不同来源间质干细胞移植治疗大鼠肝纤维化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来研究表明间充质干细胞可分泌多种生长因子，在肝纤维化的治疗方面有一定的应用前景。

目的：探讨不同来源的间充质干细胞对大鼠肝纤维化的治疗作用。

方法：四氯化碳腹腔注射构建SD大鼠肝纤维化模型50只，另取10只正常SD大鼠作为正常对照组，将SD模型大鼠随机分为5组，每组10只，根据移植不同来源的间质干细胞命名为模型对照组、生理盐水组、骨髓间充质干细胞组、脐带间充质干细胞组、脐血间充质干细胞组。分离不同来源的间充质干细胞，造模8周后，取不同来源的间质干细胞2×10⁶经尾静脉输注至SD大鼠模型体内，12周后处死各组大鼠，检测血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和白蛋白水平，荧光定量PCR法检测肝组织中Ⅰ型胶原和胶质纤维酸性蛋白的表达。

结果与结论：成功建立了SD大鼠肝纤维化模型，骨髓间充质干细胞加重纤维化水平，脐血间充质干细胞与脐带间充质干细胞能降低大鼠的肝纤维化水平，脐带间充质干细胞的作用最明显，能明显降低谷丙转氨酶、谷草转氨酶及Ⅰ型胶原和胶质纤维酸性蛋白的表达。结果可见不同来源的间质干细胞对于大鼠纤维化具有不同的作用，骨髓间充质干细胞促进肝纤维化，脐带和脐血间充质干细胞能缓解大鼠的肝纤维化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 间质干细胞, 骨髓, 脐带, 脐血, 大鼠纤维化

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete various growth factors, and has certain application prospect in the treatment of liver fibrosis.

OBJECTIVE: To explore the different sources of mesenchymal stem cells in the treatment of liver fibrosis in rats.

METHODS: Fifty Sprague-Dawley rats were given intraperitoneal injection of carbon tetrachloride to construct the model of liver fibrosis. Another 10 normal Sprague-Dawley rats were used as normal controls. Model rats were randomly divided into five groups, 10 rats in each group, including model control group, normal saline group, bone marrow mesenchymal stem cell group, umbilical cord mesenchymal stem cell group, and umbilical cord blood mesenchymal stem cell group. After 8 weeks of modeling, different sources of mesenchymal stem cells at a density of 2×10⁶ were injected via tail vein into model rats. After 12 weeks, the rats were killed, and serum alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and albumin levels were detected as well as the expression of type I collagen and glial fibrillary acidic protein in liver tissue was detected by fluorescence quantitative PCR method.

RESULTS AND CONCLUSION: We have successfully established the SD rat model of hepatic fibrosis. Bone marrow mesenchymal stem cells aggravated hepatic fibrosis, umbilical cord blood and umbilical cord mesenchymal stem cells could reduce the level of hepatic fibrosis in rats. Umbilical cord mesenchymal stem cells had the most obvious effect that significantly reduced expressions of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and type I collagen and glial fibrillary acidic protein. The results showed different sources of mesenchymal stem cells have different effects on rat fibrosis. Bone marrow mesenchymal stem cells aggravate hepatic fibrosis, and umbilical cord and umbilical cord blood stem cells can alleviate hepatic fibrosis in rats.

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Key words: stem cells, mesenchymal stem cell transplantation, bone marrow, umbilical cord, fetal blood, liver cirrhosis, rats, Sprague-Dawley

中图分类号:

R394.2

曲鑫，王新超，韩璐，张海超. 不同来源间质干细胞移植治疗大鼠肝纤维化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.017.

Qu Xin, Wang Xin-chao, Han Lu, Zhang Hai-chao. Different sources of mesenchymal stem cells in the treatment of liver fibrosis in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.06.017.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 60只SD大鼠均进入结果分析。

2.2 间充质干细胞形态学观察 原代培养第4天，脐带间充质干细胞多呈成纤维样细胞形态，第3代脐带间充质干细胞形态均一，呈鱼群样排列生长(图1A，B)。经传代培养到第2代时，骨髓间充质干细胞呈漩涡状贴壁生长(图1C)，第4代时细胞形态较单一，状态饱满，呈梭形生长(图1D)。原代贴壁脐血间充质干细胞，呈漩涡状排列，第3代贴壁脐血间充质干细胞形态未见明显变化(图1E，F)。

2.3 间充质干细胞的表型鉴定 对第3代脐带间充质干细胞进行流式细胞仪检测表明：细胞表达CD13(98%)、CD29(96%)、CD44(97%)间充质干细胞抗原标志，几乎不表达造血细胞表型CD45(0.7%)、内皮细胞的特征性表型CD31(1.9%)。对第3代骨髓间充质干细胞进行流式细胞仪检测表明：细胞表达CD73(97%)、CD105(93%)间充质干细胞抗原标志，几乎不表达造血细胞表型CD45 (1.7%)，CD34(2.0%)。对第3代脐血间充质干细胞进行流式细胞仪检测表明：细胞表达CD29、CD73(SH3)，几乎不表达CD31(内皮细胞特异性抗原标记)，CD34(造血干细胞阳性标记)。

2.4 不同组织来源的间质干细胞对SD大鼠肝纤维化功能的影响 结果显示模型对照组大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的值明显高于正常大鼠，白蛋白的水平明显低于正常大鼠，提示模型组大鼠肝脏功能出现损伤，骨髓间充质干细胞组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性明显高于模型对照组大鼠，白蛋白明显低于模型对照组大鼠，提示骨髓间质干细胞能进一步加重肝脏功能的损伤，脐血间充质干细胞组和脐带间充质干细胞组大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的值较模型对照组明显下降，白蛋白的水平较模型对照组明显升高，脐带间充质干细胞组大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶值较脐血间充质干细胞组大鼠降低明显，白蛋白的水平较脐血间充质干细胞组升高明显(P < 0.05，表1)。

2.5 实时定量PCR检测结果 图2A为Ⅰ型胶原mRNA扩增过程(半对数图谱)，图2B为Ⅰ型胶原mRNA熔解曲线；图2C为胶质纤维酸性蛋白mRNA扩增过程(半对数图谱)，图2D为胶质纤维酸性蛋白mRNA熔解曲线。
2.6 各组大鼠肝组织中Ⅰ型胶原和胶质纤维酸性蛋白水平的比较 结果显示模型对照组大鼠的肝组织Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量明显高于正常对照大鼠，骨髓间充质干细胞移植组大鼠肝组织的Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量明显高于模型对照组，脐血间充质干细胞和脐带间充质干细胞组大鼠肝组织的Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量明显低于模型对照组大鼠，其中脐带间充质干细胞组大鼠肝组织的Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量明显低于脐血间充质干细胞组大鼠(P < 0.05，表1)。

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引言

材料方法

设计：随机区组动物实验。

时间及地点：于2010年1月至2012年3月在天津市内分泌研究所完成。

材料：

实验动物：SPF级SD大鼠60只，体质量(200±20) g，6-8周龄，雌雄不限，购自北京维通利华有限公司，于天津市内分泌研究所实验动物中心常规饲养，光照和暗适应各12 h /d，1周后开始实验。

试剂和材料：低糖DMEM培养基、胎牛血清及胰蛋白酶购自GIBCO公司；CCl₄购自上海生工有限公司，引物由上海生工生物公司合成；Trizol 细胞裂解液购自Invitrogen 公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa 公司，其他试剂均为国产分析纯试剂。

实验方法：

SD大鼠肝纤维化模型的制备：随机选取10只SD大鼠为正常对照组。其余50只SD大鼠制备肝纤维化模型，CCl₄ 用等体积橄榄油稀释后腹腔内注射(1 mL/kg)，2次/周，共注射8周。8周后随机抽取5只模型鼠，取大鼠肝脏组织做病理学检测，检查肝纤维化情况，确定肝纤维化模型制备成功^[2]。将造模成功大鼠随机分为5组，分别为模型对照组10只、生理盐水组10只，骨髓间质干细胞组10只，脐带间质干细胞组10只，脐血间质干细胞组10只。

间质干细胞的分离培养：

骨髓间充质干细胞：将SD大鼠脱颈椎处死，无菌条件下分离股骨和胫骨，用含有体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液将骨髓腔中的细胞冲洗至细胞培养瓶中，37 ℃，体积分数为5%CO₂条件下培养，次日丢弃原培养液，换成新的全培养液，贴壁的细胞即为骨髓间充质干细胞，每隔2 d传代1次，取第3代细胞用于实验。

脐带间充质干细胞：取孕鼠的脐带，用无菌PBS清洗干净，使用胰酶消化30 min，每隔10 min吹打一次，使得脐带组织尽可能的破碎，然后使用1 000 r/min离心10 min，弃上清液，使用体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM培养液重悬，接种于细胞培养瓶中，贴壁的细胞即为间充质干细胞，每隔2 d传代1次，取第3代细胞用于实验。

脐血间充质干细胞：取孕鼠的脐血，培养方法与骨髓间充质干细胞一致，每隔2 d传代1次，取第3代细胞用于实验。

细胞移植：每种间质干细胞根据实验动物的分组情况，以2×10⁹ L^-¹的细胞浓度从尾静脉回输给模型鼠，每只 1 mL，3 d后再等量回输1次，生理盐水组以生理盐水代替。

检测指标：①移植4周后，取大鼠的血液，采用全自动生化仪检测血清肝功(谷丙转氨酶、谷草转氨酶和白蛋白水平)。②处死大鼠，取其肝组织，采用Trizol法提取肝组织总RNA，反转录合成cDNA，以其为模板，采用FTC2000荧光定量PCR仪扩增并进行荧光定量检测Ⅰ型胶原和胶质纤维酸性蛋白的表达，反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s，共39 个循环。引物如下^[3]：Ⅰ型胶原：上游：GGA GAG TAC TGG ATC GAC CCT AAC，下游：CTG ACC TGT CTC CAT GTT GCA；胶质纤维酸性蛋白：上游：TGA CCG CTT TGC TAG CTA CAT C，下游：GCG CCT TGT TTT GCT GTT C；GAPDH：上游：CCT GGA GAA ACC TGC CAA GTA T，下游：CTC GGC CGC CTG CTT。

统计学分析：所有的数据均通过SPSS 17.0进行处理，计量数据使用x(_)±s表示，组间比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肝脏的病变是临床上常见的严重危害健康和耗费社会资源的主要疾病之一，在中国肝脏疾病的发病率非常高^[4-8]，在世界范围内中国的发病率居首位，肝纤维化是由多种不同病因引起的慢性肝病的典型病理学改变，其主要的发病机制是肌成纤维的增多，继而导致细胞外基质合成增加、降解减少，是很多种慢性肝脏疾病的终末期表现，可以由肝硬化、肝炎等疾病导致，目前临床对于末期肝病的治疗没有比较理想的方法，主要倾向于肝脏移植、肝细胞移植和干细胞移植，但都面临着供体来源困难和免疫排斥等问题，极大限制了临床发展^[9-11]。

随着干细胞技术的发展，间充质干细胞得到了广泛的关注，间质干细胞是来源于中胚层的干细胞，具有多项分化潜能，不仅可以分化为本胚层的细胞还可以分化为其他胚层的细胞，而且没有免疫排斥的现象、容易分离获得、在体外能够大量的扩增，而且没有伦理的限制，在复杂疾病的治疗中展现了广阔的应用前景^[12-16]。目前间质干细胞的来源很多，主要有骨髓、脐血、脐带、脂肪、滑膜、外周血等，不同来源的间质干细胞在疾病的治疗方面具有不同的效果^[16-20]。宛莹等^[21]用硫代乙酰胺(TAA)建立小鼠肝纤维化模型，脐带源间充质干细胞尾静脉移植后3 d和7 d均可有效改善由硫代乙酰胺诱导造成的小鼠体质量的减轻和肝质量的增加，明显降低了血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性，使肝细胞结构形态趋于正常，抑制了胶原的沉积。陈冬波等^[22]采用CCl₄腹腔注射小鼠制备肝纤维化模型，分别于第4，10周给予尾静脉注射移植脐带间充质干细胞进行治疗，均可改善肝功能，减轻纤维化程度。刘英等^[23]采用CCl₄植物油皮下注射8周制成肝硬化大鼠模型，经尾静脉内注射人脐带源间充质干细胞混悬液，血清白蛋白和胆固醇水平明显升高，血清碱性磷酸酶水平明显下降，肝组织中胶原纤维的量明显减少。廖金卯等^[24]采用四氯化碳法制备肝硬化大鼠模型，造模成功后经门静脉注射1 mL BrdU标记的人脐血间充质干细胞(5×10⁶个)，细胞移植后4周，大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素明显降低，而白蛋白明显升高(P < 0.01)；肝细胞炎性坏死、脂肪变及肝纤维化程度明显改善(P < 0.05或P < 0.01)。RT-PCR检测结果显示，细胞移植组大鼠肝组织表达人源性细胞角蛋白18和白蛋白 mRNA，可见人脐血间充质干细胞移植可在一定程度上改善肝硬化大鼠的肝功能及病理损伤，其机制可能与移植细胞在肝硬化大鼠肝内归巢定植并向肝样细胞分化有关。吕素莉等^[25]采用CCl₄腹腔注射构建SD大鼠肝纤维化模型，以绿色荧光蛋白标记的正常SD大鼠骨髓间充质干细胞为细胞来源，于造模后第10周经尾静脉植入模型鼠体内，病理检测肝纤维化程度减轻，血清学指标好转，有效改善肝脏功能。

本研究拟探讨不同来源的间质干细胞应用于大鼠肝纤维化模型的治疗效果。研究结果显示模型对照组大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性及肝组织Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量明显高于正常对照大鼠，血清白蛋白的水平明显低于正常大鼠，提示模型组大鼠的肝脏功能的损伤，肝损伤模型制备成功，骨髓干细胞移植组大鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的值明显高于模型对照组大鼠，白蛋白明显低于模型对照组大鼠，肝组织Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量明显高于模型对照组大鼠，提示骨髓间质干细胞能进一步加重肝脏功能的损伤，加重纤维化；脐血间质干细胞组和脐带间质干细胞组大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的值较模型对照组明显下降，白蛋白的水平较模型对照组明显升高，肝组织的Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量明显低于模型对照组大鼠，提示脐带干细胞和脐血干细胞移植能减轻肝纤维化，脐带间充质干细胞组大鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶的值较脐血间质干细胞组大鼠降低明显，白蛋白的水平较脐血间质干细胞组升高明显，肝组织的Ⅰ型胶原、胶质纤维酸性蛋白的相对表达量较脐血间质干细胞组降低明显(P < 0.05)，提示脐带间质干细胞对于肝纤维化的治疗效果明显优于脐血间质干细胞。

肝纤维化的发生，是肝脏内损伤与修复失衡的结果。有资料表明，在肝细胞严重受损的情况下，肝卵圆细胞成为肝细胞再生的主要来源，而肝卵圆细胞与造血干细胞具有某些相同的表面标记，有可能起源于造血干细胞。那么，同样来自骨髓的间充质干细胞很有可能参与卵圆细胞的再生，从而维持正常肝细胞的数目，稳定病损结构。随着干预时间的延长，具有强大再生功能的骨髓间充质干细胞很可能成为补充肝细胞的主要来源。研究认为，骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用，在纤维化的发生中肝细胞损伤引起免疫细胞分泌细胞因子，从而激活星状细胞。很多研究报道骨髓间质干细胞可以分化为肝细胞，其可在很多的生长因子的作用下，分化成有功能的肝细胞，并且合成白蛋白、尿素、储存糖原等^[2⁶^-³³^]，但是也有研究发现将其注入到肝硬化模型大鼠体内，可以修复肝损伤，但是更多的研究显示通过不同的途径抑制骨髓间质干细胞至肝纤维化模型大鼠体内，可以加重肝纤维化，可能的原因是骨髓间质干细胞中只有极少数的细胞分化为肝细胞，大部分细胞分化为肝星状细胞和肌成纤维细胞，从而加重肝的纤维化进程，与本研究结果一致^[³³^-3⁷^]。

脐血干细胞是来源于脐血的干细胞，国内外对于其研究还不是很多，然后已有研究表明其在肝损伤中的应用价值，有研究表明将其应用于肝硬化的治疗中，成功的修复了肝损伤，改善肝功能，提高患者的生活质量^[3⁷^-⁴²^]。脐带中富含造血、间充质、神经及内皮等多种干/祖细胞，体外可以分化为脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、神经元/神经胶质前体细胞、多巴胺能神经元、内皮细胞，还能分化为肝细胞，国内外的很多报道显示脐带间质干细胞在肝损伤的治疗具有重要作用，能显著修复肝功能，提高患者的生存时间^[⁴³^-4⁵^]。

不同来源的间质干细胞对于肝纤维化的治疗效果不同，本研究分析了这种差别，显示脐带间质干细胞在肝纤维化的治疗中具有独特的优势，可以做进一步研究，为肝损伤的临床治疗提供新的依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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