骨髓间充质干细胞移植治疗多器官功能障碍综合征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.013

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (9): 1378-1383.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.09.013

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骨髓间充质干细胞移植治疗多器官功能障碍综合征

和法莲^1，2，刘高米洋¹，刘菊芬¹，李自安¹，王强¹，潘兴华¹

¹解放军成都军区昆明总医院细胞生物治疗中心，细胞生物医药技术国家地方联合实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032；²昆明医科大学成都军区昆明总医院临床学院，云南省昆明市 650031

出版日期:2017-03-28 发布日期:2017-03-31
通讯作者: 潘兴华，博士后，主任医师，博士生导师和硕士生导师，解放军成都军区昆明总医院生物治疗中心，细胞生物医药技术国家地方联合实验室，云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:和法莲，女，1988年生，山东省泰安市人，汉族，昆明医科大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞研究。并列第一作者：刘高米洋，女，1988年生，云南省宣威市人，汉族，2013年第二军医大学毕业，硕士，主要从事干细胞基础与临床应用研究。
基金资助:
国家支撑计划项目(2014BI01B01-05)：实验用树鼩的标准化研究和人类重大疾病树鼩模型创建与应用集成示范；云南省科技计划项目(2013CA005)：脐带间充质干细胞治疗系统性红斑狼疮的临床应用研究；全军实验动物专项(DW2014006)：树鼩放射模型创建及用于间充质干细胞治疗研究

Therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on multiple organ dysfunction syndrome

He Fa-lian^{1, 2}, Liu Gao-mi-yang¹, Liu Ju-fen¹, Li Zi-an¹, Wang Qiang¹, Pan Xing-hua¹

¹Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Area of Chinese PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Regions in Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China; ²Kunming General Hospital of Chengdu Military Region Kunming Medical University Clinical College, Kunming 650031, Yunnan Province, China

Online:2017-03-28 Published:2017-03-31
Contact: Pan Xing-hua, M.D., Chief physician, Master’s and doctoral supervisor, Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Area of Chinese PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Regions in Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:He Fa-lian, Studying for master’s degree, Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Area of Chinese PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Regions in Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China; Kunming General Hospital of Chengdu Military Region Kunming Medical University Clinical College, Kunming 650031, Yunnan Province, China Liu Gao-mi-yang, Master, Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital of Chengdu Military Area of Chinese PLA, Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Regions in Yunnan Province, the Stem Cell Therapy Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China He Fa-lian and Liu Gao-mi-yang contributed equally to this work.
Supported by:
the National Sci-Tech Support Plan of China, No. 2014BI01B01-05; the Major Scientific Plan of Yunnan Province, No. 2013CA005; the PLA Special Fund for Experimental Animals, No. DW2014006

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
内毒素：化学成分为脂多糖，位于革兰阴性细菌细胞壁上，其毒性成分主要为类脂质A，只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放。当把内毒素大量注入血液中，超过机体各自卫系统的清除能力，则可导致不同程度的内毒素血症，同时也可导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等，病死率极高。症状和体征主要有发热、白细胞数减少、弥漫性血管内凝血、心力衰竭、肾功能减退、肝脏损伤、缺氧及酸中毒等。
全身炎症反应综合征：是因感染或非感染病因作用于机体而引起的机体失控的自我持续放大和自我破坏的全身性炎症反应。它是机体修复和生存而出现过度应激反应的一种临床过程。当机体受到外源性损伤或感染毒性物质的打击时，可触发初期炎症反应，同时机体产生内源性免疫炎性因子而形成“瀑布效应”，严重者可导致多器官功能障碍综合征。

摘要

背景：多器官功能障碍综合征为当今临床治疗的一大难题，骨髓间充质干细胞移植为其提供了一个新的治疗研究方向。
目的：观察骨髓间充质干细胞移植治疗多器官功能障碍综合征的疗效。
方法：按1 mg/kg剂量股静脉注射内毒素建立大鼠多器官功能障碍综合征模型，将存活的大鼠随机分为治疗组和模型组，治疗组大鼠尾静脉注射500 μL(5×10⁶)第3代骨髓间充质干细胞，对照组尾静脉注射等体积的生理盐水；治疗5 d后行血常规、血生化、凝血功能检测，取血后处死大鼠取肝脏、肾脏、心脏、脾脏进行苏木精-伊红染色病理学观察。
结果与结论：①移植治疗1周后，与模型组相比，治疗组肝功能、凝血功能各项指标明显得到改善(P < 0.05)，白细胞计数更接近正常水平(P < 0.05)；②模型组心、肝、脾、肾脏均出现不同程度的炎症性病变和坏死，治疗组炎性浸润和坏死性病变明显减轻；③结果提示，骨髓间充质干细胞对多器官功能障碍综合征模型大鼠具有明显的治疗作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

ORCID: 0000-0003-1807-8626(和法莲)

关键词: 干细胞, 移植, 内毒素, 多器官功能障碍综合征模型, SD大鼠, 骨髓间充质干细胞, ；细胞移植

Abstract:

BACKGROUND: Clinical treatment of multiple organ dysfunction syndrome has been a big problem today, while the treatment of bone marrow mesenchymal stem cells may provide a new research direction.

OBJECTIVE: To investigate the therapeutic effects of bone marrow mesenchymal stem cells transplanted into multiple organ dysfunction syndrome models.

METHODS: According to body weight of rats, endotoxin in the 1 mg/kg dose was injected into the femoral vein to build the multiple organ dysfunction syndrome models in rats, and the surviving rats were randomly divided into treatment and control groups. Then the rats in the treatment group were injected intravenously third-generation bone marrow mesenchymal stem cells (5×10⁶), while rats in the control group injected intravenously with an equal volume of saline. After 5 days of treatment, the blood routine examination, blood biochemistry and coagulation tests were conducted, and then the liver, kidney, heart, and spleen of rats were captured to observed pathological changes through the hematoxylin-eosin staining.

RESULTS AND CONCLUSION: One week after cell transplantation, liver function and biochemical indicators were improved significantly in the treatment group compared with the control group (P < 0.05), and the white blood cell count in the treatment group was closer to normal levels (P < 0.05). Hematoxylin-eosin staining results showed that in the multiple organ dysfunction syndrome rats appeared to have different degrees of inflammatory lesions and necrosis in the heart, liver, spleen, and kidneys, while inflammatory infiltration and necrotic lesions decreased significantly in the treatment group compared with the control group. To conclude, bone marrow mesenchymal stem cells exert remarkable therapeutic effects on multiple organ dysfunction syndrome.

Key words: Endotoxins, Multiple Organ Failure, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

和法莲，刘高米洋，刘菊芬，李自安，王强，潘兴华. 骨髓间充质干细胞移植治疗多器官功能障碍综合征[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(9): 1378-1383.

He Fa-lian, Liu Gao-mi-yang, Liu Ju-fen, Li Zi-an, Wang Qiang, Pan Xing-hua . Therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on multiple organ dysfunction syndrome[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(9): 1378-1383.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞培养、扩增以及诱导鉴定结果 采用贴壁培养法分离培养骨髓间充质干细胞，接种两三天后可见少量贴壁细胞生长，呈梭形或多边形，表面覆盖大量的杂细胞，随着培养时间延长，大量细胞贴壁，换液后可见形态均一的细胞增殖集落(图1A)；培养10-13 d，95%以上细胞融合。经胰酶消化后1︰2传代，细胞贴壁后呈典型的成纤维细胞形态(图1B)，分布均匀，大小一致，生长5-7 d后传代。

流式细胞仪检测结果显示干细胞标记物CD29，CD44，CD90的阳性表达率为99.9%，96%和98.6%，干细胞阴性标记物CD34的表达率为6.94%，结果说明移植所用的细胞符合间充质干细胞的表型特征，见图2。

对第3代骨髓间充质干细胞进行体外诱导分化实验，成脂诱导后，细胞变圆，形态不规则，出现脂肪小滴，经油红O染色后，脂滴明显红染、沉积。成骨诱导后经茜素红染色，出现明显红染的钙结节^[4]，见图3。

2.2 骨髓间充质干细胞治疗前后生物化学检验相关指标变化肝功能结果显示，在细胞移植治疗5 d后，治疗组总蛋白、白蛋白水平均明显高于模型组(P < 0.05)，蛋白水平有恢复趋势，但仍未达到正常水平；谷丙转氨酶、谷草转氨酶较模型组有明显下降(P < 0.05)，且谷草转氨酶仍高于正常值3倍以上^[3]，差异有显著性意义。心功能结果显示，治疗组乳酸脱氢酶、肌酸磷酸激酶、肌酸激酶同工酶均下降，其中乳酸脱氢酶由(2 191.50±31.27) U/L降至(1 197.00 ±36.38) U/L，与模型组相比差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。肾脏生化指标尿素氮、肌酐未发生明显变化。

2.3 骨髓间充质干细胞治疗前后凝血功能相关指标变化 凝血功能显示，在细胞移植5 d后，治疗组凝血酶原时间、凝血酶时间较模型组缩短，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

2.4 骨髓间充质干细胞治疗前后炎症细胞分析结果 造模后，白细胞计数增高1倍或减少50%，满足全身炎症反应条件中对白细胞的要求。经骨髓间充质干细胞治疗后，有助于白细胞趋于正常水平，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见表3。

2.5 组织病理学观察结果

2.5.1 肝脏病理组织结构 模型组苏木精-伊红染色显示肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，窦间隙变窄；肝细胞肿大，脂肪变性明显，核大而深染、核型不整齐；血管扩张充血明显，血窦充血，炎性细胞浸润明显，说明存在急性肝炎病变(图4A)；骨髓间充质干细胞治疗后，肝脏上述症状变轻，肝脏变性、坏死细胞明显减轻，炎症浸润减少，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，可见肝脏病变形态趋于修复(图4B)。

2.5.2 心肌病理组织结构 模型组苏木精-伊红染色显示心肌细胞脂肪变性，呈空泡状，与未受侵犯的红色心肌相间排列(图5A)；治疗组脂肪空泡较少，心肌排列整齐、紧密，与模型组相比，心肌修复明显(图5B)。

2.5.3 脾脏病理组织结构 模型组苏木精-伊红染色显示脾脏充血淤血很明显，大量红细胞充满视野，淋巴细胞等被其覆盖、挤压，炎症反应明显(图6A)。与模型组相比，治疗组充血明显减轻，红细胞覆盖减少，大量淋巴细胞显现，多核细胞等炎症修复细胞出现，脾脏病变形态趋于修复(图6B)。

2.5.4 肾脏病理组织结构 模型组苏木精-伊红染色显示肾小球肥大，基底膜增厚，肾小球囊腔增大；肾小管管壁增厚，有玻璃样物质沉积，毛细血管扩张充血，炎症细胞浸润(图7A)。与模型组相比，治疗组肾脏病变明显减轻，炎性细胞浸润明显减少，毛细血管充血减轻，肾小球囊腔趋于正常，可明显看到肾组织得到修复(图7B)。

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引言

材料方法

1.1 设计 平行对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年6至8月在昆明总医院动物实验中心和细胞生物治疗中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 雄性SD大鼠30只，4个月龄，体质量(400±25) g，购自昆明医科大学实验动物中心，股静脉注射内毒素建立多器官功能障碍综合征模型，死亡的动物不计入统计分析。雄性SD大鼠5只用于细胞分离培养，8周龄，体质量(200±50) g，购自昆明医科大学实验动物中心。

1.3.2 主要试剂及仪器 内毒素：Lipopolysaccharides from Escherichia coli 055:B5(Sigma公司)。DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国BI公司)；SW-CL-2F型百万层级层流超净工作台(苏州佳宝净化工程设备有限公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)；免疫组化石蜡包埋机、免疫组化切片机(德国Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、提取以及鉴定 8周龄SD大鼠脱颈处死，体积分数为75%乙醇消毒皮肤，无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉，取股骨及胫骨，浸泡在PBS中，最短时间内移至超净台，倒掉PBS，再用含青链霉素1︰100的PBS清洗3遍。用无菌剪剪掉两侧的骨骺端，暴露出骨髓腔，放于10 mm培养皿中，用5 mL一次性注射器吸取5 mL细胞培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F-12)，将针头插到骨髓腔的一端冲洗，然后换另一端接着冲。冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出为准。用5 mL一次性无菌巴氏滴管，反复在培养皿中吹吸细胞悬液3-5次，再全部吸到75 cm²培养瓶中，此时的细胞悬液大约为5 mL，24 h后补液至15 mL，获得第3代纯化的间充质干细胞，观察细胞形态呈长梭形，漩涡状生长，通过流式细胞仪检测细胞表面蛋白CD29，CD34，CD44，CD90的表达鉴定细胞的干性。

1.4.2 成骨成脂诱导分化能力 按照文献[2]方法对第3代骨髓间充质干细胞进行体外诱导分化实验。

1.4.3 多器官功能障碍综合征模型制备方法 苦味酸标记成年SD大鼠30只，称量体质量，用3%戊巴比妥钠麻醉后，按1 mg/kg剂量股静脉注射内毒素，并记录注射时间。注射24 h后观察大鼠死亡情况和基本生命体征，随机选取模型组3只大鼠抽取腹腔动脉血、腹腔静脉血，静脉血用于血常规、血生化、凝血功能检测，动脉血用于血气分析，并采集肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺及脑组织作病理检查^[3]。

1.4.4 实验动物分组及治疗 将造模成功动物随机分为治疗组和模型组，各15只。治疗组将获得的第3代骨髓间充质干细胞用0.25%胰酶消化1 min，待细胞呈圆形悬浮时，使用胰酶抑制剂终止消化，收集细胞悬液于50 mL无菌离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃上清，收集细胞沉淀，用生理盐水悬浮细胞并使细胞呈单个细胞状态，按1×10⁷/kg的细胞剂量、500 μL/只总液体量于造模后24 h进行尾静脉注射。对照组尾静脉注射等体积的生理盐水。

1.4.5 生化指标检测 细胞移植5 d后取腹主静脉血5 mL，用自动生化分析仪测定反映大鼠心、肝、肾功能的生化值，即心肌酶指标(乳酸脱氢酶、肌酸磷酸激酶、羟丁酸脱氢酶)，肝功能指标(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、总蛋白、白蛋白)，肾功能指标(尿素氮和肌酐)。肺功能指标因条件限制未测。

1.4.6 凝血功能相关指标和炎症细胞检测 细胞移植5 d后取腹主静脉血6 mL，其中3 mL静脉血肝素抗凝，用血凝检测仪测定凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间，另3 mL静脉血用于检测血常规。

1.4.7 组织病理学检测 取血后处死大鼠，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏用40 g/L多聚甲醛进行固定，进行苏木精-伊红染色，观察器官组织是否存在坏死、脂质沉淀、淀粉样变等病理变化以及充血、水肿、细胞浸润等炎症变化。

1.5 主要观察指标 血液生化、血常规、血凝指标以及各脏器组织病理形态。

1.6 统计学分析 数据用x(_)±s表示，均数比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

使用内毒素诱发脓毒血症，引起全身炎症反应建立SD大鼠多器官功能障碍综合征模型已经成为相对稳定的方法^[5]。实验使用1 mg/kg的剂量注射内毒素成功复制多器官功能障碍综合征模型，并使大鼠在24 h内肝脏、心脏、肾脏以及脾脏出现功能障碍，凝血功能受损，炎症反应明显，机体代谢降低，为进一步治疗提供了良好的模型^[6-7]。

多器官功能障碍综合征模型大鼠经骨髓间充质干细胞治疗后，肝功能的生化指标总蛋白、白蛋白水平升高；谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶水平降低。由于肝脏具有很大的代偿能力，且白蛋白半衰期较长，只有当肝脏病变达到一定程度才能出现血清总蛋白的改变；白蛋白水平与有功能的肝细胞数量成正比，白蛋白持续下降，提示进行性肝细胞坏死，说明肝脏存在慢性中度以上持续性肝炎；谷丙转氨酶、谷草转氨酶均为非特异性细胞内功能酶，正常时血清中含量很低，肝细胞损伤时膜通透性增高，谷丙转氨酶和谷草转氨酶逸出，导致血液中谷丙转氨酶、谷草转氨酶升高。当严重肝细胞损伤时，线粒体受损，血清中谷草转氨酶明显升高，且明显高于谷丙转氨酶，提示可能有溶血存在。碱性磷酸酶升高，谷丙转氨酶升高，胆红素正常，排除胆道性疾病，提示存在急性或慢性肝炎^[8-9]；病理切片中，肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，窦间隙变窄；肝细胞肿大，脂肪变性明显，核大而深染、核型不整齐，血管扩张充血明显，血窦充血，炎性细胞浸润明显，也说明肝存在急性肝炎病变^[10]；治疗后白蛋白上升，提示肝细胞再生，谷丙转氨酶、谷草转氨酶明显下降，肝脏变性、坏死细胞明显减轻，炎症浸润减少，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，提示骨髓间充质干细胞可能有助于肝脏炎症的调节和肝细胞损伤的修复以及代偿^[11-13]。

心功能结果显示，模型组乳酸脱氢酶高于正常值5倍，乳酸脱氢酶主要见于心肌炎、心功能不全等其他心脏疾病，反映心脏肌肉炎性变化，且病理显示心肌细胞存在脂肪变性，进一步提示心肌存在炎症反应。治疗后，乳酸脱氢酶降低1.5倍，脂肪变性以及组织炎症反应降低显著，病变获进一步修复，说明骨髓间充质干细胞也可作用于心肌，通过旁分泌或者细胞融合^[14-15]，调控心肌炎症反应，代偿脂肪变性的心肌细胞^[16]，改善心肌质量，提高心肌功能。

肾脏、脾脏的损伤主要表现为肾小管存在明显的管壁玻璃样变和基底膜增厚，脾脏充血肿大，治疗后切片中肾小管玻璃样变减轻，基底膜厚度变薄，肾功能和脾脏充血炎症反应得到改善，提示骨髓间充质干细胞对肾脏损伤有修复作用，具有改善肾纤维化，减少脂质沉积，降低炎症因子作用等^[17]，研究发现骨髓间充质干细胞移植到肾小管数量仅占总移植量的一小部分^[18]，故更多的人更偏向于旁分泌机制^[19-20]，通过旁分泌相关因子进一步调节肾小管损伤并进行间接修复，改善肾功能。

炎症细胞结果表明，模型组白细胞计数增高1倍或减少50%，说明机体存在严重的炎症反应，极重度感染者，白细胞数量可不增加，甚至降低，可能与其再分布聚集于内脏血管、白细胞大量游走趋向炎症区域及骨髓供应不足有关^[21]。治疗后，白细胞计数趋于正常值，说明骨髓间充质干细胞在调节机体炎性机制方面有很重要的作用^[22-23]，骨髓间充质干细胞具有独特的免疫学特性，参与多种免疫细胞功能的调节^[24]，另相关实验证明骨髓间充质干细胞可以通过调控NF-κB、肿瘤坏死因子、白细胞介素10、白细胞介素6、CD69等的表达来调节机体炎症反应^[25-26]，说明骨髓间充质干细胞应对炎症损伤的重要作用。

实验结果提示骨髓间充质干细胞在大鼠多器官功能障碍综合征模型中具有明显的治疗作用，为未来临床治疗多器官功能障碍综合征提供了一种新的方法，但具体机制有待于进一步研究。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞移植治疗多器官功能障碍综合征

Therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on multiple organ dysfunction syndrome

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