再自前交叉韧带上止点向股骨下端前外侧钻取股骨骨隧道，清理两骨隧道内骨渣。

取出-80 ℃深低温冰箱保存的韧带复合物，置于40 ℃生理盐水中解冻15 min，再经生理盐水漂洗，两端以2号爱惜帮缝线编织缝合，带线技术将复合韧带组织导入骨隧道；自股骨骨道出口近侧5 mm以1.0 mm克氏针从外向内钻前后两骨道(间隔2 mm)，两股缝线分别穿入骨洞至股骨内侧，适当牵引力量下打结固定；同样自胫骨骨道出口远端5 mm以1.0 mm克氏针从内向外钻取前后两骨洞(间隔 2 mm)，缝线分别穿入骨洞至胫骨外侧，屈膝30°适当牵引下打结固定(图1C)。术中行Lachman实验，以屈曲15°时前后移位不超过2 mm为宜，然后1号线逐层缝合，纱布弹力绷带包扎。术后3 d内肌注青霉素20×10⁴ U/kg，3 d换药1次。统一笼养。

术后观察家兔伤口愈合情况，关节肿胀、积液情况及步态，关节活动度及关节稳定性；12周后处死动物，观察关节内组织结构变化；韧带材料在膝关节内的变化：包括表面滑膜覆盖情况，韧带颜色、质地、性状改变；完整取出韧带包括骨隧道内部分，评价韧带组织学变化情况。

主要观察指标：骨髓种植组支架的体内外生物相容性。

统计学分析：实验所得数据均以x(_)±s表示。用SPSS 14.0进行统计学处理，两组资料比较采用成组t 检验；多组资料比较采用单因素方差分析，在有组间差异时用SNK-q检验进行组间均值比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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讨论

许多体内外实验均证实了间充质干细胞作为韧带组织工程种子细胞的潜在可能性及独特优势；Ge等^[6]证实相比于成纤维细胞，间充质干细胞在细胞增殖和细胞外基质分泌能力方面均有显著优势。而目前种植细胞的方式均为先从骨髓或其他组织分离培养间充质干细胞，经传代、扩增后再以一定细胞密度种植于支架材料上，该种细胞种植方法的优势在于可精确控制细胞数量和细胞种类等因素。然而目前还没有证据证明该法优于直接应用新鲜骨髓吸出物种植于支架材料。实验结果表明直接骨髓种植法相较于传统的细胞分离培养种植法具有更高的细胞黏附率及细胞增殖率。推测原因可能与新鲜骨髓中含有丰富的细胞因子及生长因子有关。以前的许多实验已证实多种细胞因子和生长因子具有促进间充质干细胞黏附、增殖及分泌的能力，如碱性成纤维细胞生长因子具有诱导间充质干细胞向韧带成纤维细胞方向特异性分化的作用^[12]。而众所周知，新鲜骨髓中含有的多种生长因子可能在诱导间充质干细胞增殖、分化及韧带生成、血管化等方面发挥重要作用^[13]。另外，新鲜骨髓吸出物实际上是多种细胞的混合物，包含了血细胞及其前体细胞和多种成体干细胞，如红细胞及原红细胞、血细胞及巨核细胞和淋巴细胞、单核细胞等多种白细胞，成体干细胞主要包括造血干细胞和间充质干细胞。实验中新鲜骨髓种植过程中，非黏附细胞如红系、巨核系、淋巴细胞、单核细胞等在材料冲洗过程中可以被去除，但仍有多种黏附细胞如内皮细胞和间充质干细胞一起黏附于材料上^[14]，故实验中骨髓接种组测定的细胞在材料上的黏附密度实际上是多种细胞的黏附密度。内皮细胞已被证实在诱导心肌细胞分化及诱导血管化方面有独特作用^[15]，故骨髓接种组材料上黏附的内皮细胞可能为韧带再生及血管化方面提供重要的帮助。

实验中两组种植方法比较细胞在材料上的黏附密度及细胞的增殖能力具有显著性差异，可能也与骨髓接种组骨髓直接种植导致多种细胞黏附于材料，以及骨髓中含有多种促细胞黏附及增殖能力的细胞因子和生长因子有密切关系。尽管骨髓种植组细胞的黏附密度可能不甚准确，且无法标准化，但仍可通过多次重复实验基本掌握适合的骨髓种植量，以保障材料上黏附足够的间充质干细胞和其他功能细胞和生物因子数量。此外，还可通过复合材料成骨诱导后测定材料碱性磷酸酶活性验证间充质干细胞的数量。尽管实验测量的骨髓接种组材料上细胞增殖能力较细胞种植组显著高，但相比于以往的一些实验中间充质干细胞的增殖率仍稍低^[16]，可能与骨髓中生长因子浓度无法调控及多种因子相互干扰有关，另外所用支架材料也可能对细胞增殖率有一定影响；因此如何提高功能性干细胞和生长因子的黏附量，同时避免无用或有害细胞的增殖与分化是亟待解决的问题，查阅相关文献推测可能可通过加入外源性生长因子诱导或建立共培养系统来调控。

两组材料分泌的韧带特异性细胞外基质Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量较空白对照组显著提高；然而两组间胶原分泌量差异无显著性意义，与预期设想骨髓中含有多种促细胞外基质分泌的因子故骨髓种植组胶原分泌量必然高的结果有出入。可能与骨髓中细胞因子量无法调控至最有效促胶原分泌浓度有关，且多种因子及其他细胞之间可能存在相互抑制效应^[17]。然而，骨髓种植组胶原分泌量较空白对照组差异显著至少证实了骨髓种植组可以提高材料的胶原分泌，且效果与以往传统种植细胞及联合应用特异性生长因子效果差异无显著性意义。

实验所用的支架材料为小肠黏膜下层/丝素纤维复合材料，小肠黏膜下层经机械方法处理后呈半透明状，其组成成分及结构和结缔组织的细胞外基质较为相似，更接近于天然结缔组织的复杂结构，是一种不含细胞的细胞外基质材料，具有良好的生物相容性^[18]。小肠黏膜下层中含有大量在组织生长修复中起重要作用的生物成分^[19]，且作为细胞支架材料植入宿主体内后不引起明显免疫排斥反应，能迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成和宿主细胞的长入和分化^[20] 。丝纤维是一种由多种物种分泌的天然共聚物，其经脱胶处理后所得的丝素纤维不仅具有良好的生物相容性、缓慢的降解率，同时经过适当编织加工后力学性能优良^[21]。王洪等^[21]实观察采用单螺旋和3股螺旋蚕丝两种不同编织方法制备的丝状支架力学性能和细胞黏附性能的差异。结果显示，单螺旋、3股螺旋两种丝状支架的最大载荷、最大拉伸长度、弹性模量差异无显著性意义；两种编织方法的丝状支架的丝状纤维表面均光滑，有较多的骨髓间充质干细胞黏附在丝状纤维上。表明单螺旋和3股螺旋两种丝状支架的力学性能和细胞黏附性能相近。实验结合了两种材料的优点，通过小肠黏膜下层分层包绕编织后的丝素纤维构建复合支架材料；材料的最外层为小肠黏膜下层，它可有效促进细胞的黏附，增殖与分化及血管的长入和韧带的改建塑型；而其内层为丝素蛋白纤维，可提供优秀的生物力学性能及缓慢的降解率。实验室前期工作通过测定该复合支架材料(直径为7 mm)的最大载荷、刚度和最大拉伸长度，发现与正常前交叉韧带的各项力学指标无统计学差异，指出该复合支架材料生物力学性能优秀，满足韧带组织工程支架材料力学要求^[22]，并且具有良好的抗拉能力和较好的柔韧性，能够满足人在一般运动时的力学要求。

实验通过建立动物前交叉韧带横断损伤及材料标准化重建模型，简单评价复合细胞后支架材料在动物体内的短期生物相容性，通过大体观察证明材料未引起动物致死性免疫排斥反应及患膝关节严重炎症反应，也未引起对关节内其他结构的破坏及干扰，关节内滑膜未见明显增生；但可见部分动物体内炎症性积液，组织病理可见材料及其周边有少量炎细胞浸润；材料植入体内可见部分降解，主要为小肠黏膜下层的降解，与此材料固有的降解速率有关^[23]，同时材料表面未见明显滑膜组织覆盖及小血管长入，但组织病理可见材料表面极少量纤维生长，排列紊乱，无方向性，推测可能与材料植入时间过短、成纤维细胞增生、胶原分泌不足、尚未诱导血管发生等有关，还需要通过长期、大样本动物实验进一步探索材料在体内的转归。

实验局限性：由于新鲜骨髓吸出物实际是多种细胞混合物，直接种植支架后的黏附细胞不止一种，实际上包括了间充质干细胞和内皮细胞等多种细胞，故由此测得的细胞黏附率其实并不是间充质干细胞黏附率；同时，其他细胞及各种化学因子的存在可能对细胞黏附率及细胞增殖活性等其他生理参数测定均有影响；另外，此实验不可定量控制分析参数较多，如骨髓吸出物组种植前细胞量无法定量，导致测定的细胞黏附率及增殖率均无法标准化；最后，实验材料体内生物相容性检测时间较短，无法全面评价材料在体内生物力学稳定性、材料最终转归及重建组织腱骨愈合情况等。故还需进一步优化补充实验方案、并且进行长期、大样本的体内外实验来评价此种细胞种植方法应用于韧带组织工程的可行性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程
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新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带

Seeding fresh bone marrow aspirate directly on scaffolds to construct tissue-engineered ligament

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