甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.009

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (21): 3332-3337.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.21.009

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甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响

李社芳¹，苗灵娟²，李宁³，梁鹤³，任德启⁴，郭健⁴

¹河南中医药大学第一临床医学院内科学科，河南省郑州市 450000；²河南省中医药研究院附属医院高血压科，河南省郑州市 450004；³河南中医药大学基础医学院，河南省郑州市 450046；⁴河南中医药大学第二临床医学院，河南省郑州市 450008

修回日期:2017-02-09 出版日期:2017-07-28 发布日期:2017-08-02
作者简介:李社芳，女，1970年生，汉族，博士，副教授，主要从事中医脑病研究。
基金资助:
河南省医学科技攻关计划项目(122300410529)

Effect of liquiritin on the proliferation of neural stem cells from the brain of mouse embryos

Li She-fang¹, Miao Ling-juan², Li Ning³, Liang He³, Ren De-qi⁴, Guo Jian⁴

¹Department of Internal Medicine, First Clinical College, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China; ²Department of Hypertension, Affiliated Hospital, Henan Provincial Institute of Chinese Medicine, Zhengzhou 450004, Henan Province, China; ³Basic Medical College, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, Henan Province, China; ⁴Second Clinical College, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, Henan Province, China

Revised:2017-02-09 Online:2017-07-28 Published:2017-08-02
About author:Li She-fang, M.D., Associate professor, Department of Internal Medicine, First Clinical College, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
Supported by:
the Medical Tackle Key Plan of Henan Province, No. 122300410529

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
神经干细胞：是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞，主要分布在胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统中并存在于胚胎和成体中枢神经系统的多个部位中。神经干细胞具有自我更新、多向分化、对称和不对称等生物学特性。神经干细胞的内在分化程序、细胞外基质、黏附分子及细胞间的相互作用等都与其增殖、凋亡及分化有着密切关系。
甘草苷的功效：甘草苷是甘草的的主要活性成分，属于黄酮类化合物，其有很强的药理活性，是重要的食品添加剂，可作为甜味剂和解毒剂。近来有文献报道，甘草苷对神经细胞有保护和营养作用，如甘草苷对大鼠原代神经细胞的损伤具有保护作用，对原代海马神经元有营养作用，能够促进神经生长因子诱导的PC12神经细胞轴突的生长并对PC12神经细胞有营养作用，甘草苷还能抑制Aβ25-35及谷氨酸的神经毒性，并特异性抑制乙酰胆碱酯酶活力，对人神经母细胞瘤细胞有保护作用。

摘要
背景：甘草苷对神经细胞有保护和营养作用，但甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响尚未见报道。
目的：研究不同质量浓度甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响。
方法：从孕14 d昆明白小鼠胚胎脑组织中分离出神经干细胞并培养，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞，利用qRT-PCR检测神经干细胞特异性基因表达，MTT法绘制神经干细胞生长曲线。取生长旺盛的神经干细胞，分别以0(对照)，1，2，4，8 g/L的甘草苷干预，干预48 h后，MTT法检测细胞增殖。
结果与结论：①培养第5天时，所有单个的神经干细胞全部聚集成球，随着时间的延长，细胞球体积越来越大，细胞球融合成更大的细胞团；②免疫细胞化学鉴定显示，100%的神经干细胞球呈巢蛋白阳性表达；③qRT-PCR检测显示，神经干细胞巢蛋白阳性表达较强，不表达神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白；④神经干细胞刚开始生长缓慢，处于生长缓慢期，第二三天起，细胞增殖迅速，进入指数生长期；第4天后，细胞增殖逐步减缓，细胞整体进入生长平台期；⑤2，4，8 g/L甘草苷组细胞增殖明显高于对照组(P < 0.05)，并且随着甘草苷质量浓度的升高，神经干细胞增殖速度逐渐升高；⑥结果表明，2-8 g/L甘草苷能促进小鼠胚胎脑神经干细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8631-3600(李社芳)

关键词: 干细胞, 胚胎干细胞, 神经干细胞, 胚胎脑神经干细胞, 神经系统, 中草药, 甘草苷, 神经保护, Nestin, 增殖

Abstract:

BACKGROUND: Liquiritin has the protective and nutritive effects on neural stem cells. However, the effect of liquiritin on neural stem cells from the brain of mouse embryos remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of different concentrations of liquiritin on the proliferation of neural stem cells from the brain of mouse embryos.
METHODS: Neural stem cells were separated from the embryonic brain of Kunming white mice at the gestational age of 14 days. The identification of embryonic neural stem cells was performed by immunocytochemistry method. The expression of neural stem cells-special genes was determined by qRT-PCR. The cell growth curve was drawn and proliferation of embryonic neural stem cells treated with 0, 1, 2, 4 or 8 g/L liquiritin for 48 hours was measured by MTT assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) When cultured at day 5, all individual neural stem cells gathered together into neurospheres; with the extension of time, the neurospheres were enlarged, and gathered together into larger cell masses. (2) Results from immunocytochemistry showed that all the floating neurospheres was nestin-positive. Data from qRT-PCR revealed a higher expression of nestin mRNA, but there was no expression of neuron-specific enolase and glial fibrillary acidic protein in the neural stem cells. (4) The growth of neural stem cells was slow at the beginning. After 2-3 days, the cell proliferation quickly entered the exponential phase. After 4 days, the cell proliferation gradually slowed down, and the overall cell growth entered into the platform period. (5) The cell proliferation after treatment with 2, 4 or 8 g/L liquiritin was faster than that in the control group (0 g/L). To conclude, 2-8 g/L liquiritin could increase the proliferation of neural stem cells from the brain of mouse embryos.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Drugs, Chinese Herbal, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李社芳，苗灵娟，李宁，梁鹤，任德启，郭健. 甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(21): 3332-3337.

Li She-fang, Miao Ling-juan, Li Ning, Liang He, Ren De-qi, Guo Jian. Effect of liquiritin on the proliferation of neural stem cells from the brain of mouse embryos[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(21): 3332-3337.

图/表（结果） 1

2.1 小鼠胚胎脑神经干细胞分离及培养结果 将分离后的细胞使用无血清培养基培养，1 d后少部分细胞开始聚集成球，形成的神经球大小不等，形状不规则。生长至2-5 d后，发现神经球数目不断增多，体积也不断增大，大多数神经球呈圆形或椭圆形，并且分散悬浮，大部分神经球外围细胞大小较均匀，生长状态良好。如图1所示，第5天时，几乎所有单个的脑神经干细胞全部聚集成球。随着时间的延长，细胞球的体积越来越大，细胞球融合成更大的细胞团。

2.2 小鼠胚胎脑神经干细胞的鉴定 利用免疫细胞化学技术，以巢蛋白为检测标记，对分离得到的小鼠脑神经干细胞进行鉴定，结果显示神经干细胞克隆球呈现巢蛋白阳性，且100%的神经干细胞球呈阳性表达。另外，运用qRT-PCR技术又进一步对小鼠胎脑神经干细胞相关基因的表达进行了验证，结果显示分离出来的神经干细胞巢蛋白阳性表达较强，几乎不表达神经元特异性烯醇化酶及神经胶质纤维酸性蛋白(图2)。

2.3 小鼠胚胎脑神经干细胞的生长曲线 如图3所示，分离到的神经干细胞在刚开始生长缓慢，处于生长缓慢期。第二三天起，细胞增殖迅速，细胞进入指数生长期，第4天后细胞增殖逐步减缓，细胞整体进入生长平台期。

2.4 甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响 选用1，2，4，8 g/L的甘草苷处理小鼠胚胎脑神经干细胞，48 h后观察其对干细胞增殖情况的影响。MTT法检测结果显示，与对照组相比，1 g/L的甘草苷对胚胎神经干细胞的增殖无明显影响，而随着甘草苷质量浓度的升高，神经干细胞的增殖速度明显升高，且高于对照组(P < 0.05)，见图4，说明甘草苷能够促进小鼠胚胎脑神经干细胞的增殖。

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引言

神经干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞，主要分布在胚胎和成年哺乳动物中枢神经系统中并存在于胚胎和成体中枢神经系统的多个部位中^[1]。神经干细胞具有自我更新、多向分化、对称和不对称等生物学特性^[2]。神经干细胞的内在分化程序、细胞外基质、黏附分子及细胞间的相互作用等都与其增殖、凋亡及分化有着密切关系^[3]。在早期的神经系统发育中，神经干细胞的主要生物学特征是增殖。诸多的因素，如高血糖、脂肪酸、低氧、药物等会干扰神经干细胞的增殖，对中枢神经系统造成严重影响^[4-5]。另一方面，还有些药物会对其产生保护作用，如谷维素、辅酶A、维生素B1及B12、脑神经生长素、细胞色素c、胞二磷胆碱等^[6-7]。近年来，天然药物对神经细胞的保护作用也逐渐受到关注^[8-10]。

由于其重要的发育分化机制和潜在的临床应用价值，神经干细胞已成为生命科学研究的热点之一。神经干细胞存在于哺乳动物脑内，并且具有不断分裂增殖和多分化潜能的生物学特性，可通过定向诱导分化为某种特异神经元以替代损伤神经元，有效治疗中枢神经系统疾病^[11-12]。因此，进一步探索神经干细胞分离及培养的技术，寻找影响其增殖及分化的外在因素，完善神经干细胞的生物学特性及神经系统的发育机制，无疑为神经再生和功能重建带来巨大的希望^[13-14]。

甘草是豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza)的植物，甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)、光果甘草(Glycyrrhia glabra L.)等的干燥根及根茎。研究证明，甘草对人体有诸多作用，如补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛及调和诸药等。甘草苷是甘草的的主要活性成分，属于黄酮类化合物，其有很强的药理活性^[15-16]。甘草苷还是重要的食品添加剂，可作为甜味剂和解毒剂，其增香效能很强，常用于乳制品、蛋制品、巧克力等，由于其具有较好的解毒作用，也常用于酱制品及腌渍食物^[17-19]。近来有文献报道，甘草苷对神经细胞有保护和营养作用，如甘草苷对大鼠原代神经细胞的损伤具有保护作用，对原代海马神经元有营养作用，能够促进神经生长因子诱导的PC12神经细胞轴突的生长并对PC12神经细胞有营养作用，甘草苷还能抑制Aβ25-35及谷氨酸的神经毒性，并特异性抑制乙酰胆碱酯酶活力，对人神经母细胞瘤细胞有保护作用^[20-22]。

实验观察甘草苷对体外培养小鼠胎胎脑神经干细胞增殖的影响，对于解决移植细胞的来源和生存提供可能的帮助，也为进一步的体内实验提供理论支持，同时也为神经性疾病治疗提供可能的指导。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2015年10月在河南中医药大学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：8-10周龄健康昆明小鼠，购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK(豫)2013。按照2雌鼠、1雄鼠的比例合笼，发现阴道栓当天记为妊娠第0天，于孕后14 d取出用于实验。

实验试剂与药物：甘草苷购自中国药品生物制品检定所，使用PBS配成母液，无血清培养基配成工作浓度， -20 ℃的冰箱保存备用；Nestin单克隆抗体(英国Abcam)；DMEM/F12细胞培养液(美国Hyclone)；MTT、B27添加剂、碱性成纤维细胞生长因子(美国Sigma-Aldrich)；生物素化IgG抗体、DAB显色液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Trizal试剂(美国Invitrogen)；反转录试剂盒、Real-time PCR试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠胚胎脑神经干细胞的分离及培养^[23]取妊娠的昆明白小鼠，脱颈处死，于体积分数75%乙醇中浸泡消毒。将灭菌后的小鼠放在超净工作台上，并对孕鼠腹部进行剥离，找到子宫将宫颈部切断，得到双侧串珠样含胚胎的子宫体，放入PBS中。将小鼠胚胎体进行剥离，取出部分大脑半球放入DMEM/F12无血清培养基中。将取出的大脑组织进行机械吹打，达到浑浊液，过200目不锈钢滤网，制作单细胞悬液。将细胞离心收集，用含2% B27及20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基使细胞重悬。将6×10⁸ L^-¹的细胞接种至培养瓶中，饱和湿度，温度37 ℃、体积分数5%CO₂进行培养，1 d后更换培养瓶，并将贴壁的神经元和神经胶质细胞弃去。每3 d对培养液进行更换，7 d进行传代1次。

1.4.2 小鼠胚胎脑神经干细胞的传代 在原代培养1周后，发现有大小一致的神经干细胞球长满细胞培养瓶时进行传代。轻轻吹打瓶底，使所有的神经球浮起来，并将培养液移入离心管中，去除单个细胞，离心收集细胞，用含2%B27及20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基重悬细胞，过滤，得到单细胞悬液，继续培养。

1.4.3 神经干细胞的免疫细胞化学鉴定 首先将灭菌过的盖玻片放入六孔培养板中，用多聚赖氨酸对盖玻片进行包被。取出第3代细胞培养液，轻轻吹打细胞球，使其均匀悬浮。滴取一二滴培养液于包被过的盖玻片上，饱和湿度，温度37 ℃、体积分数5%CO₂继续培养，待细胞贴壁后，用PBS对盖玻片进行洗涤，并用40 g/L多聚甲醛对细胞进行固定。将固定后的细胞用体积分数3%H₂O₂处理，室温静置10 min，PBS洗涤3次。用山羊血清封闭半小时后，加入Nestin单克隆抗体，4 ℃过夜，PBS清洗3次，加入生物素化的IgG抗体，4℃反应过夜，PBS清洗3次，再加入ABC复合物，室温孵育30 min，清洗后DAB显色。

1.4.4 qRT-PCR检测神经干细胞特异性基因 离心收集生长旺盛的小鼠胚胎脑神经干细胞，加入1 mL Trizol试剂，使细胞充分裂解。再加入200 μL氯仿，充分震荡，静置15 min后，离心收集上清，加入等体积的异丙醇，静置15 min后收集沉淀，使用体积分数75%乙醇清洗，DEPC水溶解收集到的RNA。使用Taqman反转录试剂盒合成cDNA，将cDNA加入到Taqman Real-time PCR试剂盒，在实时PCR仪上进行定量。以β-actin为内参基因，采用2^-^??Ct法分析神经干细胞特异性基因巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白的表达量。

1.4.5 MTT法绘制神经干细胞生长曲线 取生长旺盛的第3代神经干细胞，调整细胞浓度为6×10⁸ L^-¹，接种至96孔板中，每孔200 μL。每天相同时间检测1次，每孔加入5 g/L MTT液20 μL，在培养箱中孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，振荡至蓝色颗粒全部溶解，以490 nm波长处读取各孔的A值，绘制细胞的生长曲线。

1.4.6 甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响^[24] 用培养基调整第3代神经干细胞细胞浓度为6×10⁸ L^-¹，接种至96孔板中，每孔200 μL，分别以0，2，4，6，8 g/L的甘草苷处理细胞，每个浓度设置5个重复。饱和湿度，温度37 ℃、体积分数5%CO₂继续培养，以MTT法检测细胞增殖情况。

1.5 主要观察指标 建立小鼠胚胎脑神经干细胞的体外培养模型，观察神经干细胞的体外生长特性，探讨甘草苷对小鼠胎脑神经干细胞增殖的影响。

1.6 统计学分析 使用SPSS 15.0软件进行统计学分析，所有实验至少进行3次独立重复。实验数据以x(_)±s表示，数据比较使用t 检验或单因素方差分析。

讨论

神经干细胞的发现和确立对神经系统的发育和神经再生的设想给予了希望，随着神经干细胞研究的不断丰富与充实，人们对神经干细胞可能给临床神经科学带来应用寄予厚望。目前人们对神经干细胞的关注主要集中在体外诱导分化的神经干细胞移植能够应用于治疗脑损伤和衰变后产生的神经功能障碍的重建和康复，以及以干细胞或神经前体细胞为载体将特异性基因导入大脑能够治疗恶性肿瘤或提供神经营养物质及神经递质^[25-28]。但是，所有关于神经干细胞的巨大应用前景都面临着一个前提工作，就是神经干细胞的鉴定检测与纯化富集，以及神经干细胞的体外培养。

人们对脑内神经干细胞的认识是从研究胚胎脑发育开始的。有研究报道，从孕13 d的大鼠胚胎脑隔区取出部分细胞单个培养，可观察到这些细胞能够发育成神经元和神经胶质细胞^[29]。还有研究者发现约20%的胚胎脑皮质前体细胞可分化为神经元和少突胶质细胞^[30]。单独培养大鼠胚胎脑皮质先祖细胞，其可分化为神经元、少突胶质细胞及星形胶质细胞，所有的神经组织细胞类型^[31-32]。这些前期的研究工作证明在大脑的发育过程中，存在着能向多方向发展的先祖细胞。

巢蛋白，也称神经上皮干细胞蛋白，属于中间丝状蛋白，是神经外胚层标记物，常作为脑组织前体细胞的标记物^[33]。神经干细胞可特异性地表达神经上皮干细胞蛋白。神经元特征性蛋白为神经元烯醇化酶，神经胶质细胞特征性蛋白为胶质纤维酸性蛋白，而巢蛋白阳性细胞往往缺乏成熟神经细胞的标记物，是脑组织内具有分化增殖潜能的神经细胞前体细胞^[34]。研究采用孕14 d的昆明白小鼠，从胚胎中取出脑组织，将取出的大脑组织进行机械吹打，制作单细胞悬液，再利用DMEM/F12无血清培养基，获得小鼠胚胎脑神经干细胞，进一步的免疫细胞化学鉴定发现，我们分离得到的脑神经干细胞球呈现巢蛋白阳性，且100%的神经干细胞球呈阳性表达。再使用qRT-PCR检测mRNA水平上神经干细胞特异性基因巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白的表达，发现分离出来的神经干细胞巢蛋白阳性表达较强，几乎不表达神经元特异性烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白，结果充分肯定了分离得到的小鼠胚胎脑神经干细胞，利用这些细胞可以更加准确深入地对神经干细胞生物学特性进行研究。

近年来，越来越多的研究报道了天然药物对神经细胞的保护作用，这些药物能够促进细胞的增殖，抑制细胞的凋亡，并对损伤细胞有促进恢复作用^[35-36]。葛根芩连汤抗神经细胞损伤活性成分对L-谷氨酸损伤神经细胞具有较好的保护作用，进一步的鉴定发现葛根芩连汤的主要活性成分是大豆苷、3’-甲氧基大豆苷、芹糖甘草苷、白杨素-6-C-L-阿拉伯糖-8-C-D-葡萄糖苷、芹糖异甘草苷、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷及汉黄芩苷，说明了这些活性成分具有神经细胞保护作用^[8]。黄连解毒汤能够促进H₂O₂、Glu损伤人神经母细胞瘤细胞的增殖，对神经细胞有保护作用，起保护作用的有效成分可能是栀子苷^[37]。葛根素是中药葛根的有效成分之一，能够抑制脑细胞凋亡，保护神经细胞，还能提高神经元抵抗损伤的能力，可应用于治疗脑损伤及神经退行性疾病^[38-39]。牛磺酸可通过活化Caspase-9抑制海马神经元细胞的凋亡，对神经系统有保护作用^[40-49]。

研究首先从孕14 d的小鼠胚胎脑神经干细胞中分离得到了脑神经干细胞，使用不同质量浓度的甘草苷处理小鼠胚胎脑神经干细胞48 h后，发现低质量浓度的甘草苷对胚胎神经干细胞的增殖无明显影响，而随着甘草苷质量浓度的升高，胚胎干细胞的增殖速度明显升高，提示甘草苷能够促进小鼠胚胎脑神经干细胞的增殖，对神经干细胞有营养和保护作用，这对神经干细胞的研究提供了基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

甘草苷对小鼠胚胎脑神经干细胞增殖的影响

Effect of liquiritin on the proliferation of neural stem cells from the brain of mouse embryos

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