野生型小鼠慢性根尖周炎模型PLCγ2的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1023

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
PLCγ2：全称Phospholipase Cγ2，是一种磷脂酶，参与了生物体的许多生理病理过程，包括细胞增殖和分化、调节细胞骨架、细胞凋亡、肿瘤的迁移，同时其在免疫细胞和破骨细胞的形成过程中也发挥了不同的作用。PLCγ2通过一系列反应激活钙离子(Ca2+)信号通路，调节破骨细胞的生成。
慢性根尖周炎：是由多种细菌及毒力因子入侵根尖周组织，引起根尖组织炎症性反应，以根尖区的牙槽骨吸收为主要特征的一类疾病，是多种细胞因子共同参与的结果。

摘要
背景：研究表明，抑制BTK-PLCγ2- Ca2+信号通路，破骨细胞的形成和功能受到抑制，说明PLCγ2参与了破骨细胞的形成和分化。
目的：通过建立野生型小鼠慢性根尖周炎模型，观察PLCγ2在小鼠实验性根尖周炎组织中的表达。
方法：选用20只C57BL/6L野生型雄性小鼠，随机选取16只为实验组行双侧下颌第1磨牙开髓术，并将开髓后的髓腔暴露于口腔环境，诱导形成根尖周炎病损。分别于开髓后1，2，3和4周各随机处死4只小鼠，分离下颌骨。剩余4只不开髓作为空白对照，0周时处死后分离下颌骨。制作冰冻切片后用苏木精-伊红染色方法观察小鼠根尖组织炎症情况，免疫组织化学染色检测PLCγ2的表达与分布情况，酶组织化学染色检测根尖组织炎症区域破骨细胞的表达。
结果与结论：①苏木精-伊红染色结果：对照组小鼠下颌第1磨牙牙周组织几乎无炎性细胞浸润；实验组1-4周，下颌第1磨牙牙周组织炎性细胞浸润范围越来越大，牙槽骨破坏也逐渐增多，说明成功建立了小鼠根尖周炎模型；②免疫组织化学染色结果：发现PLCγ2在小鼠根尖周炎的0-4周都有表达；对照组根尖周组织中仅有少量PLCγ2的表达；实验组1-4周PLCγ2阳性表达随炎症细胞浸润范围的逐渐扩大而增长(P < 0.05)；③TRAP染色结果：对照组根尖牙周组织中几乎不能观察到破骨细胞；实验组1周，可观察到少量的多核破骨细胞；实验组2周，破骨细胞的数量持续增多；实验组3周达到峰值；实验组4周破骨细胞数量逐渐减少；与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)；④相关性分析：TRAP阳性细胞计数值和PLCγ2阳性细胞计数之间有显著相关性(r=0.627，P < 0.001)；⑤结果说明，PLCγ2在小鼠根尖周组织中有表达，提示其可能与根尖周炎症反应和骨吸收作用相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-8786-7656(杨淳贺)

关键词: PLCγ2, 尖周炎, 小鼠慢性根尖周炎模型, 破骨细胞, 组织构建

Abstract:

BACKGROUND: Inhibiting BTK-PLCγ2-Ca2+ signaling pathway has been shown to inhibit formation and function of osteoclasts, suggesting that PLCγ2 participates in cell formation and differentiation.
OBJECTIVE: To study the expression of PLCγ2 in periapical tissues by establishing a model of periapical periodontitis in wild-type mice.
METHODS: Twenty male wild-type C57BL/6L mice were selected. Bilateral mandibular first molar pulp cavities of 16 mice were exposed to the oral environment and the formation of apical periodontitis was induced (experimental group). The mice were randomly sacrificed at 1, 2, 3 and 4 weeks and the lower jaws were isolated. The remaining four mice were used as blank control group, and were sacrificed at 0 week to isolate the lower jaws. After being histologically processed, they were hematoxylin-eosin stained to observe the inflammation conditions in the apical area. Expression and distribution of PLCγ2 were analyzed by immunohistochemical staining. Enzyme-histochemical staining was used to detect the expression of osteoclasts in apical inflammatory tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: According to the histological examination, there was almost no inflammatory cell infiltration in the periodontal tissue of the mandibular first molar in the blank control group. In the experimental group, at 1 to 4 weeks after operation, the infiltration of inflammatory cells in the periodontal tissues and the destruction of alveolar bone of mandibular first molar increased gradually, indicating that the mouse periapical periodontitis model was established successfully. Immunohistochemical analysis found that the expression of PLCγ2 was detected at 0 to 4 weeks after periapical periodontitis in mice. A small amount of PLCγ2 expressed in normal dental apical tissues. PLCγ2 in the experimental group was mainly expressed in the nucleus of lymphocytes, plasma cells and other cells, and there was a small amount of expression in the cell membrane and cytoplasm. At the1st, 2nd, 3rd, 4th weeks, the positive expression of PLCγ2 also increased due to the gradual expansion of inflammatory cell infiltration. The positive cell counts were all significantly different (P < 0.05). The results of TRAP staining showed that almost no osteoclasts were observed in periapical periodontal tissues of blank control group. In the experimental group, at 1 week after operation, a small amount of multinucleated osteoclasts were observed. The number of osteoclasts continued to increase at 2 weeks after operation. At 3 weeks, the number of osteoclasts reached the peak. At 4 weeks postoperatively, a decrease in the number of osteoclasts was observed. The difference was significant between experimental and control groups (P < 0.05). Correlation analysis between TRAP positive cell count and PLCγ2 positive cell count showed a significant correlation (r=0.627, P < 0.001). These results indicate that PLCγ2 is expressed in periapical tissues of mice, implying that it may be related to periapical inflammatory reaction and bone resorption.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Phospholipase C gamma, Periapical Periodontitis, Osteoclasts, Tissue Engineering

中图分类号:

R466
R318

杨淳贺，仉红，董明，王丽娜，牛卫东. 野生型小鼠慢性根尖周炎模型PLCγ2的表达[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1057-1062.

Yang Chunhe, Zhang Hong, Dong Ming, Wang Lina, Niu Weidong. Expression of PLCgamma2 in a wild-type mouse model of chronic periapical periodontitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(7): 1057-1062.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析实验选用小鼠20只，分为5组，实验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 苏木精-伊红染色结果见图1所示，正常对照组(0 周)根尖周组织的牙周膜纤维未发生明显改变，偶有极少量炎性细胞浸润，未发现牙周膜的增宽；实验组1周可见根尖周组织出现小范围的炎性细胞浸润，牙周膜少量增宽，此时可见少量中性粒细胞；实验组2周，炎性细胞浸润范围逐渐增大，主要以中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞为主，开始出现牙槽骨的吸收；实验组3，4周，炎性细胞浸润进一步加重，多以淋巴细胞为主，同时伴有毛细血管和成纤维细胞的出现，牙槽骨吸收范围继续扩大。

2.3 免疫组织化学染色结果 PLCγ2的阳性细胞通过免疫组织化学反应染成深褐色，在实验性小鼠的根尖周炎的0-4周都有表达，并随着炎症细胞浸润范围和牙槽骨吸收范围的增大而增多，见图2。

正常对照组根尖周组织中仅有少量PLCγ2的阳性表达。实验组1-4周，小鼠根尖周的炎症区域的中央和周边都可以可见到PLCγ2阳性表达，主要位于淋巴细胞、浆细胞等细胞的细胞核中，细胞膜和细胞质中也有少量表达。实验组2，3，4周时由于炎症细胞浸润范围的逐渐扩大，PLCγ2阳性表达也随之增长，阳性细胞计数差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图3，与此同时可见根尖骨破坏血管周围及根分叉区域的PLCγ2阳性表达也有所增多。

2.4 酶组织化学染色结果小鼠根尖周组织病变发展过程中TRAP染色结果见图4，正常对照组根尖牙周组织中几乎不能观察破骨细胞。

实验组1周，根尖周可见牙槽骨吸收部位附近可观察到少量的多核破骨细胞，经TRAP染色后的破骨细胞胞浆呈酒红色，胞核呈蓝色，分布于骨小梁附近的骨吸收陷窝中；实验组2周，破骨细胞的数量持续增多；实验组3周达到峰值；实验组4周时，可以观察到破骨细胞开始减少，与对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.5 PLCγ2及破骨细胞数的相关性分析结果 TRAP阳性细胞计数值和PLCγ2阳性细胞计数之间相关性分析结果显示有显著相关性(r=0.627，P < 0.001)，见图6。

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引言

慢性根尖周炎是由多种细菌及毒力因子入侵根尖周组织，引起根尖组织炎症性反应，以根尖区的牙槽骨吸收为主要特征的一类疾病，是多种细胞因子共同参与的结果^[1-2]。

PLC(phospholipase C)是一种磷脂酶，在生物体的许多生理病理过程中发挥重要作用，包括细胞增殖和分化、调节细胞骨架、细胞凋亡、肿瘤的迁移等，近年的研究发现其在免疫细胞和破骨细胞的形成过程中也发挥了不同的作用。PLC在各类细胞之中都有发现，例如少突胶质细胞、星形胶质细胞、颗粒细胞、造血系细胞、免疫细胞等^[3]。许多细胞外因子，例如内皮细胞生长因子、细胞表面抗原、免疫球蛋白等都可通过PLC调控细胞的生命活动。PLC可分为6大类，其中每一类又有不同的亚型，分别为PLCβ1-4、PLCγ1-2、PLCδ1-5、PLCε、PLCζ、PLCη1-2。PLCγ2是PLCγ的一个亚型，活化后的PLCγ2 通过水解PIP2，生成第二信使IP3和DAG，从而将细胞外信息传递给细胞内的下游效应分子，调节细胞的各项生命活动^[4-6]。

当下调PLCγ2-Ca²⁺-NFATc1信号传导时发现破骨细胞分化被抑制，小鼠的骨质流失也同时被抑制^[7]。RANKL通过与破骨前体细胞受体RANK结合介导破骨细胞生成，RANKL-RANK信号通路中通过激活PLCγ从而激活Ca²⁺信号，Ca²⁺水平增加可诱导NFATc1去磷酸化和NFATc1转移至细胞核内。NFATc1通过与破骨细胞分化或功能的重要基因如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和破骨细胞相关受体(OSCAR)的启动子区域中的NFAT结合位点结合来诱导靶基因表达^[8-10]。通过实验靶向抑制PLCγ2衔接子功能可阻断破骨细胞生成并防止病理性骨质溶解^[11]。有学者通过抑制BTK-PLCγ2-Ca²⁺信号通路后发现破骨细胞的形成和功能受到抑制^[12]，说明PLCγ2参与了破骨细胞的形成和分化。

鉴于此，实验通过建立小鼠根尖周炎动物模型，假设PLCγ2参与了根尖周病变中的炎症反应与牙槽骨的吸收，应用苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色法以及酶组织化学染色检测在小鼠实验性慢性根尖周炎中PLCγ2的表达情况以及其与破骨细胞的相关性，初步探讨其与慢性根尖周炎症发生发展的关系。

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材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年至2017年在大连医科大学口腔医学院240实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物经大连医科大学动物实验中心伦理委员会批准，选取SPF级6周龄c57BL/6L雄性小鼠20只，体质量18-22 g。

1.3.2 主要实验试剂和仪器 EDTA(BBI Life Sciences，上海)；Mayer苏木素及伊红染色液(Solarbio，北京)；Triton X-100(生工，上海)；PLCγ2多克隆抗体(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；PV-9001试剂盒及DAB试剂盒(中杉金桥，北京)；包埋剂(Tissue-Tek O.C.T.Compound) (SAKURA，USA)；破骨细胞TRAP染色试剂盒(Sigma-Aldrich，美国)；标准型圆周摇床SK-L180-E (Scilogex，美国)；冰冻切片机(Thermo，美国)；Olympus光学显微镜CX-41及显微照相系统BX-43(Olympus，日本)；超纯水系统(Thermo Scientific，美国)；恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立小鼠慢性根尖周炎病损模型随机选取16只小鼠为实验组，将体积分数4%水合氯醛(0.01 mL/g)腹腔注射后麻醉，行双侧下颌第1磨牙远中窝开髓，开髓后用8#K锉探查开髓口，将开髓口暴露于口腔环境中即可，术中时刻关注小鼠状况。其余4只小鼠不做任何处理作为空白对照。

1.4.2 制备冰冻切片分别于开髓后0，1，2，3和4周各随机选取4只小鼠， 4%水合氯醛(0.01 mL/g)腹腔注射麻醉，再用40 g/L多聚甲醛溶液缓慢行心脏灌流，待四肢完全僵硬后，分离双侧下颌骨，去净其周边软组织后放入40 g/L多聚甲醛4 ℃固定24 h。组织放入含pH值7.2-7.4的10%EDTA溶液的EP管中，室温下置于摇床上脱钙，时长为四五周。脱钙成熟之后将组织放入OCT内包埋，再用冰冻切片机制作非连续的厚6 μm的切片，置于37 ℃恒温培养箱烘干。最后置于-80 ℃冰箱保存。

1.4.3 苏木精-伊红染色冰箱内取出冰冻切片于37 ℃恒温培养箱烘干1 h；0.02 mol/L PBS室温漂洗5 min，3次；苏木精染色5 min，大量流动水洗去苏木精染液；1%盐酸乙醇分化3-5 s；流水冲洗5 min后60 ℃温水反蓝；伊红染色 5 min，大量流动水冲洗；梯度乙醇脱水；二甲苯透明5 min，2次；性树胶封固；晾干片子后显微镜下观察并摄片。

1.4.4 免疫组织化学染色取出切片后放入37 ℃恒温培养箱烤片60 min；放入0.02 mol/L PBS的染缸中，放于摇床上漂洗3次，每次10 min；体积分数0.3%过氧化氢溶液固定15 min；PBS漂洗组织3次，每次5 min；一抗孵育：于组织块上滴放适量的兔抗小鼠PLCγ2多克隆抗体 (1∶100)置于湿盒内4 ℃过夜；BST缓冲液漂洗3次，每次5 min；滴加Ⅱ抗1液，室温孵育60 min；PBST缓冲液漂洗3次，每次5 min；滴加Ⅱ抗2液，室温孵育60 min；PBST缓冲液漂洗3次，每次5 min；DAB显色：显微镜下对发色结果进行实时观察，待观测到明显阳性信号时立即放入PBST缓冲液中停止发色；PBST缓冲液漂洗3次，每次 10 min；苏木精复染4.0-5.0 min，流水冲洗10 min，温水反蓝；梯度乙醇脱水；二甲苯透明3次，每次10 min；中性树胶封固；显微镜下观察并拍照。用PBS代替一抗，作为阴性对照组。用OLYMPUS(BX-43)光学显微镜镜下观察时以褐色颗粒染色视为阳性细胞，每张组织切片在400倍镜下随机截取下颌第1磨牙远中根根尖组织5个视野摄片，由2名不知实验分组者分别查验单位面积内PLCγ2的阳性细胞数，经协商统一后取每样本50个视野的均值作为该样本的阳性细胞数。每个组织随机选取3张非连续切片。

1.4.5 酶组织化学染色按照TRAP染色试剂盒说明书配置染色液；取2个染色缸，分别标记为A和B，染色缸内均加入下列混合物：45 mL的37 ℃去离子水，1 mL的氨偶氮苄混合溶液，0.5 mL的Naphthol AS-BI Phosphate，2 mL的Acetate。A烧杯中加入1 mL酒石酸盐溶液，B烧杯作为对照组不加酒石酸盐溶液；水洗后的冰冻切片，常温固定液30 s，用预热的37 ℃ 50 mL去离子水于摇床上彻底将固定液洗净；将切片分别置于A和B2个染色缸中，37 ℃水浴孵育60 min，避光；37 ℃去离子水将切片彻底冲洗干净，放入苏木精溶液中染细胞核2 min，自来水冲洗5 min后以水封固。酶组织化学实验结束后用OLYMPUS(BX-43) 光学显微镜观察并拍摄照片，在高倍镜(×400)下以下颌第1磨牙的根尖周病变区域(n=5)为计数对象，计数病变区域的破骨细胞数。每个组织随机选取3张非连续切片。

1.5 主要观察指标根尖区域炎症浸润范围；PLCγ2的阳性细胞表达为深褐色，PLCγ2表达细胞的种类，阳性表达量的趋势；根尖炎症区域内破骨细胞的表达量，根尖炎症区域破骨细胞表达量与PLCγ2表达量的相关性。

1.6 统计学分析采用SPSS 22.0软件对数据结果进行统计学分析，计量数据用x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。Pearson相关分析评价PLCγ2及TRAP阳性破骨细胞数间的相关性，检验标准为P < 0.001。

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讨论

根尖周炎症病变的发展是由根管中的细菌和根尖周围的细菌毒素的存在而引发的根尖区域的免疫反应，导致了根尖周围的牙槽骨遭的破坏，因此骨吸收是根尖周炎的特征之一，也是破骨细胞的独特功能。该实验采用将小鼠开髓后的髓腔暴露于口腔环境中，模拟人类慢性根尖周炎的感染过程，用苏木精-伊红染色的方法证明成功建立了小鼠根尖周炎动物模型^[13]。探索PLCγ2在小鼠根尖周炎中的表达情况。

慢性根尖周炎是临床上常见的一类疾病，偶尔可见不能治愈的病例最终选择拔牙，目前其病理机制仍未完全探索清楚。有学者为了评估PLCγ2在小鼠淋巴细胞生成中的重要作用，通过切除PLCγ2基因，发现小鼠成熟B细胞和腹膜B1细胞和的体外应答缺陷，证实了PLCγ2是BCR信号通路的关键组成部分，是促进B细胞发育所必需的^[14]。研究发现鼠的PLCγ2基因突变获得后，导致先天免疫细胞，自身免疫和炎症的扩增^[15]。PLCγ2在几种先天免疫细胞中也有表达，包括巨噬细胞，自然杀伤细胞，肥大细胞和中性粒细胞。先天性免疫细胞中Fc受体或整联蛋白的刺激诱导PLCγ2活化，导致磷酸肌醇水解和钙增加。PLCγ2也通过影响Toll样受体介导的信号传导来调节免疫炎症反应^[16]。由此可以说明PLCγ2参与了免疫炎症细胞的调节。

酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase，BTK)被认为与众多炎症相关疾病的发病机制密切相关，与骨破坏和炎症反应有着紧密的联系。有学者通过体外诱导细胞外信号调节激酶(ERK)和c-jun N-末端激酶(JNK)磷酸化的减少，导致RANKL依赖的早期Syk-Btk-PLCγ2-Ca²⁺信号传导、以及活化的T细胞核因子1(NFATc1)和c-Fos的活化受到抑制，导致各种靶基因的下调，从而抑制骨髓巨噬细胞(BMM)形成的破骨细胞以及成熟的破骨细胞[包括丝状肌动蛋白(F-肌动蛋白)环形成和骨基质分解]的活性。以往的研究发现，BTK在人类正常根尖周组织中仅有少量表达，而在慢性根尖周炎病损组织中的表达量显著增高^[17]，说明BTK参与了人类根尖周组织的炎症及骨吸收反应^[18]。然而BTK可以与PLCγ衔接子区的关键残基结合而激活PLCγ^[19]。由此可以推论PLCγ2很可能参与了破骨细胞的形成以及慢性根尖炎的骨吸收反应。

既然PLCγ2在炎症细胞和破骨细胞分化中都有参与，作者推测PLCγ2也可能参与了根尖周病变的发病机制。此次实验通过免疫组织化学染色证实PLCγ2的阳性细胞存在于根尖周炎的各个阶段，大多数PLCγ2阳性细胞为椭圆形、圆形，表达在深棕色染色的细胞核内。类似于单核炎症细胞如T和B细胞和浆细胞中有表达。在小鼠根尖周炎症发展的整个进程中PLCγ2阳性细胞的表达量程递增趋势，而破骨细胞的数量在3周达到高峰，从3周到4周逐渐减少。在炎症过程中，淋巴细胞的积累被认为是一种保护性的宿主反应。这种反应的目的是消灭入侵的微生物，防止细菌直接入侵根尖周围的骨组织^[20]。因此，可以推测PLCγ2在炎症早期阶段在淋巴细胞和破骨细胞分化中起作用，而在炎症后期阶段，其作用可能主要为调节淋巴细胞的分化和功能。

综上所述，该研究首次揭示了PLCγ2在小鼠正常根尖周组织和根尖周炎组织中的表达情况，发现与正常根尖周组织相比，PLCγ2在根尖周炎症组织中表达增高，这为研究人类慢性根尖炎的病因病理提供了新思路，也对临床上慢性根尖周炎的治疗、预防、恢复提供了新的依据。然而PLCγ2在人类慢性根尖周炎中表达情况及作用应进一步的研究探索；同时PLCγ的活化方式有很多种，那么在慢性根尖炎中BTK是否与PLCγ2结合从而促进破骨细胞形成还有待实验进一步的验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程