高脂饮食与线栓法制作慢性缺血模型鼠：方法的评估与比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1048

摘要/Abstract

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文题释义：
线栓法鼠模型：通过在大鼠股动脉中插入4-0 prolene线至膝关节附近，造成动脉管腔狭窄并产生异物反应,使管腔内逐渐产生内膜增生，逐渐造成下肢血流的减少以建立大鼠慢性后肢缺血模型。
缺血性疾病：缺血性疾病根据是否病变源自血管源性病变分为继发性及原发性缺血性疾病。原发性疾病主要是组织或器官的血管源性病变，如冠状动脉粥样硬化等导致的供血部位功能不全或坏死，继发性疾病则主要由于创伤、炎症等导致的血管离断、闭塞或受压迫所致的疾病。

摘要
背景：有研究使用线栓法建立慢性缺血动物模型，但其观察周期较长，实验动物经过手术及疾病的打击，生存期有可能会缩短。作者在此基础上加用高脂饮食因素，进一步确立可靠的慢性缺血动物模型。
目的：探讨高脂饮食大鼠线栓法建立慢性缺血动物模型的可行性。
方法：健康2周龄SD大鼠40只，体质量为50-70 g，由承德医学院动物实验中心提供。采用随机数字表法将大鼠分成实验组及对照组：实验组大鼠选用高脂饲料进行喂养，对照组大鼠选用普通饲料进行喂养，2组均采用线栓法建立大鼠后肢缺血模型。分别于大鼠模型建立成功后第1，2，4，6周进行肌力观察、激光多普勒血流仪检测后肢血流情况、苏木精-伊红染色观察腓肠肌组织和血管组织变化。
结果及结论：①实验组造模后1周大部分大鼠出现肌力异常表现，对照组大部分未出现(P < 0.05)；造模后2周及4周2组大鼠大部分均出现明显肌力异常表现，差异无显著性意义；造模后6周对照组肌力异常例数少于实验组；②激光多普勒血流检测及组织学检测均提示实验组较对照组要早出现缺血表现，且实验组缺血表现恢复程度较对照组要低；③结果说明，线栓法可有效制作慢性缺血大鼠模型，合并高脂饮食可较普通饮食早出现缺血表现，且高脂饮食可使慢性缺血状态持续时间更长。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-4713-9184(陈磊)

关键词: 线栓法, 高脂饮食, SD大鼠, 慢性缺血, 慢性后肢缺血模型

Abstract:

BACKGROUND: Some studies have prepared a chronic ischemic animal model using the thread embolism technique, but the observation period is longer, and the survival time of the experimental animals may be shortened because of surgical trauma and disease. Herein, the authors further established a reliable animal model of chronic ischemia using the thread embolism technique by addition of high-fat diet.
OBJECTIVE: To investigate the feasibility of establishing a reliable animal model of chronic ischemia in high-fat diet rats using the thread embolism method.
METHODS: Forty Sprague-Dawley rats, 2 weeks of age, weighing 50-70 g, were provided by the Animal Experimental Center of Chengde Medical University in China. The rats were randomly divided into two groups, and fed with high-fat diet (experimental group) and normal diet (control group), respectively. Chronic ischemia animal models were then established in the hind limbs of all the rats using the thread embolism technique. Muscle strength of the rats was detected at 1, 2, 4, and 6 weeks postoperatively. Meanwhile, blood flow changes in the hind limbs and histological changes of the gastrocnemius and vascular tissue were observed using laser Doppler and hematoxylin-eosin staining, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Most of the rats in the experimental group had abnormal muscle performance at 1 week postoperatively. Most of the rats in the control group had nothing-unusual (P < 0.05). Most of the rats in both groups appeared with abnormal muscle performance at 2 and 4 weeks postoperatively, and there was no significant difference between the two groups. At 6 weeks postoperatively, the number of rats with abnormal muscle performance was lower in the control group than the experimental group. (2) Laser Doppler flow examination and histological examination both showed that the experimental group had ischemic symptoms earlier than the control group, and worse recovery from ischemia was found in the experimental group compared to the control group. These findings indicate that the thread embolism method can effectively make a rat model of chronic ischemia, and the addition of high-fat diet can cause an ischemic appearance earlier than the addition of normal diet, indicating the high-fat diet can prolong the state of chronic ischemia.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Models, Animal, Ischemia, Laser-Doppler Flowmetry, Tissue Engineering

中图分类号:

R446
R318

陈磊，丁萌，张青云，高建国，郭风玲，杨植，张猛. 高脂饮食与线栓法制作慢性缺血模型鼠：方法的评估与比较[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(7): 1063-1067.

Chen Lei1, Ding Meng2, Zhang Qingyun1, Gao Jianguo1, Guo Fengling3, Yang Zhi1, Zhang Meng4 . Making chronic ischemia rat models by high-fat diet and thread embolism technique: evaluation and comparison of modeling methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(7): 1063-1067.

图/表（结果） 3

参考文献

[1] Jin X, Kim DK, Riew TR, et al. Cellular and Subcellular Localization of Endoplasmic Reticulum Chaperone GRP78 Following Transient Focal Cerebral Ischemia in Rats. Neurochem Res. 2018;43(7):1348-1362.

[2] Noiri E, Nakao A, Uchida K, et al. Oxidative and nitrosative stress in acute renal ischemia.Am J Physiol Renal Physiol. 2001;281(5):F948-957.

[3] Ye Z, Kong Q, Han J, et al. Circular RNAs are differentially expressed in liver ischemia/reperfusion injury model. J Cell Biochem. 2018 May 18.

[4] Meloux A, Rigal E, Rochette L, et al. P1742Experimental ischemic stroke in rats induce myocardial contractile dysfunction in vivo and ex vivo and increase cardiac vulnerability to ischemia-reperfusion injury ex vivo. Eur Heart J. 2017;38(suppl_1).

[5] Liu Q, Jin W N, Liu Y, et al. Brain ischemia suppresses immunity in the periphery and brain via different neurogenic innervations. Immunity.2017; 46(3):474-487.

[6] Brown JM, Grosso MA, Terada LS, et al. Endotoxin pretreatment increases endogenous myocardial catalase activity and decreases ischemia-reperfusion injury of isolated rat hearts. ProcNatlAcadSci U S A. 1989;86(7): 2516-2520.

[7] Spreen MI, Martens JM, Knippenberg B, et al. Long‐Term Follow‐up of the PADI Trial: Percutaneous Transluminal Angioplasty Versus Drug‐Eluting Stents for Infrapopliteal Lesions in Critical Limb Ischemia. J Am Heart Assoc. 2017; 6(4). pii: e004877.

[8] Lee DS, Jang MJ, Cheon GJ, et al. Comparison of the cost-effectiveness of stress myocardial SPECT and stress echocardiography in suspected coronary artery disease considering the prognostic value of false-negative results. J NuclCardiol. 2002;9(5):515-522.

[9] EkinciAkdemir FN, Gülçin?, Karagöz B, et al. A comparative study on the antioxidant effects of hesperidin and ellagic acid against skeletal muscle ischemia/reperfusion injury. J Enzyme Inhib Med Chem. 2016;31(sup4):114-118.

[10] Chouchani ET, Pell VR, James AM, et al. A unifying mechanism for mitochondrial superoxide production during ischemia-reperfusion injury. Cell metabolism.2016; 23(2): 254-263.

[11] Zhang T, Zhang Y, Cui M, et al. CaMKII is a RIP3 substrate mediating ischemia-and oxidative stress–induced myocardial necroptosis. Nature medicine.2016;22(2):175.

[12] Rossi A, Wragg A, Klotz E, et al. Dynamic Computed Tomography Myocardial Perfusion ImagingClinical Perspective: Comparison of Clinical Analysis Methods for the Detection of Vessel-Specific Ischemia. CircCardiovascImaging. 2017;10(4):e005505.

[13] 杨盛家,陈兵,罗涛,等.大鼠后肢急性缺血模型的构建及评估[J].中国普通外科杂志,2009,18(6):580-583.

[14] 杨盛家,陈兵,佟铸,等.应用激光多普勒血流仪对大鼠后肢缺血模型血流动力学的观察[J].中国普外基础与临床杂志,2011,18(2): 137-141.

[15] 杨盛家,陈兵,罗涛,等.Lewis 大鼠慢性后肢缺血模型的制备与评价[J].中国普外基础与临床杂志,2012,19(12):1291-1297.

[16] 黄莹,张建,陈兵,等.小鼠后肢缺血肌肉及骨髓氧分压与 HIF-1α蛋白水平的关系[J].中国普外基础与临床杂志,2015,22(1): 50-54.

[17] Fujiwara N, Som A T, Pham L D D, et al. A free radical scavenger edaravone suppresses systemic inflammatory responses in a rat transient focal ischemia model. Neurosci Lett. 2016;633:7-13.

[18] Wyers M, Shuja F. In Patients with Acute Mesenteric Ischemia Does an Endovascular or Hybrid Approach Improve Morbidity and Mortality Compared to Open Revascularization? //Difficult Decisions in Vascular Surgery. Springer, Cham, 2017: 221-233.

[19] Dutkowski P, Schlegel A, Kron P, et al. Reply to “Reducing Nonanastomotic Biliary Strictures in Donation After Circulatory Death Liver Transplantation: Cold Ischemia Matters”. Ann Surg. 2017;266(6):e119-e120.

[20] Manavski Y, Lucas T, Glaser S F, et al. Clonal Expansion of Endothelial Cells Contributes to Ischemia-Induced Neovascularization. Circ Res. 2018;122(5):670-677.

[21] Tomita T M, Kibbe M R. Diagnostic Approach to Chronic Critical Limb Ischemia[M]//Critical Limb Ischemia. Springer, Cham. 2017:137-158.

[22] Hoshijima H, Denawa Y, Mihara T, et al. Efficacy of prophylactic doses of intravenous nitroglycerin in preventing myocardial ischemia under general anesthesia: A systematic review and meta-analysis with trial sequential analysis. J ClinAnesth. 2017;40:16-22.

[23] Shao Q, Casin K M, Mackowski N, et al. Adenosine A1 receptor activation increases myocardial protein S-nitrosothiols and elicits protection from ischemia-reperfusion injury in male and female hearts. PloS one.2017;12(5):e0177315.

[24] Spreen MI, Martens JM, Hansen BE, et al. Percutaneous transluminal angioplasty and drug-eluting stents for infrapopliteal lesions in critical limb ischemia (PADI) trial. CircCardiovascInterv. 2016;9(2):e002376 .

[25] Liotta F, Annunziato F, Castellani S, et al. Therapeutic Efficacy of Autologous Non-Mobilized Enriched Circulating Endothelial Progenitors in Patients With Critical Limb Ischemia-The SCELTA Trial.Circ J. 2018;82(6):1688-1698.

[26] Inoue T, Abe C, Sun-sang J S, et al. Vagus nerve stimulation mediates protection from kidney ischemia-reperfusion injury through α7nAChR+ splenocytes. J Clin Invest. 2016;126(5): 1939-1952.

[27] Dieter RA, Kuzycz GB, Morrow DW. Iatrogenic Extremity Ischemia with the Potential for Amputation//Critical Limb Ischemia. Springer.Cham.2017:241-247.

[28] Ren C, Yao Y, Han R, et al. Cerebral ischemia induces angiogenesis in the peri-infarct regions via Notch1 signaling activation.Exp Neurol. 2018;304:30-40.

[29] AbdElfattahHelal B, Elshrbiny RA, Shebl MM, et al. Study the Effect of Apocynin on Some Renal Functions in Ischemia/Reperfusion Injury in Male Albino Rats. Egyptian Journal of Hospital Medicine.2017;69(2).

[30] Sabato Sorrentino, Claudio Iaconetti, Salvatore De Rosa, et al. Hindlimb Ischemia Impairs Endothelial Recovery and Increases Neointimal Proliferation in the Carotid Artery. Scientific Reports.2018;15(8).

[31] Mantovani A, Bonapace S, Lunardi G, et al. Association between plasma ceramides and inducible myocardial ischemia in patients with established or suspected coronary artery disease undergoing myocardial perfusion scintigraphy. Metabolism. 2018;85:305-312.

[32] Oerlemans M I F J, van Mil A, van Eeuwijk E, et al. Inhibition of miR-223 reduces inflammation but not adverse cardiac remodelling after myocardial ischemia-reperfusion in vivo. NCRI.2018;2(15).

[33] Zheng DY, Zhou M, Jin J, et al. Inhibition of P38 MAPK downregulates the expression of IL-1β to protect lung from acute injury in intestinal ischemia reperfusion rats. Mediators Inflamm. 2016;2016:9348037.

[34] Sunabori T, Koike M, Asari A, et al. Suppression of ischemia-induced hippocampal pyramidal neuron death by hyaluronantetrasaccharide through inhibition of Toll-like receptor 2 signaling pathway. Am J Pathol. 2016;186(8): 2143-2151.

[35] Nakamura K, Sano S, Fuster JJ, et al. Secreted frizzled-related protein 5 diminishes cardiac inflammation and protects the heart from ischemia-reperfusion injury. J Biol Chem. 2016;291(6):2566-2575.

引言

缺血是人体主要的病理变化之一，人体的所有组织及器官均可发生缺血性改变，而一旦出现不可逆性缺血改变，会极大影响缺血部位的功能甚至影响到整个机体的功能或生存^[1-3]。

缺血导致的缺血性疾病根据是否病变源自血管源性病变分为继发性及原发性缺血性疾病。原发性疾病主要是组织或器官的血管源性病变，如冠状动脉粥样硬化等导致的供血部位功能不全或坏死；继发性疾病则主要由于创伤、炎症等导致的血管离断、闭塞或受压迫所致的疾病^[4-6]。无论哪种类型的缺血性疾病，在发病早期经过系统化的内、外科治疗均可达到较为理想的效果^[7]。但若不及时诊治，疾病进一步进展，引起弥散的血管性病变或供血远端组织或器官发生不可逆性病变，根据目前的医学发展程度，一般均是以姑息性治疗缓解患者症状或者如截肢等损伤性手术为最终的结果，彻底丧失恢复最初功能的机会^[8-11]。大部分缺血性疾病被发现时已发生了不可逆性病变，尤其以四肢的缺血性病变多见，治疗极其复杂且可能得不到较好的治疗效果^[12]。这也使缺血性疾病的有效治疗研究成为了目前血管方向的热点方向。

任何临床治疗的前期都需要进行恰当的动物实验已验证其可行性，缺血性疾病的研究也不例外。急性缺血性疾病动物模型的建立目前一般采用离断研究部位的主要或全部血运的方法，但有关慢性缺血性疾病动物模型的建立仍没有较为权威的方法。

杨盛家、黄莹等^[13-16]学者使用线栓法建立了一种慢性缺血动物模型，利用放置于血管内的缝线产生的异物反应来逐渐产生血管闭塞的效果，但其观察周期较长，实验动物经过手术及疾病的打击，生存期有可能会缩短，这就导致了实验过程中可能会有因动物死亡脱组而导致样本数量不足的可能。为了探究一种适用于研究肢体慢性缺血性疾病且造模周期较短的动物模型建立方法，作者在杨盛家等学者的基础上对实验动物喂食高脂饲料，现报道如下：

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材料方法

1.1 设计随机对照动物造模实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10月至2017年10月在承德医学院附属医院动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物健康2周龄SD大鼠40只，体质量为50-70 g，由承德医学院动物实验中心提供。许可证号：SCXK(冀)2016-0015。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.3.2 高脂饲料配方胆固醇1%，胆盐0.1%，猪油10%，蛋黄粉5%，全脂奶粉5%，普通饲料78.9%。

1.3.3 仪器 PeriScanPIM3激光多普勒血流灌注成像仪(瑞典百灵威医疗仪器中国公司)；Lecia显微图像分析系统(德国徕卡仪器有限公司)；手术显微镜、切片及组织学器材，由承德医学院附属医院病理科提供。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组将40只实验动物采用随机数字表法随机分为实验组和对照组。对照组进食普通饮食至4周龄，采用线栓法造模；实验组进食高脂饮食至4周龄后进行线栓法造模。所有实验动物均取左下肢为实验部位，麻醉药品采用戊巴比妥1 mg/g剂量腹腔内注射麻醉。

1.4.2 线栓造模方法实验动物取右侧卧位，将四肢固定于实验架上，麻醉，以左下肢外侧为术区，术区常规备皮、消毒，铺无菌单，以左下肢外侧正中皮肤为手术切口，由髋关节纵行切开至膝关节，逐层分离，显露股动脉，结扎股动脉所有分支，于腹股沟韧带处及膝关节处阻断股动脉，切开股动脉，将4-0 prolene线置入股动脉，长度为腹股沟至膝关节距离，缝合股动脉，冲洗，逐层缝合。

造模后每日换药至术后1周，对照组喂食普通饲料，实验组喂食高脂饲料。

1.5 主要观察指标 ①分别于1，2，4，6周观察大鼠术侧肌力。肢体肌力判定标准：0级，后肢完全瘫痪，肌肉对刺激不产生任何收缩反应；1级，肌肉受刺激后有轻微的收缩，后肢有微小动作；2级，后肢能作运动，但肌力差，不能克服重力，不能抬起脚掌；3级，肌肉可抗阻力，后肢运动较好，部分时间可抬脚掌；4级，肌力较好，跛行；5级，步态自如。因大鼠术侧创伤较大，术后恢复可能对肌力观察造成影响，取肌力4级及5级为正常，其余为异常；②分别于1，2，4，6周每组各取2只异常大鼠，麻醉后行激光多普勒血流仪检测后肢血流情况；③行激光多普勒后腹腔注射戊巴比妥至致死量，取腓肠肌肌肉及置入缝线处血管进行常规脱钙、脱水、透明及石蜡包埋，5 μm连续切片，苏木精-伊红染色，于20×20倍显微镜下进行组织学观察。

1.6 统计学分析数据采用SPSS20.0软件分析。组间肌力异常比较采用χ²检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

中国目前仍没有具体的数据统计肢体缺血患者的数量及其转归，但由于其治疗的复杂性、昂贵性以及人们对血管相关性疾病认知程度的匮乏性导致了为数不少的肢体缺血患者最终的结局是截肢，彻底丧失功能治疗的可能性及肢体功能的留存性^[17-20]。

随着医学的发展，大数据的统计以及组织工程的发展都得到了较为可观的推进^[20]。各种影像学的仪器发展使缺血性疾病的发现时机显著提前，而越为提早的治疗，缺血性疾病的转归越为理想^[21-22]。介入材料以及血管重建科学的发展使缺血性疾病的治疗范围又扩大了很多。但无论何种临床上治疗的可观发展都来源于动物实验的铺垫，而动物实验的可行性的前提则是可靠的疾病模型建立。前文提到关于肢体急性缺血的动物模型建立方法基本定型，即为对研究部位的主要供血动脉的不可逆性破坏，导致局部的血运急剧下降，从而建立急性缺血模型，个体化的动物模型差别在于操作中对于哪一支动脉的破坏，但结果无明显差异^[23-26]。

无论在临床还是基础研究中，破坏性操作要远远易于重建性或可控性操作，对应于缺血动物模型的建立即是急性缺血模型远远易于慢性缺血模型的建立。杨盛家等^[14]学者致力于缺血模型及慢性缺血性疾病的研究多年，对于慢性缺血模型的建立研究已相当成熟，在对血管的不同异物刺激中将0号普通丝线，羊肠线及Prolene线进行了对比，得出了Prolene线更适合作为线栓法的实验材料^[16^，^27-28]。

杨盛家教授建立的模型较为经典，不仅将其线栓法使用的材料、慢性缺血模型持续的时间以及其相应的骨髓治疗都得出了较为权威的结论，但动物实验的本质是为了得出相应临床结果，所以在排除干扰因素后能得出相同结果的前提下，时间越短，研究越为提前，相应的实验动物存活率及经费消耗都要降低，因此，为了缩短线栓法的造模时间，作者在分析了缺血性疾病的病理生理变化后^[29-32]，将高脂饮食加入了实验方法中。

众所周知，慢性缺血性疾病大部分都是继发性疾病，主要引起因素为血液黏稠度的变化，而最常见引起血液黏稠度改变继而引发一系列变化导致缺血性疾病改变的就是血脂或血小板等物质的比例增加，目前增加血小板的试剂价格昂贵且不易监测，相比而言，血脂的升高较为简单易行^[33-35]。

在实验动物造模前2周给予高脂饮食，至4周时大鼠进入成熟阶段，进行手术操作。通过高脂饲料喂养，实验组大鼠的血脂将明显高于对照组大鼠，进而为线栓法的异物反应提供更好的内膜增生环境。但差异在于在实验计划阶段作者认为通过高脂饮食，然后进行线栓法后，异物反应不会像对照组一样单纯内膜增生，应该有血栓的形成，但最终的结果仍是单纯血管内膜增生，但增生的速度要高于对照组。实验中，实验组较对照组要早出现缺血表现，且持续缺血时间要长于对照组，通过激光多普勒后肢血流仪检测可见高脂饮食结合血管内置入缝线在极短的1周内造成了血管的狭窄，但其血流并未中断，而通过组织学观察可见在管腔狭窄后，缝线与高脂饮食的组合使异物反应程度变大，内膜增生的速度要明显快于对照组，使实验动物的患侧处于持续缺血状态。通过实验，实验组的肌力变化要较对照组更早出现，而且肌力、多普勒以及组织学观察证实实验组的慢性缺血程度要较对照组更重，且维持时间更长。

结论：高脂饮食结合线栓法制作动物下肢慢性缺血模型较传统饮食线栓法要更加快速得到缺血模型，且其持续缺血时间也明显长于传统饮食法。

实验不足之处：①该实验由于经费、操作人员及时间限制，样本数量较少，而且在观察过程中需要不断处死动物进行组织学观察，因此第6周进入统计的组间数量较少，不具有权威代表性；②在进行多普勒及组织学观察时，原则上要选取具有代表性的样本进行观察，该实验未规避这些因素；③SD大鼠与人类具有显著解剖学差异，因此，在具体应用上可能会有偏倚。

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