1.1 设计 随机分组对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2014年6月至2015年12月在西南医科大学口腔医学院口颌面修复重建与再生实验室完成。
1.3 材料
实验动物:12周龄雌性SD大鼠20只,体质量(254±22) g,CV级,购于西南医科大学基础医学部实验动物中心,动物许可证号:SCXK(川)2013-17。将20只大鼠随机分为实验组与对照组,每组10只。
仪器:电动外科环锯系统(韩国MTC);Micro-CT(GE Health Care Ctrl,USA);OPsmex chemix -180型全自动生化分析仪(日本Sysmex);显微镜及成像系统(日本奥林巴斯)。
1.4 实验方法
动物建模:实验组大鼠卵巢切除采用背部切口。先用1%戊巴比妥(40 mg/kg)对大鼠进行腹腔麻醉[10]。麻醉显效后采用俯卧位,置于恒温固定台上,四肢及头部固定良好。于背部正中线旁开1.5 cm,双侧肋缘下1.5 cm处为中心,1.5 cm为半径常规备皮,术区消毒,盖无菌铺单,然后用11号手术刀以背部后正中线旁开1.5 cm,双侧肋缘下1 cm 作切口,切口长1.0-1.5 cm,切开皮肤后,钝性分离腹肌、腹膜后进腹。找到脂肪包裹呈粉红色桑葚状的卵巢(图1),轻柔分离卵巢下输卵管与脂肪,并在子宫角上方的输卵管狭部作丝线结扎,结扎后用眼科剪剪去卵巢(图2),然后检查卵巢是否切除干净及子宫角有无出血,修整后轻柔送回腹腔内,缝合肌肉、筋膜,并间断缝合皮肤,撒以青霉素粉[11-12]。用同样的方法切取对侧卵巢,缝合伤口。去势术
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后12周,动物在全麻醉下,行颅骨极量缺损[13]。颅骨术区常规备皮、消毒,铺无菌孔巾,先确定头盖骨正中线,然后再沿其纵向作长约2 cm的皮肤切口,随后钝性分离皮肤,按“T”字形切开并剥离骨膜,使颅骨暴露。先用直径8 mm电动外科环锯切,再用金刚砂车针缓慢磨除,先快后慢,均匀用力,整个磨除过程中需用无菌生理盐水润湿降温[14],手术过程中要保护好硬脑膜及其下面大血管(图3),将颅骨内外表面的骨膜一并完整切除,造出8 mm的SD大鼠颅骨极量缺损,缝合创口[9,14-19]。整个过程注意无菌操作,以防感染。
对照组大鼠假手术操作与实验组相同,但只是分别找到卵巢后,保留卵巢而摘除等质量的卵巢周围的脂肪组织,12周后颅骨极量缺损手术步骤同于实验组。
术后各组动物均饲养在正常笼中(4只/笼),适宜条件下(室温20-25 ℃、相对湿度60%-80%)[20],自由饮水、摄食,常规喂养,活体观察术后大鼠伤口愈合及生长情况。
1.5 主要观察指标
颅骨缺损愈合情况:颅骨极量缺损术后12周,分别用断头法处死两组SD大鼠,每组8只,取出两组大鼠颅骨后,固定于40 g/L多聚甲醛中作为标本,行Micro-CT扫描检查,观察两组颅骨缺损区愈合情况。
三维骨矿含量和骨密度:同时断离两组大鼠右后肢,刮尽皮肤肌肉,完整取出股骨、胫骨后,固定于40 g/L多聚甲溶液48 h到1周,储存在体积分数70%乙醇内作为标本[20],再行Micro-CT扫描,检测股骨近端和胫骨远端的三维骨矿含量和骨密度。
血清碱性磷酸酶检测:将两组SD大鼠断头取血,分离血清,按照试剂盒操作说明,利用OPsmex chemix-180型全自动生化分析仪对所取得血清进行血清碱性磷酸酶测定。
颅骨组织切片:将两组剩余大鼠并取出颅骨后固定,再进行脱钙处理,制备切片进行组织学染色(苏木精-伊红染色及Masson染色),光镜下观察并分析两组大鼠颅骨结构与形态。
1.6 统计学分析 所得数据采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析,计算结果以x±s形式表示,检验水准a=0.05,P < 0.05为差异有显著性意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程