血管新生对局灶性脑缺血再灌注后脑室下区神经干细胞增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.018

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (29): 4697-4702.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.29.018

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血管新生对局灶性脑缺血再灌注后脑室下区神经干细胞增殖的影响

李志宁¹，韩卫²，荣良群¹，龚爱平¹，吕尤¹，单君君¹，魏秀娥¹

徐州医科大学第二附属医院，¹神经内科，²检验科，江苏省徐州市 22100

修回日期:2017-05-04 出版日期:2017-10-18 发布日期:2017-11-08
通讯作者: 魏秀娥，博士，主任医师，徐州医科大学第二附属医院神经内科，江苏省徐州市 221006
作者简介:李志宁，男，1984年生，山东省菏泽市人，汉族，2012年徐州医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事缺血性脑血管病及神经干细胞的基础与临床研究。
基金资助:
“步长杯”江苏省神经病学研究基金课题(局灶性脑缺血后脑室下区细胞结构改变及NMDA受体亚单位蛋白质表达变化，2013年)；徐州市科技局课题(NMDA受体诱导血管新生调控缺血后神经干细胞的增殖、分化及机制的研究，编号：KC14SH063)

Influence of angiogenesis on neural stem cell proliferation in the subventricular zone after focal cerebral ischemia/reperfusion

Li Zhi-ning¹, Han Wei², Rong Liang-qun¹, Gong Ai-ping¹, Lv You¹, Shan Jun-jun¹, Wei Xiu-e¹

¹Department of Neurology, ²Clinical Laboratory, Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China

Revised:2017-05-04 Online:2017-10-18 Published:2017-11-08
Contact: Wei Xiu-e, M.D., Chief physician, Department of Neurology, Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China
About author:Li Zhi-ning, Master, Attending physician, Department of Neurology, Second Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221006, Jiangsu Province, China
Supported by:
the “Bu Chang Bei” Neurology Research Fund in Jiangsu Province in 2013; the Project of Xuzhou Municipal Science and Technology Department, No. KC14SH063

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
血管新生：在原有毛细血管与(或)微静脉基础上，通过血管内皮细胞增殖和迁移，从先前存在的血管处，以芽生或者非芽生的方式生成新的毛细血管。其受到促血管生成因子和抑制血管生成因子调控。各种因子的平衡，保证血管处于正常的生长状态。
脑室下区：神经系统的发育最早起始于胚胎的神经管和神经嵴，其神经管在发育后期发育成脑室系统和脊髓中央管，管腔内面覆盖的细胞为神经上皮细胞，具有活跃的增殖和分化能力，此区域称为脑室下区，亦称为室管膜下区，在神经发生及神经损伤后修复过程中起着举足轻重的作用。

摘要
背景：血管新生可能与神经干细胞的增殖有相关性，但仍无统一观点。
目的：观察血管新生对局灶性缺血再灌注后大鼠脑室下区神经干细胞增殖的影响。
方法：成年雄性SD大鼠，随机分为正常组、假手术组、手术组、侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组、侧脑室注射生理盐水+手术组，各组再分为缺血再灌注1，3，7，14 d组，每组12只。线栓法制作局部脑缺血再灌注模型，给予相应干预措施，利用免疫组化法检测各组大鼠脑室下区Nestin的表达，Real time-PCR法检测各组大鼠脑室下区vWF mRNA的表达。
结果与结论：①缺血再灌注后脑室下区vWF mRNA、Nestin阳性表达增加；在缺血后7 d，vWF mRNA、Nestin阳性表达均达高峰，提示局灶性缺血再灌注后大鼠脑室下区神经干细胞的增殖与血管新生存在时间相关性；②侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组vWF mRNA、Nestin阳性表达较手术组及侧脑室注射生理盐水+手术组明显增高，提示缺血再灌注后血管新生可促进大鼠脑室下区神经干细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8191-903X(李志宁)

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 线栓法, 局灶性脑缺血, 脑室下区, 细胞增殖, 血管新生

Abstract:

BACKGROUND: The angiogenesis may be related to the proliferation of neural stem cells, but there is still no unified view.
OBJECTIVE: To observe the influence of angiogenesis on neural stem cell proliferation in the subventricular zone of rats after focal cerebral ischemia/reperfusion.
METHODS: Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group, sham group, vascular endothelial growth factor (VEGF)+cerebral ischemia/reperfusion group, normal saline (NS)+cerebral ischemia/reperfusion group. The injection was done via the lateral cerebral ventricle. Then, each group was subdivided into four groups (1, 2, 7, 14 days after ischemia/reperfusion). Focal cerebral ischemia/reperfusion models were made by the thread method. After modeling, the corresponding intervention was given in each group. The expression changes of Nestin and vWF mRNA in the subventricular zone were detected in all groups by immunohistochemical staining and real-time PCR, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: There was a certain increase in vWF and Nestin positive expression in the subventricular zone after cerebral ischemia/reperfusion. At 7 days after ischemia, the expression of vWF mRNA and Nestin reached the peak, indicating the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone after cerebral ischemia/reperfusion is associated with the time of angiogenesis. In addition, the expression of vWF mRNA and Nestin was significantly higher in the VEGF+cerebral ischemia/reperfusion group than the other two groups, indicating angiogenesis could promote the proliferation of neural stem cells in the subventricular zone of rats after cerebral ischemia/reperfusion.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Brain Ischemia, Vascular Endothelial Growth Factors, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

李志宁，韩卫，荣良群，龚爱平，吕尤，单君君，魏秀娥. 血管新生对局灶性脑缺血再灌注后脑室下区神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(29): 4697-4702.

Li Zhi-ning, Han Wei, Rong Liang-qun, Gong Ai-ping, Lv You, Shan Jun-jun, Wei Xiu-e. Influence of angiogenesis on neural stem cell proliferation in the subventricular zone after focal cerebral ischemia/reperfusion[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(29): 4697-4702.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 实验共使用成年雄性SD大鼠240只，实验过程动物无死亡，全部纳入结果分析。

2.2 局部脑缺血再灌注后各组大鼠脑室下区vWF mRNA表达 与正常组及假手术组比较，手术组个时间点的vWF mRNA表达明显增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。在缺血1 d时，vWF mRNA表达即增加，7 d时达高峰，14 d时表达逐渐降低。缺血再灌注组各时间点vWF mRNA表达差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

2.3 局部脑缺血再灌注后各组大鼠脑室下区Nestin的表达 手术组在缺血再灌注后Nestin的表达量逐渐增高，至 7 d时达高峰，之后逐渐下降。各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。与正常组及假手术组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图1，表2。

2.4 侧脑室注射生理盐水或血管内皮生长因子大鼠脑室下区Nestin的表达 侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组及侧脑室注射生理盐水+手术组在缺血再灌注后Nestin的表达量逐渐增高，至7 d时达高峰，之后逐渐下降。各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。与手术组及侧脑室注射生理盐水+手术组比较，侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组各时间点Nestin表达量明显增加，差异有显著性意义(P < 0.05)。手术组与侧脑室注射生理盐水+手术组比较，Nestin的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2，表3。

2.5 侧脑室注射生理盐水或血管内皮生长因子大鼠脑室下区vWF mRNA的表达 侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组及侧脑室注射生理盐水+手术组在缺血再灌注后vWF mRNA的表达量逐渐增高，至7 d时达高峰，之后逐渐下降。各组间差异有显著性意义(P < 0.01)。与手术组及侧脑室注射生理盐水+手术组比较，侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组各时间点vWF mRNA表达量明显增加，差异有显著性意义(P < 0.01)。手术组与侧脑室注射生理盐水+手术组比较，vWF mRNA表达差异无显著性意义(P > 0.01)，见表4。

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引言

缺血性脑卒中是目前严重威胁人类生命、影响生活质量的主要疾病之一，尚缺乏有效的治疗手段。众多研究表明，神经干细胞具有自我增殖及多向分化潜能，能被诱导增殖及定向分化，替代或者修复受损的神经细胞^[1-3]。如何激活神经干细胞修复损伤的脑组织，已成为缺血性脑损伤治疗策略中最具潜能的发展方向。研究者多从以下2个角度进行研究：①移植外源性神经干细胞进行治疗；②对内源性神经干细胞进行干预、诱导增殖分化，恢复脑缺血后受损神经功能。虽然外源性神经干细胞的研究成果很多^[4-6]，但是存在着一些固有的问题，比如伦理道德、移植细胞来源等等。因此，深入探索内源性神经干细胞增殖分化的机制，以期提高内源性神经干细胞的再生，促进神经功能障碍的恢复，显得更加重要。

众所周知，脑室下区(subventricular zone，SVZ)是脑内最大的神经干细胞库。一直是内源性神经干细胞研究的热点区域。影响脑室下区神经干细胞增殖、分化的因素众多，如脑室下区多种细胞、细胞外基质、细胞因子。哺乳动物脑发育早期的研究显示，血管新生和神经细胞分化成熟发生的时相性和区域性分布几乎是同步的^[7]，进一步提示血管新生和神经再生可能存在密切联系。Kawai等^[8]报道，内皮细胞分泌的可溶性细胞因子能促进神经干细胞自我更新。神经干细胞和内皮细胞共培养表现对称性分裂，内皮细胞既能扩增神经干细胞，也能增强其神经元生成能力。Lu等^[9-11]研究提示缺血刺激后成年大鼠脑室下区存在血管新生现象。缺血后脑室下区神经干细胞被激活，出现增殖、分化，并向缺血区迁移聚集，缺血后脑室下区神经干细胞增殖与血管新生是否相关，鲜有报道。

实验通过制作局部脑缺血再灌注模型，侧脑室注射血管内皮生长因子后，运用免疫组化法观察缺血后Nestin的表达、Real Time-PCR法检测缺血再灌注后vWFmRNA的表达，进一步验证血管新生与脑室下区神经干细胞增殖的关系。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9月至2016年5月在徐州医科大学神经生物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠240只，体质量(230±20) g，由徐州医科大学动物中心提供。实验动物许可证号：SYXK(苏)2016-0028。所有大鼠均在同一实验室和动物中心操作和喂养，以保持喂养、光照、噪声等条件相同，减少外界干扰造成的差异。

1.3.2 主要试剂 BrdU、生物素化山羊抗小鼠IgG (Sigma，USA)；小鼠抗大鼠nestin单抗(BD Pharmingen)；小鼠抗BrdU多抗、辣根过氧化物酶标记链霉卵白素液、浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；血管内皮生长因子(Peprotech)；其他试剂为国产分析纯。

1.4 实验方法

1.4.1 局部脑缺血再灌注动物模型制备与分组 实验大鼠240只随机分为正常组、手术组、假手术组、侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组、侧脑室注射生理盐水+手术组，每组48只。参照Nagasawa法^[12]制作大鼠右侧局部脑缺血再灌注模型，假手术组大鼠尼龙线插入深度为10 mm左右，余同手术组。正常组大鼠不作任何手术处理。侧脑室注射血管内皮生长因子+手术组及侧脑室注射生理盐水+手术组均在术前60 min行侧脑室注射，各组再分为缺血再灌注1，3，7，14 d亚组，每亚组实验动物12只。

1.4.2 侧脑室注射 成年大鼠在局灶性脑缺血前60 min，固定于立体定向仪，参照大鼠脑立体定位图谱^[13-14]，于前囟-0.26 mm，旁开正中线右侧1.3 mm，在颅顶骨处钻孔，再将微量注射器针尖从背侧向腹侧下降4.0 mm，将20 μL液体(10 μmol/L 血管内皮生长因子或生理盐水)在30 min内注入右侧侧脑室，注射完毕留针20 min，缓慢拔针。

1.4.3 脑组织取材 于缺血再灌注1，3，7，14 d，给予10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，经心脏升主动脉插管，快速灌注200 mL生理盐水，直至心脏变白、右心耳流出清亮液体后，再快速灌注40 g/L多聚甲醛200 mL(pH 7.4，4 ℃)，随后慢速灌注100 mL多聚甲醛，总量约300 mL，待大鼠四肢强直、僵硬后停止灌注，立即断头取脑，选取含有侧脑室的脑块置于40 g/L多聚甲醛后固定过夜。

将脑块从后固定液中取出，水洗2 h，常规梯度乙醇脱水(体积分数为50%乙醇12 h→体积分数为70%乙醇12 h→体积分数为80%乙醇12 h→体积分数为90%乙醇12 h→体积分数为95%乙醇Ⅰ3 h→体积分数为95%乙醇Ⅱ3 h→体积分数为100%乙醇Ⅰ1.5 h→体积分数为100%乙醇Ⅱ1.5 h)，二甲苯透明(1︰1二甲苯+体积分数为100%乙醇30 min→二甲苯Ⅰ20 min →二甲苯Ⅱ2min)，浸蜡(石蜡Ⅰ20 min →石蜡Ⅱ2.5 h)，石蜡包埋。

使用石蜡切片机对相应脑段行连续冠状切片，片厚6 μm，45 ℃水浴展片，待脑片充分展开后用多聚赖氨酸挂胶的防脱载玻片捞片，用铅笔在磨砂面标记脑片信息，置于60 ℃烤箱中2 h，然后转入37 ℃烘箱过夜。次日收集切片、4 ℃存放。

1.4.4 Nesitin免疫组织化学染色^[15-16] 石蜡切片经脱蜡、复水、抗原修复后滴加体积分数为3%H₂O₂，室温10 min；滴加体积分数为10%羊血清，室温1 h；滴加小鼠抗Nestin抗体(1︰500)，阴性对照只加抗体稀释液，4 ℃ 24 h；滴加生物素化羊抗小鼠IgG(1︰200)，37 ℃ 30 min；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素液(1︰200)，37 ℃ 30 min；DAB显色2-5 min(显微镜下控制反应时间)，流水冲洗及时中止反应；体积分数为70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各5 min脱水；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各10 min透明；中性树胶封固后镜检拍照。注：抗原修复后至DAB反应前，除羊血清封闭外，每一步骤结束后均需使用0.01 mol/L PBS溶液冲洗3次，每次5 min。

1.4.5 RT-qPCR检测大鼠脑室下区脑组织vWF mRNA表达

RNA提取和cDNA第一链的合成：各组动物在不同时间点断头取脑，置冰上迅速分离出脑室下区组织50-100 mg，-80 ℃冰箱保存备用。使用TRIzol法进行总RNA抽提。紫外分光光度计检测所提RNA浓度和纯度，A₂₆₀/A₂₈₀比值应在1.8-2.0之间。cDNA第一链的合成利用M-MLV反转录酶合成，操作方法按照说明书进行。

引物设计：根据Genbank中大鼠vWF基因(NM_011708.4)序列，使用PrimerPremier5.0软件设计引物F：5’-CTT CTG TAC GCC TCA GCT ATG C-3’；R：5’-TCC CTT GTT GCC GTT GTA ATT C-3’，产物为134 bp；以大鼠管家基因GAPDH(NM_001289726.1)为内标，设计引物F：5’-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3’；R：5’-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3’，产物为123 bp，由上海英骏生物技术有限公司合成。

qPCR反应体系：AceQ^®qPCRSYBR^®Green Master Mix 10 μL、cDNA(稀释10倍)1 μL，引物各0.4 μL，灭菌超纯水加至20 μL。使用荧光实时定量PCR仪CFX Connect进行qPCR反应，定扩增程序如下：预变性95 ℃ 5 min；变性95 ℃ 10 s，退火60℃ 30 s，循环40次。熔解曲线阶段：变性95 ℃ 15 s；退火60 ℃ 30 s；升温至95 ℃ 15 s搜集荧光。以GAPDH作为内参照。vWF基因的相对表达量按公式2^-^??Ct法计算。

1.4.6 图像分析 使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件(Media Cybernetics inc，USA)对免疫组化图片进行测量分析。不同时间点大鼠每只取3张不同断面的脑片，每张脑片在脑室下区随机选取5个非重叠视野拍照(40×10倍；同一曝光值)。分别测量脑室下区Nestin阳性细胞的平均吸光度。

1.5 主要观察指标 各组大鼠脑室下区vWF mRNA及Nestin表达。

1.6 统计学分析 使用SPSS 16.0统计软件对所有结果进行统计分析，所有数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，多个实验组与对照组比较采用最小显著差法(LSD)，组内比较采用t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

神经干细胞是一种能分化成神经细胞的干细胞，主要存在于脑室下区及海马齿状回，参与神经功能的修复过程。神经干细胞自我更新、增殖、分化主要依赖于周围特殊的微环境。Shen等^[17]研究发现绝大多数海马区的增殖细胞集中位于局部小血管周围，提示局部微血管及其分泌因子可能为神经再生提供了条件。Doetsch等^[18]发现成年鼠脑室下区中血管丰富，且神经干细胞紧靠着血管，提示血管新生和神经再生可能存在密切联系。

如果神经干细胞的微环境发生变化，其自我更新、增殖分化能力即受到影响^[19-20]。缺血再灌注后脑室下区微环境发生改变，神经干细胞数量明显增多，与多种因素有关^[21-25]。Zhang等^[26]研究发现缺血再灌注后脑缺血区血管新生对神经系统的恢复及保护具有重要作用；作者重点探讨缺血再灌注后脑室下区微环境的改变对神经干细胞的影响。Zhang等^[27-28]研究提示，缺血再灌注后神经干细胞在1 d时开始增加，7 d达高峰，并持续两三周。其研究进一步证实缺血再灌注后脑损伤刺激脑室下区的血管新生。但没有明确血管新生与神经干细胞是否有相关性。实验通过制作局部脑缺血再灌注模型，通过免疫组化研究发现，Nestin表达在缺血再灌注后1 d开始升高，7 d时达到高峰，之后缓慢下降，与之相符合，表明缺血再灌注可刺激神经干细胞的增殖。通过Real time-PCR技术发现，vWF mRNA表达在缺血再灌注1 d时开始增加，7 d时达高峰，14 d时表达逐渐降低；结果表明血管新生和神经干细胞增殖时相性几乎都是同步的。

血管新生是在原有血管上生出新的毛细血管，是改善脑组织血流供应的一种有效方法，并受到多种血管生长因子、细胞因子及其抑制因子之间的调控^[29-30]。vWF蛋白也称第Ⅷ因子相关抗原，是由血管内皮细胞合成释放的一种蛋白因子，vWF能通过抗体与相应的血管内皮细胞结合，诱导蛋白溶解酶生成，有利于内皮细胞穿过基质，增加内皮细胞的化学趋向性，促进血管内皮的分裂和毛细血管出芽生长^[31]。因此，vWF常用来标记新生血管。血管内皮生长因子是目前为止最为特异的促进新生血管形成的生长因子^[32-33]。前期的研究多通过免疫荧光或者检测vWF的阳性表达^[34]。实验通过RT-PCR对缺血后血管新生进行定量研究，以期更进一步验证缺血刺激对血管新生的影响。进一步侧脑室注射血管内皮生长因子后，可见Nestin及vWF表达明显增高，提示缺血再灌注后血管新生促进大鼠脑室下区神经干细胞的增殖。

神经干细胞的形态及功能研究是当今神经科学领域的热点。实验通过制作脑缺血再灌注模型及侧脑室注射血管生长因子干预，旨在研究血管新生对神经干细胞增殖的影响，结果提示血管新生可促进脑室下区神经干细胞的增殖，但其通过何种信号通路起作用及后期影响神经干细胞向何种表型的神经细胞分化，将是继续研究的重点。

血管新生对局灶性脑缺血再灌注后脑室下区神经干细胞增殖的影响

Influence of angiogenesis on neural stem cell proliferation in the subventricular zone after focal cerebral ischemia/reperfusion

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