肿瘤坏死因子α拮抗剂联合酪氨酸激酶C基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.010

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3338-3345.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.010

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肿瘤坏死因子α拮抗剂联合酪氨酸激酶C基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤

王乐^1，2，陈宁宁^1，2，李婷婷³，赵晓阳^1，2，魏富鑫^1，2，崔尚斌^1，2，万勇^1，2，刘少喻^1，2

¹中山大学附属第一医院脊柱外科，广东省广州市 510080；²广东省骨科学重点实验室，广东省广州市 510080；³中山大学附属第一医院东院康复科，广东省广州市 510700

修回日期:2017-06-08 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
通讯作者: 刘少喻，教授，主任医师，博士生导师，中山大学附属第一医院脊柱外科，广东省骨科学重点实验室，广东省广州市 510080
作者简介:王乐，男，1986年生，吉林省长春市人，汉族，2015年中山大学毕业，博士，医师，主要从事脊柱外科方面的临床和研究工作。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81272007)；广东省自然科学基金项目(2016A030313213)

Tumor necrosis factor-alpha antagonist combined with tyrosine kinase C gene- modified neural stem cell transplantation for spinal cord injury

Wang Le^{1, 2}, Chen Ning-ning^{1, 2}, Li Ting-ting³, Zhao Xiao-yang^{1, 2}, Wei Fu-xin^{1, 2}, Cui Shang-bin^{1, 2}, Wan Yong^{1, 2}, Liu Shao-yu^{1, 2}

¹Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; ²Guangdong Provincial Key Laboratory of Orthopedics and Traumatology, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; ³Department of Rehabilitation, the Eastern Hospital of the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510700, Guangdong Province, China

Revised:2017-06-08 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
Contact: Liu Shao-yu, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; Guangdong Provincial Key Laboratory of Orthopedics and Traumatology, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Wang Le, M.D., Physician, Department of Spine Surgery, the First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China; Guangdong Provincial Key Laboratory of Orthopedics and Traumatology, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
the General Project of National Natural Science Foundation of China, No. 81272007; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2016A030313213

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
酪氨酸激酶C：是神经细胞表面神经营养因子的受体，有研究报道TrkC基因修饰的神经干细胞能更好地向神经元分化。
基因转染技术：是指通过物理或生物方法将目的基因导入到真核细胞的基因组中，使其调控靶细胞向特定的方向表达。

摘要
背景：脊髓损伤在控制损伤后炎症反应的同时联合神经干细胞移植，是否能够提高脊髓损伤的治疗效果，目前尚不明确。
目的：实验旨在检测早期应用肿瘤坏死因子α拮抗剂Etanercept联合酪氨酸激酶C基因修饰移植治疗后大鼠脊髓组织修复，髓鞘再生和神经轴突再生，运动功能恢复情况及其可能机制。
方法：利用慢病毒转染技术构建酪氨酸激酶C过表达的神经干细胞，制备大鼠脊髓横断损伤模型，采用肿瘤坏死因子α拮抗剂Etanercept联合酪氨酸激酶C基因修饰神经干细胞移植。利用尼氏染色、免疫荧光及免疫印迹等方法测定损伤后神经元数目和神经再生情况；利用BBB功能学评分和诱发电位来检测大鼠运动功能；利用电镜检测和甲苯胺蓝染色来检测治疗后各组髓鞘再生情况。

结果与结论：损伤后28 d，与其他组相比，Etanercept联合酪氨酸激酶C-神经干细胞移植组损伤脊髓尾端处有更多前角运动神经元存活(P < 0.05)，具备髓鞘包绕的轴突数量增高(P < 0.05)，损伤后运动功能评分相对更高(P < 0.05)，运动诱发电位的振幅恢复更大(P < 0.05)，潜伏期相对更短(P < 0.05)。结果证实，大鼠脊髓损伤后早期应用肿瘤坏死因子α拮抗剂联合酪氨酸激酶C-神经干细胞移植，可有效促进大鼠神经元轴突及髓鞘再生，进而促进运动功能恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-6060-3941(刘少喻)

关键词: 干细胞, 移植, 脊髓损伤, 神经干细胞, 肿瘤坏死因子α, 细胞凋亡, 髓鞘再生, 慢病毒, 细胞移植, 轴突再生, SD大鼠, 酪氨酸激酶C, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Whether controlling of post-injury inflammatory response combined with neural stem cell (NSC) transplantation can improve the curative efficacy for spinal cord injury still remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the repair of spinal cord tissue, myelin regeneration, axon regeneration, motor function recovery and the possible mechanism after early application of tumor necrosis factor α antagonist (Etanercept) combined with tyrosine kinase C (TrkC) gene-modified NSC transplantation.
METHODS: TrkC-overexpressed NSCs (TrkC-NSCs) were constructed by lentiviral transfection technique. The rat models of spinal cord transection injury were prepared, and then subjected to Etanercept combined with TrkC-NSCs transplantation. The number of neurons and neuroregeneration after injury were measured by Nissl’s staining, immunofluorescence and western blot. The rat motor function was detected by Basso Beattie Bresnahan score and evoked potential. The myelin regeneration was detected by electron microscopy and toluidine blue staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the other groups, the Etanercept combined with TrkC-NSCs transplantation group had more survived anterior horn motor neurons at 28 days after injury, more myelin-encapsulated axons, higher Basso Beattie Bresnahan score, greater amplitude of the evoked potentials, and relatively shorter latency (all P < 0.05). These findings indicate that early application of tumor necrosis factor-α antagonist combined with TrkC-NSCs transplantation after spinal cord injury in rats can effectively promote myelin regeneration, axon regeneration, and further promote motor function recovery.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Spinal Cord Injuries, Neural Stem Cells, Apoptosis

中图分类号:

R394.2

王乐，陈宁宁，李婷婷，赵晓阳，魏富鑫，崔尚斌，万勇，刘少喻. 肿瘤坏死因子α拮抗剂联合酪氨酸激酶C基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3338-3345.

Wang Le, Chen Ning-ning, Li Ting-ting, Zhao Xiao-yang, Wei Fu-xin, Cui Shang-bin, Wan Yong,Liu Shao-yu. Tumor necrosis factor-alpha antagonist combined with tyrosine kinase C gene- modified neural stem cell transplantation for spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3338-3345.

图/表（结果） 2

2.1 慢病毒LV/TrkC转染神经干细胞后筛选结果 原代提取的神经干细胞在培养24 h后，50%-75%的细胞呈贴壁状态，48 h后出现细胞集落生长，并开始悬浮；72 h后细胞逐渐悬浮并细胞增殖速度增加；约4 d出现小的神经球(neurosphere)，待生长六七天时，小神经球生长至150- 200 μm则可进行传代。传至2代时，细胞形态基本均一，增殖旺盛，折光性好，Nestin染色阳性比例高(图1)。

将细胞种植到24-well中培养，测试不同滴度LV-GFP感染神经干细胞后绿色荧光强度。发现MOI值=10时，镜下所见的神经球绿色荧光表达最为强烈，细胞质和细胞核内均有GFP-TrkC表达。培养到第7天仍有强GFP绿色荧光表达。通过转染成功后加入嘌呤霉素，筛选出了高表达TrkC基因的神经干细胞(图2)。

2.2 大鼠后肢运动功能变化 实验用BBB评分对各组大鼠的后肢运动功能情况进行评估，尽管OP组的运动恢复十分有限，单纯ET组的BBB评分在损伤2周后开始较OP组有明显的恢复而且这种恢复逐渐明显一直到末次观察(损伤后4周)(P < 0.05)(图3)，这表明肿瘤坏死因子α在脊髓横断损伤模型的继发性损伤中也扮演重要角色。

另外从损伤后2周开始，NSC+ET组相比OP组明显促进了大鼠运动功能恢复(P < 0.05)，这种恢复在3周和4周更为明显(P < 0.01)；而联合治疗在4周后功能恢复好于两个单纯治疗组(P < 0.05)。在NSC+ET组，损伤后4周10只大鼠里有3只可以做到负重步行(BBB评分10分)，结果表明Etanercept早期应用可以有利于脊髓运动功能恢复，联合TrkC-NSC治疗恢复更好。

2.3 大鼠运动诱发电位变化 测量各组大鼠的运动诱发电位(MEP)，运动诱发电位作为临床常用的脊髓检测制备，主要用于评估运动神经系统。通过运动诱发电位的波幅和潜伏期可初步估计出脊髓内兴奋的轴突数目和神经的信号传导能力。

运动诱发电位的信号在OP组非常差，ET组，NSC组和NSC+ET组的运动诱发电位波幅较OP组明显升高，各组运动诱发电位波幅最大的是NSC+ET组(P < 0.05)。但相比假手术组仍有较大差距。这些结果表明早期应用Etanercept联合TrkC-NSC移植可促进神经再生；另外，Etanercept的抗炎和抗凋亡作用促进了神经细胞存活以及运动神经功能恢复。相比BBB评分，运动诱发电位的波幅在ET组和NSC组是差异无显著性意义(P > 0.05)。运动诱发电位仅在NSC+ET组的潜伏期较OP组缩短，差异有显著性意义(P < 0.05；图4)。

2.4 大鼠脊髓前角神经元计数变化 实验利用尼氏染色来评估脊髓损伤后早期应用Etanercept联合TrkC-NSC移植对脊髓前角运动神经元的数目的影响，计数位置为损伤处尾端。统计可知NSC组，ET组和NSC+ET组的前角运动神经元个数相比OP组都有显著增加(P < 0.05)，NSC+ET组的前角运动神经元个数相比其他组均有增加(P < 0.05)，说明脊髓损伤后早期应用Etanercept联合TrkC-NSC移植28 d后相比单纯TrkC-NSC移植或单纯Etanercept治疗可得到更多存活的前角运动神经元。因评估的位置是脊髓损伤横断处的尾端，故存活神经元可能与ET对损伤后残存神经元的保护，或移植后神经干细胞迁移分化有关(图5)。

2.5 大鼠脊髓神经元相关标记物情况 为评估脊髓损伤后早期应用Etanercept联合TrkC-NSC移植治疗的神经再生情况，以及Etanercept的抗炎抗凋亡作用影响下NSC+ET组相比NSC或ET组的恢复情况，实验利用几种神经元再生的相关标记物。NF200的表达在ET，NSC组和NSC+ET组相比OP组均有升高(P < 0.05)，而NF200表达最高的是NSC+ET联合治疗组(P < 0.05)。与突触功能密切相关的蛋白synapsin Ⅰ，在ET，NSC组和NSC+ET组相比OP组均有升高(P < 0.05)，表达最高的是NSC+ET联合治疗组(P < 0.05)。另外结果还显示，NSC组的NF200及synapsinⅠ表达要高于ET组(P < 0.05)(图6)。

实验还利用免疫荧光检测NF200在脊髓损伤处的生成情况，为评估各组轴突再生的程度。ET组，NSC组和NSC+ET组在损伤后4周的神经丝数目相比对照组均明显增加(P < 0.05)。在NSC组中NF200阳性的神经丝数目要高于ET组(P < 0.05)，NSC+ET组的神经丝数目最多(P < 0.05)，表明联合治疗效果优于单独ET或TrkC-NSC移植，这其中的效果大部分归功于早期应用Etanercept对肿瘤坏死因子α的拮抗作用(图6)。

2.6 大鼠脊髓损伤区域的髓鞘再生 为检测脊髓损伤后早期应用Etanercept联合TrkC-NSC移植治疗能否促进脊髓髓鞘再生，实验使用甲苯胺蓝轴突染色后光镜计数。结果显示，OP组的脱髓鞘情况非常严重，而在ET组，NSC组和NSC+ET组中实验发现有更多的具有髓鞘包绕的轴突(P < 0.05)。而NSC组中轴突被髓鞘包绕的个数和比例都高于ET组，差异有显著性意义(P < 0.05)。NSC+ET组得到的具备髓鞘包绕的轴突数量和比率均高于其他组(P < 0.05)。电镜观察可见到脱髓鞘情况和甲苯胺蓝染色计数结果一致，在对照组中实验可见包绕轴突的髓鞘的薄层分离，髓鞘结构疏松(图7)。

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引言

随着现代社会经济高速发展，脊髓损伤作为一种病情严重、预后差的脊柱外科疾病，这10年来的发病率呈增高趋势，在世界范围内，脊髓损伤的年发病率为每百万人有15-40例，给其家庭和社会带来沉重的经济负担^[1]。虽然包括脊柱外科医师和科学研究人员在内的全世界各团体都在不断地对其新的治疗方案进行研究和探索，已将脊髓损伤的死亡率降低，但运动、感觉等神经功能的改善仍相当有限^[2]。传统的治疗包括激素冲击、手术减压、脊柱固定及康复治疗等，但效果均不能令人满意。如何促进脊髓损伤后神经功能的恢复是目前医疗和科研工作研究的热点。

尽管脊髓继发性损伤中有些反应是为了机体自我保护的对应机制，但更重要的还是其带来的负面作用即自我损害因素^[3-4]。据报道，这种自我损害因素的机制属于机体内各分子通路间的主动性反应，且可持续到损伤后几小时甚至几天，具备可逆性^[5-6]。因此，抑制继发性损伤是治疗脊髓损伤的重要靶点，而其最重要的起始反应是机体的炎症因子释放。炎症因子中，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)被认为可以上调其他炎症因子的产生，在局部炎症放大中发挥重要作用^[7-8]。

实验前期研究所采用的治疗药物依那西普(Etanercept，ET)，作为一种重组的人可溶性肿瘤坏死因子受体蛋白，能够竞争性地与肿瘤坏死因子α结合，阻断肿瘤坏死因子α和细胞表面肿瘤坏死因子受体结合，从而在体内对肿瘤坏死因子α介导的炎症反应有显著抑制作用^[9]。但该药物在脊髓损伤治疗上的研究才刚刚起步，且治疗8周后大鼠下肢功能较正常对照组仍有明显差距。其主要原因在于脊髓损伤后大量神经元缺失，无法建立新的突触联系，从而导致中枢神经系统损伤的功能难于恢复。因此，有必要寻找更多的治疗手段提高脊髓的自身修复能力。

由于脊髓内的神经干细胞自身的修复能力极为有限，而利用神经干细胞增殖和分化的特性，通过移植神经干细胞来实现变性坏死区神经的修复，无疑具有巨大的理论和临床应用价值^[10-12]。它将为治疗严重的脊髓损伤疾病带来一个全新概念的治疗途径。虽然神经干细胞移植在临床应用中需要解决的问题还很多，但对脊髓损伤这种难治性疾病而言，干细胞移植无疑是一种行之有效的方法^[13]。然而细胞移植在治疗脊髓损伤过程中，由于移植神经干细胞在缺乏外源性营养支持的情况下，移植治疗脊髓损伤的效果较差^[14-15]。神经干细胞移植到受损的成年哺乳动物脊髓内，会分化为胶质细胞参与胶质瘢痕的形成，仍无法恢复受损的神经。酪氨酸激酶C(tyrosine kinase C，TrkC)是神经细胞表面神经营养因子的受体，有研究报道TrkC基因修饰的神经干细胞能更好地向神经元分化^[16]。

综上，抑制炎症联合应用神经干细胞移植等手段综合治疗，提高脊髓损伤的治疗效果，是目前亟待解决的关键问题。实验早期应用Etanercept联合TrkC基因修饰神经干细胞移植，观察大鼠脊髓损伤治疗前后运动功能恢复情况，比较联合治疗与单一治疗的疗效。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2015年10月至2016年10月在中山大学附属第一医院完成。

1.3 材料

实验动物：孕13.5 d的SD大鼠2只，用于提取所需神经干细胞，清洁级成年健康雌性SD大鼠60只，体质量200-220 g，均由中山大学动物实验中心提供，动物许可证号SCXK(粤) 2013-0029。实验经中山大学附属第一医院医学伦理委员会审批通过(伦审[2014]A-025号)。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞的体外分离培养 水合氯醛麻醉处死孕鼠后，将其浸入体积分数70%乙醇中约10 min，在超净工作台中取出胎鼠。预冷的D-hank溶液漂洗两三次，在光学显微镜下定位前脑海马组织，切取后移至培养皿，切碎漂洗，体积分数0.25%胰蛋白酶消化后将悬液移到200目细胞筛上，缓慢滴下，滤过入离心管，室温下以1 000 r/min转速离心5 min，弃上清，再将提取的细胞用DF培养基洗涤2次。配制DF为基础液加入神经营养因子EGF及FGF2等的干细胞培养液，将细胞重悬，利用细胞计数板细胞计数，按每5 mL培养基2×10⁶个细胞的浓度把细胞接种于25 cm²的T25培养瓶中。将细胞培养箱设定为37 ℃，体积分数5%CO₂，T25放置在培养箱内培养，两三天半量换液，根据细胞数量传代，一般每隔8 d可传代1次。

1.4.2 利用慢病毒转染技术构建高表达TrkC基因的神经干细胞(TrkC-NSC) 构建pLVX-IRES-Neo-TrkC-IRES慢病毒(lenti-virus)简写为LV-TrkC (上海吉凯基因提供技术)。传代至第3代的神经干细胞培养至第7天取出后，采用体积分数0.05%的胰蛋白酶消化，吹散成较小的细胞团或单细胞悬液，接种至24孔板，继续放置在培养箱中培养。培养4-6 h后，将细胞按照MOI值为0(空白对照)，1，5，10，15，20加入病毒工作液，每个滴度的病毒加进6个孔转染神经干细胞。确定最佳MOI后(转染率达到80%时病毒和细胞数量的比值)，转染成功后加入嘌呤霉素，筛选出高表达TrkC基因的神经干细胞。

1.4.3 脊髓损伤动物模型的构建及干预 大鼠被随机分为5组，假手术组，脊髓损伤组(OP组)，单纯Etanercept治疗组(ET组)，单纯TrkC-NSC移植组(NSC组)，Etanercept联合TrkC-NSC移植组(NSC+ET组)，每组10只。

模型构建：大鼠用10%水合氯醛腹腔注射，剂量为3.5 mL/kg，建立脊髓横断损伤模型，具体脊髓损伤方法见实验前期发表文献^[17]。对于假手术组，椎板切除后不损伤脊髓。

干预：①对于NSC+ET组，行脊髓损伤并TrKC-NSC移植后逐层缝合并关闭伤口，术后1 h腹腔注射剂量为5 mg/kg的Etanercept；②ET组行脊髓损伤并在术后1 h腹腔注射5 mg/kg的Etanercept；③NSC组行脊髓损伤并TrKC-NSC移植，在术后1 h腹腔注射1 mL生理盐水；④OP组行脊髓损伤并在术后1 h腹腔注射1 mL生理盐水；⑤假手术组椎板切除后不损伤脊髓，在术后1 h腹腔注射1 mL生理盐水。建模成功后，对于需要细胞移植的大鼠，将预装神经干细胞(1× 10¹¹ L^-1) 10 μL的2 mm×2 mm×2 mm明胶海绵置入脊髓横断空隙。各组大鼠在处理后饲养在SPF级生物饲养室内，均给予青霉素5×10⁴ U/(kg·d)和庆大霉素12 mg/(kg·d)连续肌注 3 d。每日对损伤后的大鼠进行膀胱挤压排尿护理两三次。

1.4.4 诱发电位检测和BBB功能学评分 损伤后28 d将各组大鼠麻醉，使用立体定位仪固定。备皮消毒暴露颅骨，定位前囟(靠颅骨前部十字交叉处)，以前囟为原点，参考大鼠脑立体定位图钻孔，暴露脑的感觉运动皮质，将刺激电极放置于冠状线左中央点C₃或右中央点C₄位置，另外暴露坐骨神经将记录电极置于大鼠坐骨神经处。刺激强度35 V，记录诱发电位图。为评价不同组大鼠脊髓损伤后的后肢运动功能恢复情况，实验对大鼠损伤后3，7，14，21，28 d的后肢功能进行了评估，大鼠后肢运动功能评价采用Basso，Beattie，Bresnahan(BBB)后肢评分方法^[17]。将动物置于开放的平台上，使其可自由爬行，躯干，后肢和尾部的动作均由3名不同的观察者评估，这3名观察者未参与大鼠的手术或处理，且评分分别记录。

1.4.5 Western Blot检测 为测定蛋白的表达情况，损伤后28 d各组大鼠测量完诱发电位和BBB评分后麻醉，取出以损伤处为中心5 mm头端和5 mm尾端这一段脊髓，取出后即刻迅速放入液氮中保存。随后将提取的脊髓组织用剪刀剪成小组织块后置入BioMasher组织细胞匀浆化粉碎机中，以RIPA溶液溶解。按常规方法提取蛋白样品，保存在-80 ℃超低温冰箱内。按照BCA法测定处理后脊髓组织样品的蛋白浓度，决定每孔上样品的蛋白量，常规一抗二抗孵育后，在FluorChem^TM 8000系统中成像并拍照记录。将组织蛋白灰度值定量后分别与β-actin的蛋白灰度值进行比较，作为半定量数据，数据采用ImageJ version 1.32 (NIH，USA)软件进行分析。

1.4.6 免疫荧光染色 大鼠麻醉后PBS灌注，40 g/L多聚甲醛灌注固定，灌注成功后，取T₈_-₁₂节段的脊髓置入40 g/L多聚甲醛溶液内固定24 h，然后分别放入15%和30%蔗糖溶液中各24 h梯度脱水。将脊髓组织取出后由OCT包被，每个时间点各取3只大鼠脊髓组织切片。用课题组前期文章所述方法进行免疫荧光染色^[18-19]，在荧光显微镜下观察并拍照。随机抽取脊髓损伤区域的组织切片3张不同位置切片，每张取9个不同的非重叠视野，荧光显微镜下拍照记录，利用Image Pro Plus软件进行免疫荧光强度分析，统计和对比。

1.4.7 尼氏染色 标本前期处理同上述免疫荧光染色方法处理，冰冻切片贴于预先用明胶处理过的载玻片上，空气中放置一两天自然晾干；切片浸于体积分数100%氯仿中约30 min，之后浸于体积分数100%丙酮中约15 min；于体积分数100%无水乙醇30 s，95%乙醇30 s，70%乙醇30 s，双氧水清洗3次；体积分数1%焦油紫染色10 min，dd Water清洗3次；梯度水乙醇脱水；二甲苯透明后中性树胶固封。

1.4.8 电镜检测和甲苯胺蓝染色 将各组大鼠按上述方法进行心脏灌注固定处理，固定液加用体积分数2.5%戊二醛和2.5%的多聚甲醛，后采用体积分数1%四氧化锇溶液固定2 h。固定组织需将蛛网膜迅速剥离并切成1 mm×1 mm×1 mm小块。乙醇梯度脱水后，用环氧树脂包埋置于60 ℃，聚合后冷却。超薄切片机制片，乙酸双氧铀和枸橼酸铅染色，电镜下观察脊髓组织的髓鞘超微结构。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠术后各时间点BBB评分；②各组大鼠术后28 d运动诱发电位潜伏期和振幅；③各组大鼠术后28 d脊髓组织标本免疫印迹、免疫组织化学、尼氏染色及透射电镜观察结果。

1.6 统计学分析 符合正态分布的计量资料使用x(_)±s来表示，数据按照SPSS 17.0进行统计，两组间比较使用t 检验，多组比较采用单因素方差分析及Bonferroni检验进行分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

神经干细胞移植治疗脊髓损伤目前是研究的热点，这一策略可刺激神经的可塑性，修复补充神经元的丢失，并刺激脊髓损伤大鼠的运动功能恢复^[20]。然而此疗法仍存在一些不容忽视的问题，移植后神经干细胞的存活即是其中之一。损伤后的脊髓内环境对移植进入宿主体内的外源性神经干细胞的存活非常不利。由于继发性损伤后炎症反应的发生，肿瘤坏死因子α的水平升高可诱发继发性的神经细胞死亡^[21-22]。

另外，尽管神经干细胞具有多向分化能力，但移植到脊髓局部损伤处时，由于炎症因子等微环境因素，神经干细胞更多地向星形胶质细胞分化^[23]。目前一种有效的对策是在基因层面加强神经干细胞向神经元和少突胶质谱系分化的能力和生存能力^[24-25]。有学者发现，TrkC基因修饰的神经干细胞能更好地向神经元分化，生长出轴突^[16]。因此，实验利用转TrkC基因神经干细胞移植到损伤脊髓内，同时早期应用肿瘤坏死因子α拮抗剂Etanercept，意在寻求一种脊髓损伤后神经元网络修复的有效治疗途径。Etanercept特异性结合在肿瘤坏死因子三聚体的3个受体结合位点中的2个，完全抑制了肿瘤坏死因子α与肿瘤坏死因子细胞膜受体肿瘤坏死因子受体的结合^[2-27]。在实验以往研究中，实验曾采用肿瘤坏死因子α拮抗剂Etanercept在脊髓损伤后1 h腹腔注射治疗大鼠脊髓损伤，结果表明Etanercept可以抑制脊髓损伤后的继发性组织损害，可以促进部分后肢功能恢复^[9]。而实验的目的即在于检测Etanercept早期应用后是否可以通过促进移植TrkC-NSC的存活，从而促进大鼠脊髓组织修复，髓鞘再生，神经轴突再生，进而达到运动功能更好的恢复。

实验的结果显示脊髓损伤后早期应用Etanercept联合TrkC-NSC移植治疗可达到促进髓鞘再生和神经轴突再生，从而促进后肢运动功能恢复的效果，再生和恢复程度优于单独治疗手段。以往研究中也有学者曾使用过炎症抑制剂比如FK-506或者环孢素A联合NSC移植治疗脊髓损伤^[28-29]。有研究报道损伤后应用环孢素A并不能减少脊髓组织损伤，所恢复的后肢运动功能也十分有限^[30]。

FK-506可以有效抑制中枢神经系统的神经元细胞凋亡，并可促进移植进宿主的人神经前体细胞的远期存活^[29]。但该药物具有不容忽视的毒副作用，且该药物在每名患者个体体内的药物动力学和药效学变异性比较大^[31-32]。Etanercept是一种毒性更低的重组融合蛋白，已被广泛用于治疗风湿性关节炎和强直性脊柱炎，但关于脊髓损伤的治疗仍刚刚起步^[9^，^33]。

实验的电镜结果显示损伤后28 d，有髓鞘包绕的轴突数目和比率在联合治疗组中最高，Etanercept促进了脊髓损伤后大鼠神经轴突的髓鞘再生，可能的原因有：①减少了脊髓内固有少突胶质细胞的凋亡；②移植的TrkC-NSC存活增加，分泌神经营养因子，如脑源性神经营养因子，神经生长因子及NT-3等^[34-37]；③由于Etanercept促进了移植进宿主体内的TrkC-NSC分化为成髓鞘功能的少突胶质细胞。也可能由上述2种或多种机制共同作用，脊髓损伤后的髓鞘再生的可能机制有待于进一步深入研究验证。

另外，实验观察对比了单纯TrkC-NSC移植或单纯Etanercept注射以及联合治疗组的大鼠BBB运动功能评分，发现联合治疗组有更好的运动功能恢复。在损伤后4周联合治疗组的BBB评分可达到(9.56±1.35)分，这种恢复水平与其他研究基本一致^[19^，^36]。运动诱发电位检测结果也显示，NSC+ET组有最高的波幅而且只有该组的潜伏期较脊髓损伤组有所恢复。

早期应用Etanercept对肿瘤坏死因子α拮抗后可改善脊髓损伤后的局部微环境^[33]。实验推测，幸存的NSC可分泌神经营养因子，某些分子通路激活下分化为少突胶质细胞或(和)神经元，帮助重建神经连接，进而得到更好功能恢复。实验在结果中观察到包括NF200和synapsinⅠ在内的几种重要神经再生标志物的表达显著上调，而且免疫荧光可见神经丝在脊髓损伤处生长，各组治疗方式均可促进轴突再生，而NSC+ET组促进作用更为明显，表明脊髓损伤早期应用Etanercept联合TrkC-NSC治疗可有效的促进神经再生和轴突生长。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

肿瘤坏死因子α拮抗剂联合酪氨酸激酶C基因修饰神经干细胞移植治疗脊髓损伤

Tumor necrosis factor-alpha antagonist combined with tyrosine kinase C gene- modified neural stem cell transplantation for spinal cord injury

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