难治性癫痫模型大鼠脑组织中srGAP2分子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.013

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (7): 1207-1211.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.07.013

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难治性癫痫模型大鼠脑组织中srGAP2分子的表达

刘锦¹，徐忠¹，庞爱兰¹，孟步亮²，王学峰³，任惠¹

1 昆明医科大学第一附属医院神经内科，云南省昆明市 650032
2 昆明医科大学人体解剖学与组织胚胎学系，云南省昆明市 650500
3 重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆市 630014

收稿日期:2012-06-06 修回日期:2012-07-16 出版日期:2013-02-12 发布日期:2013-02-12
通讯作者: 庞爱兰，硕士，讲师，昆明医科大学第一附属医院神经内科，云南省昆明市 650032 pms1979@126.com 并列通讯作者：孟步亮，博士，副教授，昆明医科大学人体解剖学与组织胚胎学系，云南省昆明市 650500 mbloso@126.com
作者简介:刘锦★，女，1983年生，山西省太原市人，汉族，2011年昆明医学院毕业，硕士，医师，主要从事神经病学研究。 liujin.512@163.com

Abnormal expression of srGAP2 in the brain of rats with refractory epilepsy

Liu Jin¹, Xu Zhong¹, Pang Ai-lan¹, Meng Bu-liang², Wang Xue-feng³, Ren Hui¹

1 Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
2 Department of Human Anatomy Histology and Embryology, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
3 Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 630014, China

Received:2012-06-06 Revised:2012-07-16 Online:2013-02-12 Published:2013-02-12
Contact: Pang Ai-lan, Master, Lecturer, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China pms1979@126.com Meng Bu-liang, Doctor, Associate professor, Department of Human Anatomy Histology and Embryology, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China mbloso@126.com
About author:Liu Jin★, Master, Physician, Department of Neurology, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China liujin.512@163.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：众多研究结果显示srGAP2分子在突起生长和突触可塑性起到关键的作用，但具体机制不明。
目的：检测srGAP2在致痫大鼠模型中的表达，探讨srGAP2与难治性癫痫发病机制的相关性。
方法：选取雄性SD大鼠56只随机分为7组，其中随机选取6组建立癫痫模型，构成实验组，剩余1组作为对照组。分别选取癫痫发作后的6 h、1 d、1周、2周、1个月、2个月等6个时间点的颞叶脑组织作为研究对象，并与对照组进行比较。利用免疫组织化学、免疫荧光以及免疫印迹3种方法检测srGAP2在致痫动物模型以及对照组的脑组织中的表达及变化规律。
结果与结论：实验组中srGAP2除在皮质区表达增高外，还在海马区高表达，与对照组相比各时间点srGAP2在颞叶癫痫动物组中的表达含量逐渐升高，且在2周左右达高峰并维持，到2个月左右降至接近对照组水平。结果提示srGAP2可能通过促进苔藓纤维出芽，进而导致脑组织中异常神经网络的建立，并最终在难治性癫痫的发生发展中起到重要作用。

关键词: 组织构建, 组织构建实验造模, 难治性癫痫, srGAP2, 苔藓纤维出芽, 癫痫模型, 脑组织, 细胞生物学, 分子生物学, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Many studies show srGAP2 molecules play a key role in neurite outgrowth and synaptic plasticity, but the exact mechanism is unknown.
OBJECTIVE: To study the possible correlation between srGAP2 expression and epilepsy pathogenesis, through testing the expression of srGAP2 in epileptic rats.
METHODS: Fifty-six Sprague-Dawley male rats were divided randomly into seven groups, including six groups with epilepsy induced by lithium-pilocarpine management and one control group. The samples of temporal lobe tissue were taken from rats at 6 hours, 1 day, 1 week, 2 weeks, 1 month, and 2 months after seizures, and from controls group. Using immunohistochemistry, immunefluorescence, and western-blot methods, we tested the expression of srGAP2 in experimental animals and control groups.
RESULTS AND CONCLUSION: Western blotting of rat brain tissue showed that srGAP2 was up-regulated in the cortex and hippocampus of the epileptic rats as compared with the control rats. The maximal expression was seen at about 2 weeks, and relatively high expression maintained until 1 month. The expression then returned down, and approached normal levels at 2 months. These results were consistent with the immunohistochemical and immunofluorescence results. These data implicate srGAP2 may promote mossy fiber sprouting, and participate in the abnormal development of synapses. The result suggests that this protein may play an important role in the pathogenesis of intractable epilepsy.

Key words: tissue construction, experimental modeling in tissue construction, refractory epilepsy, srGAP2, mossy fiber sprouting, epilepsy models, brain tissue, cellular biology, molecular biology, tissue construction photographs-containing paper

中图分类号:

R318

刘锦，徐忠，庞爱兰，孟步亮，王学峰，任惠. 难治性癫痫模型大鼠脑组织中srGAP2分子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(7): 1207-1211.

Liu Jin, Xu Zhong, Pang Ai-lan, Meng Bu-liang, Wang Xue-feng, Ren Hui. Abnormal expression of srGAP2 in the brain of rats with refractory epilepsy[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(7): 1207-1211.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 实验选用大鼠56只，分为7组，实验组48只，成功入组癫痫模型的动物有45只，死亡动物3只，动物总死亡率为6%，1只没有致痫成功。

2.2 动物癫痫模型制作结果 经腹腔注射氯化锂-匹罗卡品10-50 min后，实验组中大鼠开始出现癫痫发作。当持续痫性发作达1 h时，给予地西泮10 mg/kg腹腔注射以终止发作。通过行为学观察，可见典型的自发性癫痫发作，并依照Racine分级标准，在实验组中除了6 h和1个月组中各有1只大鼠死亡，2个月组中有1只大鼠没有致痫成功外，其余45只大鼠均有自发性发作，成功入组癫痫模型实验组。癫痫持续状态后，大鼠依次经历了急性期(6 h，1 d)，静止期(1，2周)和慢性期(1，2个月)即自发性癫痫形成期。对照组行为学观察未出现癫痫自发性发作。

2.3 免疫组织化学实验结果 显微镜下观察，在对照组中srGAP2的免疫阳性表达量很少，且主要表达在皮质神经元的细胞浆和细胞膜；srGAP2在实验组中的免疫阳性表达在皮质增多，并且在海马及其周边皮质出现高表达，见图1。

通过计算各组中srGAP2的阳性表达细胞数/1 000个细胞的比值，得出结果：在急性期，自6 h起细胞数就有所增高；当进入静止期(1，2周)时，表达量继续增加，并且表达在胞膜与胞浆中，在2周左右时表达量达到高峰并维持到1个月左右，到2个月时阳性细胞数下降至接近对照组水平。结果见表1。

2.4 免疫荧光实验结果 在癫痫大鼠脑皮质中，srGAP2免疫反应阳性细胞大量表达，并呈明亮的绿色荧光，神经元特异性烯醇化酶标记的神经元呈明亮的红色荧光，两者共表达呈现明亮的黄色荧光，见图2。扫描结果提示，大鼠模型中srGAP2也在神经元有特异性表达，并可观察到在实验组中srGAP2在海马区高表达，见图3。

2.5 蛋白免疫印迹实验结果 免疫印迹与免疫组织化学的检测结果基本相符。免疫印迹的结果显示约在 121 000位置出现黑色阳性杂交条带，见图4。在对癫痫动物模型的各时间点A比值进行比较后提示，与对照组相比，srGAP2在急性期较对照组稍有增高，进入静止期继续升高，并在2周左右达高峰，并维持进入慢性期，在2个月左右回降至接近对照组水平。

参考文献

[1] Ribak CE, Seress L, Weber P, et al. Alumina gel injections into the temporal lobe of rhesus monkeys cause complex partial seizures and morphological changes found in human temporal lobe epilepsy. J Comp Neurol. 1998;401(2): 266-290.

[2] Nadler JV, Okazaki MM, Gruenthal M, et al. Kainic acid seizures and neuronal cell death: insights from studies of selective lesions and Drugs. Adv Exp Med Biol. 1986;203: 673-686.

[3] Post RM, Weiss SR. Convergences in course of illness and treatments of the epilepsies and recurrent affective disorders. Clin EEG Neurosci.2004;35(1):14-24.

[4] Zhu SQ, Yang JJ,Du J,et al.Zhongguo Kangfu.2004;19(1): 6-8 朱遂强, 杨嘉君,杜鹃, 等.戊四氮点燃过程中大鼠海马纤维发芽变化的研究[J]. 中国康复,2004,19(1):6-8.

[5] Lynch M, Sutula T. Recurrent excitatory connectivity in the dentate gyrus of kindled and kainic acid-treated rats. J Neurophysiol. 2000;83(2): 693-704.

[6] Soderling SH,Guire ES ,Kaech S, et al. A WAVE-1 and WRP signaling complex regulates spine density,synaptic plasticity,and memory. J Neurosci.2007; 27(2):355-365.

[7] Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation Ⅱ.Motor seizure .Eletroencephalogr Clin Neurophysiol. 1972;32(3):281-294.

[8] Sabrice Guerrier,Jaeda Coutinho-Budd,Takayuki Sassa.ETAL. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis.Cell. 2009;138(5): 990-1004.

[9] Saitsu H, Osaka H, Sugiyama S, et al. Early infantile epileptic encephalopathy associated with the disrupted gene encoding Slit-Robo Rho GTPase activating protein 2 (SRGAP2). American Journal of Medical Genetics Part.2011;158A(1): 199-205.

[10] Ayala R, Shu T, Tsai LH. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell.2007;128:29-43.

[11] Bacon C, Endris V, Rappold G.Dynamic expression of the Slit-Robo GTPase activating protein genes during development of the murine nervous system. J Comp Neurol. 2009;513:224-236.

[12] Frost A, Perera R, Roux A, et al. Structural basis of membrane invagination by F-BAR domains. Cell.2008;132: 807-817.

[13] Frost A,Unger VM,De Camilli P.The BAR domain superfamily: membrane-molding macromolecules.Cell.2009;137:191-196.

[14] Saarikangas J, Zhao H, Pykalainen A, et al. Molecular mechanisms of membrane deformation by I-BAR domain proteins. Curr Biol.2009;19:95-107.

[15] Scita G, Confalonieri S, Lappalainen P, et al.IRSp53: crossing the road of membrane and actin dynamics in the formation of membrane protrusions. Trends Cell Biol.2008;18:52-60.

[16] Yao Q, Jin WL, Wang Y,et al.Regulated shuttling of Slit-Robo-GTPase activating proteins between nucleus and cytoplasm during brain development.Cell Mol Neurobiol 2008; 28:205-221.

引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：实验于2010年1月至2011年1月，在重庆医科大学第一附属医院重庆市(教委)神经病学重点实验室完成，实验室生物安全防护水平为P3等级。
材料：
实验动物：选取6-8周龄的雄性SD大鼠56只，清洁级体质量180-240 g。重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(渝)20100001。
实验方法：
动物分组：将56只动物分为对照组和实验组，对照组8只，实验组48只。将实验组动物随机分成6组(每组8只)，分别对癫痫发作后的6 h，1 d，1周，2周，1个月，2个月等6个时间点进行检测，其中6 h，1 d代表急性期，1周、2周代表静止期，1个月、2个月代表慢性期。
大鼠癫痫模型建立：实验组：给予SD大鼠腹腔注射氯化锂溶液127 mg/kg，18-22 h后再给予腹腔注射硫酸阿托品注射液1 mg/kg，30 min后再次给予腹腔注射毛果芸香碱溶液 30 mg/kg。在给药后观察大鼠行为学表现，当大鼠出现Racine分级标准IV-V级表现后，确定为癫痫持续状态开始时间。当大鼠抽搐致濒危或持续痫性发作达1 h时，给予地西泮10 mg/kg腹腔注射以终止发作，降低死亡率。对被点燃的癫痫动物行为学观察的依据标准是1972年Racine分级标准^[7]，实验将达到Racine分级Ⅳ-Ⅴ级模型大鼠纳入实验组。
对照组：在与实验组相对应的处理过程中，除了给予8只对照组大鼠硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射外，氯化锂及毛果芸香碱均用生理盐水代替注射。同样在注射后也观察其行为学表现。同样将动物饲养于正常的昼夜环境中，给予标准饲料喂养及饮水。
标本处理：在动物模型成功建立后的各个时间点，实验组各取4只大鼠及对照组取4只大鼠，将其麻醉取颞叶脑组织，进行蛋白免疫印迹实验检测。其余动物以多聚甲醛灌注取颞叶脑组织，石蜡包埋，进行免疫组织化学和免疫荧光检测。
免疫组织化学方法：
实验步骤：将癫痫动物模型中实验组和对照组免疫组织化学实验的脑组织经固定、包埋、切片，随机在每例标本中抽取2张，一张用来苏木精-伊红染色，解剖定位；另一张用作免疫组织化学染色。
免疫荧光：将烘烤后的动物脑组织切片二甲苯脱蜡，常规乙醇脱二甲苯，用PBS冲洗，滴加0.4% TritonX-100水浴温箱孵育，然后0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)抗原修复，用PBS冲洗，滴加正常兔血清封闭液孵育，加入羊抗srGAP2多克隆抗体与小鼠抗神经元特异性烯醇化酶抗体混合液过夜，复温后PBS，滴加荧光抗体混合液：FITC标记的兔抗山羊IgG和TRITC标记的牛抗小鼠IgG，避光条件下操作，并37 ℃水浴4 h，PBS冲洗，封固。
蛋白免疫印迹实验：常规脑组织蛋白样品制备，BCA法蛋白含量的测定，上样蛋白制备，点杂交实验，SDS-PAGE电泳，电转(目的蛋白转膜2 h，染色)，封闭(37 ℃温箱1 h)，一抗孵育(羊抗srGAP2多克隆抗体按1：100配比，小鼠β-actin单克隆抗体按1∶1 000配比)，二抗孵育(兔抗山羊辣根过氧化物酶按1∶5 000比例稀释，山羊抗小鼠辣根过氧化物酶也按1∶5 000比例稀释)，显色，凝胶图像采集及分析。将正常大鼠对照组与各不同时间点的癫痫大鼠模型的Western blot结果，运用Quantity one软件进行分析，得出每个条带的A值，并分别与β-actin的A值相比，所得数值取平均值用直方图表示出来。
主要观察指标：①免疫反应产物的分布、表达强度、srGAP2阳性细胞的计数。②srGAP2在实验组与对照组中的表达变化。
统计学分析：实验数据均采用x(_)±s表示，组间均数比较采用t 检验，P > 0.05为差异无显著性意义，P < 0.05为差异有显著性意义。组间样本均数之间的差异用单因素方差分析及t 检验进行比较分析。运用SPSS 11.5软件包对数据进行统计分析。图表制作使用Excel7.0。

讨论

免疫组织化学染色及双标免疫荧光检测的实验结果显示，正常对照组大鼠模型颞叶脑组织中，srGAP2少量表达在皮质，并且主要表达在神经细胞的胞膜及胞浆部分。这与Guerrier等^[8]对srGAP2的表达研究结果相符。氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型颞叶脑组织中srGAP2的阳性细胞表达比对照组有明显增加，提示其可能参与了癫痫的发生发展过程，Saitsu等^[9]在1例West综合症的婴儿中，也得出类似的结论。

氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型中的海马组织和颞叶新皮质中均看到有大量的srGAP2阳性细胞表达。这与苔藓纤维出芽现象的发生情况相一致，提示srGAP2可能通过影响苔藓纤维出芽，进一步参与到癫痫的发生发展中；并且在海马及皮质均有表达升高现象也提示，srGAP2可能与海马和皮质的可塑性都相关，可以在多部位影响突触重组。在氯化锂-匹罗卡品致痫大鼠模型的海马组织中出现有大量的srGAP2的阳性表达，并且在海马邻近皮质处的表达量也较对照组高，其阳性细胞表达量在发作后6 h就已经开始增高，约在2周时达到高峰，并持续到1个月，随后在2个月左右其阳性表达量明显下降，并接近对照组水平。通过免疫印迹技术对癫痫动物模型的研究显示：在急性期srGAP2的表达量即稍有增高，从静止期开始srGAP2的表达量明显升高，在2周时间点处达高峰，并维持至进入慢性期，在2个月左右时下降至接近对照组水平，该实验结果同免疫组织化学及免疫荧光结果相符。另外在以往的研究中发现，体外培养的皮层神经元中，通过RNA干扰敲减srGAP2的表达量，可观察到轴突和树突分支数明显下降。srGAP2的研究进一步指出，F-BAR结构域对丝状伪足的诱导作用，参与影响突起的分支及轴突的再生^{[8, 10-16]}。另外，在srGAP2中的另一个结构域SH3可部分的参与到F-BAR结构域所介导的丝状伪足形成过程中来。综合srGAP2的表达情况及其功能，推测：srGAP2可能通过诱导丝状伪足的形成，调解突触的生长，促进苔藓纤维出芽，又同其他癫痫病灶内环境中的其他导向因子共同作用，限制了正确的神经联系的建立，导致异常的神经网络形成，最终成为促进癫痫发生发展的因素之一，并与其他因素共同配合，相互作用，导致癫痫反复的自发性发作，加重癫痫病情。

作者贡献：课题设计为第五、六作者，实施为第一、三作者，癫痫动物模型的评估者为第二作者，撰写论文为第四作者，盲法评估
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验已获得重庆医科大学伦理委员会批注。实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

难治性癫痫模型大鼠脑组织中srGAP2分子的表达

Abnormal expression of srGAP2 in the brain of rats with refractory epilepsy

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[1]	许国峰, 李学斌, 唐一钒, 赵寅, 周盛源, 陈雄生, 贾连顺. 人黄韧带细胞骨化发生过程中的自噬[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1174-1181.
[2]	周玉, 龙小安, 李宁, 王纯. 有限元法分析髌腱炎状态时的生物力学变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1280-1286.
[3]	宋旭东, 何云武, 李勇霖, 陈静, 胡君兰. 超声引导下椎旁神经阻滞治疗带状疱疹相关疼痛的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(11): 1797-1804.
[4]	庞巨涛，张新虎，孙建华，周连军，刘斌，李凤国，李文哲. 经皮球囊扩张椎体后凸成形后椎体再骨折的危险：回顾性多因素分析[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(8): 1182-1187.
[5]	曹曦，崔伟，陈跃平，冯洋，路通. 尼尔样1型生长因子促进修复骨再生和治疗骨质疏松的应用潜力[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(8): 1235-1240.
[6]	宋超，田鑫，刘琳，徐雅雯，孟圆，李晓丽，彭萌，李华东，王志涛，戈莎. 骨密度测试联合老年人运动功能量表-25评估筛查老年人基础运动障碍及跌倒风险：天津市6个社区1 458例调查[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 990-995.
[7]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔，李鹏，刁兆峰，木合塔尔•霍加. 幼兔颅盖骨成骨细胞的分离培养及鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 996-1000.
[8]	武敏1，李雪1，高洁1，杨帅1，蔡毅志2，王明国1 . 下颌持续前导对成年及幼年期大鼠髁突软骨血管内皮生长因子表达和Micro-CT下髁突骨质变化的差异[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1001-1006.
[9]	王灿莉，焦志立，孙勇，孙嵩. 两种富血小板纤维蛋白对人牙龈成纤维细胞增殖活性影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1007-1012.
[10]	周艳星，彭新生，侯敢，李江滨，张华，周志昆，周艳芳. 辣椒素抑制成纤维细胞增殖的作用及其分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1018-1022.
[11]	赵彩萍，朱美玲，王婷婷，柳雪蕾，刘翠玲. 化学神经根炎症模型大鼠的制备及评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1030-1034.
[12]	韩杰，陈跃平，莫坚，王大伟，苏波，李书振，夏天，王世鑫 . 三七总皂苷干预激素性股骨头缺血坏死模型兔的超微结构评价[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1035-1039.
[13]	黄红，黄佳纯，黄宏兴，王吉利，刘少津，汪悦东 . 过表达雌激素相关受体α干预沉默Bak1、Bcl2重组腺病毒载体转染MG63细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1041-1045.
[14]	彭显江，刘勃志，段海峰，杨谦梓，胡胜 . 小尾寒羊主动脉瓣及二尖瓣置换过程中的麻醉管理[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1052-1056.
[15]	杨淳贺，仉红，董明，王丽娜，牛卫东. 野生型小鼠慢性根尖周炎模型PLCγ2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1057-1062.