透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.004

中国组织工程研究

• 骨组织构建 bone tissue construction • 上一篇下一篇

透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化

黄云梅^{1, 2, 3}，陈文列^{1, 2, 3}，林如辉^{1, 2, 3}，黄美雅^{1, 2, 3}，李钻芳^{1, 2, 3}，廖乃顺^{1, 2, 3}，刘献祥^{1, 2, 3}

福建中医药大学，1福建中西医结合研究院，2福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，3国家中医药三级科研实验室-中药药理(细胞结构与功能)实验室，福建省福州市 350122

收稿日期:2013-05-16 修回日期:2013-07-13 出版日期:2013-08-13 发布日期:2013-08-13
通讯作者: 陈文列，研究员，硕士生导师，福建中医药大学，福建中西医结合研究院，福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，国家中医药三级科研实验室-中药药理(细胞结构与功能)实验室，福建省福州市 350122 chen.wl@163.com 刘献祥，博士，教授，博士生导师，福建中医药大学，福建中西医结合研究院，福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，国家中医药三级科研实验室-中药药理(细胞结构与功能)实验室，福建省福州市 350122 liuxianxiang@163.com
作者简介:黄云梅★，女，1979年生，汉族，福建省闽清县人，2003年福建医科大学毕业，硕士，助理研究员，主要从事中西医结合防治骨病基础研究。 huangym003@163.com
基金资助:
福建省自然科学基金项目(2010J01200)，陈可冀中西医结合发展基金项目(CKJ2009005，CKJ2011004)，福建省重点实验室开放课题基金(2008J1004-29)。

Tougu Xiaotong capsule promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts

Huang Yun-mei1, 2, 3, Chen Wen-lie1, 2, 3, Lin Ru-hui1, 2, 3, Huang Mei-ya1, 2, 3, Li Zuan-fang1, 2, 3,
Liao Nai-shun1, 2, 3, Liu Xian-xiang1, 2, 3

1Fujian Academy of Integrative Medicine, 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, 3National Laboratory of Traditional Chinese Medicine-Pharmacology (Cell Structure and Function), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China

Received:2013-05-16 Revised:2013-07-13 Online:2013-08-13 Published:2013-08-13
Contact: Chen Wen-lie, Researcher, Master’s supervisor, 1Fujian Academy of Integrative Medicine, 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, 3National Laboratory of Traditional Chinese Medicine-Pharmacology (Cell Structure and Function), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China chen.wl@163.com Liu Xian-xiang, M.D., Professor, Doctoral supervisor, 1Fujian Academy of Integrative Medicine, 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, 3National Laboratory of Traditional Chinese Medicine-Pharmacology (Cell Structure and Function), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China liuxianxiang@163.com
About author:Huang Yun-mei★, Master, Assistant researcher, 1Fujian Academy of Integrative Medicine, 2Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics, 3National Laboratory of Traditional Chinese Medicine-Pharmacology (Cell Structure and Function), Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, Fujian Province, China huangym003@163.com
Supported by:
Fujian Natural Science Foundation, No. 2010J01200*; Chen Keji Development Foundation for Integrated Traditional and Western, No. CKJ2009005*, CKJ2011004*; Open Project of Fujian Key Laboratory, No. 2008J1004-29*

摘要/Abstract

摘要：

背景：透骨消痛胶囊是福建中医药大学治疗骨关节炎的临床验方，以往的研究多集中于其对软骨的作用。
目的：观察透骨消痛胶囊对成骨细胞增殖、分化及骨重塑相关因子表达的影响。
方法：以透骨消痛胶囊干预大鼠成骨细胞ROS17/2.8，分空白对照组和各浓度透骨消痛胶囊组，MTT法测定细胞增殖，比色法检测成骨细胞分化的生物标志物碱性磷酸酶活性，ELISA法检测骨钙素，茜素红染色观察骨矿化结节，实时定量PCR和ELISA法检测骨重塑相关因子骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达。
结果与结论：与对照组相比，质量浓度为0.25-2 g/L透骨消痛胶囊能显著促进ROS17/2.8细胞增殖(P < 0.05)，上调碱性磷酸酶活性(P < 0.05)、骨钙素的表达水平(P < 0.05)和矿化结节面积(P < 0.05)，增加骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的比例(P < 0.05)。提示透骨消痛胶囊防治骨关节炎的作用机制可能与其促进成骨细胞的增殖、分化以及调节骨重塑平衡的作用有关。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 透骨消痛胶囊, 骨关节炎, 软骨下骨, 成骨细胞, 增殖, 骨保护素/核因子κB受体活化因子配体, 骨重塑, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Tougu Xiaotong capsule is the clinical prescription for the treatment of osteoarthritis in Fujian University of Traditional Chinese Medicine, and the previous studies mainly focus on effect to cartilage.
OBJECTIVE: To observe the effect of Tougu Xiaotong capsule on the proliferation and differentiation of osteoblasts as well as the expressions of bone remodeling correlated factors.
METHODS: Rat osteoblast-like cell line ROS17/2.8 cells were incubated with Tougu Xiaotong capsule. The ROS17/2.8 cells were divided into blank control group and Tougu Xiaotong capsule groups with different concentrations. The cell proliferation was determined by methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide assay. Osteoblast differentiation biomarkers alkaline phosphatase activity, osteocalcin and bone mineralized nodules were measured with colorimetry, enzyme-linked immunosorbent assay and alizarin red staining, respectively. The real-time PCR and enzyme-linked immunosorbent assay were used to detect the expressions of bone remodeling factors osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor κB ligand.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the Tougu Xiaotong capsule with the concentration of 0.25-2 g/L could significantly promote the ROS17/2.8 cell proliferation (P < 0.05), up-regulate the alkaline phosphatase activity, osteocalcin expression level and mineralized nodules area, and increase the percentage of bone remodeling factors osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor κB ligand (P < 0.05). The mechanism of Tougu Xiaotong capsule protecting osteoarthritis may partly result from the regulation of proliferation and differentiation of osteoblasts and bone remodeling.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, Tougu Xiaotong capsule, osteoarthritis, subchondral bone, osteoblasts, proliferation, osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor κB ligand, ,
bone remodeling, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

黄云梅，陈文列，林如辉，黄美雅，李钻芳，廖乃顺，刘献祥. 透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.004.

Huang Yun-mei, Chen Wen-lie, Lin Ru-hui, Huang Mei-ya, Li Zuan-fang, . Tougu Xiaotong capsule promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.33.004.

图/表（结果） 6

2.1 透骨消痛胶囊促进ROS17/2.8细胞增殖、分化和矿化 MTT法检测显示，与对照组相比，透骨消痛胶囊质量浓度为0.25-2 g/L时可促进ROS17/2.8细胞增殖 (P < 0.05)，且质量浓度在0.5 g/L时差异最显着，而透骨消痛胶囊质量浓度超过2 g/L时对ROS17/2.8细胞增殖有抑制作用；但透骨消痛胶囊质量浓度低于0.25 g/L时，对细胞增殖无明显影响，见图1。

培养8 d内，各组细胞碱性磷酸酶活性随着培养时间的延长而增高。与空白对照组相比，透骨消痛胶囊(0.5 g/L)在培养第8天时细胞中碱性磷酸酶活性明显增加(P < 0.05)，见图2。

骨钙素的表达同样随着培养时间的延长而增加，酶联免疫吸附试验检测显示，与空白对照组相比，透骨消痛胶囊组培养第8，12天时，细胞中骨钙素的表达水平均显著升高(P < 0.05)，见图3。

ROS17/2.8细胞培养10 d后开始有矿物质沉积，逐渐形成不透光的矿化结节，经茜素红染色后，矿化结节呈红色点状或不规则小块状。与对照组相比，透骨消痛胶囊组培养15 d后，矿化结节的面积显著增加 (P < 0.05)，见图4。表明透骨消痛胶囊能促进ROS17/2.8细胞增殖、分化和矿化。

2.2 透骨消痛胶囊增加ROS17/2.8细胞中骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的比例见图5。

荧光实时定量PCR和ELISA检测的结果都表明，ROS17/2.8细胞中骨保护素和核因子κB受体活化因子配体的mRNA和蛋白表达水平均随培养时间的延长而增加。与对照组相比，透骨消痛胶囊组ROS17/2.8细胞中骨保护素的mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05)。而透骨消痛胶囊组ROS17/2.8细胞中核因子κB受体活化因子配体的mRNA和蛋白表达水平与对照组差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5，6。因此透骨消痛胶囊组的骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达率相对增加。

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引言

骨关节炎是中老年人常见的慢性进行性骨关节病，严重影响患者的生活质量。其病理变化涉及关节软骨、滑膜及软骨下骨等所有关节组织^[1]，以往的研究多集中于前者，近年来许多学者开始认识到软骨下骨在该病发病过程中的重要性。软骨下骨不仅在疾病晚期出现如骨硬化和骨赘形成等病变，事实上在骨关节炎发病前期往往出现骨密度降低^[2]。因此软骨下骨骨质改变不仅是该病后期诊断的重要病理特征，可能还与疾病的进展密切相关^[3-4]。目前软骨下骨已逐渐成为备受关注的骨关节炎治疗研究的新靶点^[5-6]。
有学者研究发现骨密度降低，骨转换率高的患者骨关节炎进展往往更快^[7]。Bellido等^[8]的实验也提示，骨转换率升高引起的骨微结构损伤可能加重骨关节炎的病情。动物实验发现某些治疗骨质疏松的药物，如双膦酸盐、降钙素、甲状旁腺素、雌激素等对治疗骨关节炎也有效^[9-12]。因此对早期骨代谢失衡的患者，纠正过高的骨转换率对骨关节炎的治疗可能是有益的。
现代医学目前对骨关节炎的治疗还没有特别有效的方法，主要通过消炎止痛和营养软骨等，且难以避免不良反应。而中医药复方可通过多靶点对人体机能进行调节，有其独到之处，是对骨关节炎治疗的有力补充。骨关节炎在祖国医学上属痹证范畴。痹证多为人体正气不足时，感受风、寒、湿邪等引起气血不畅，瘀血阻滞所致。中医认为肝主筋，藏血，肝血足则筋脉劲强。肾主骨生髓，骨髓生于精气，肾气盛则能濡养筋骨。血为气之母，气为血之帅，气行则血行，气滞则血瘀。肝肾不足，气血亏虚则筋骨失养。瘀血阻滞，气血失调，日久凝聚于骨节则痹。可见骨关节炎的内因主要为肝肾不足，因此对骨关节炎的治疗主要以补肾柔肝为根本大法^[13]。
透骨消痛胶囊是福建中医药大学附属第二人民医院治疗骨关节炎的临床验方^[14]，以往的研究发现，该方可能通过抑制炎症因子、基质金属蛋白酶及氧自由基，抑制软骨细胞凋亡，促进软骨细胞增殖等相关机制减轻软骨损伤^[15-18]。动物实验表明，透骨消痛方可以减轻骨关节炎软骨下骨硬化[19]，可能通过调节核因子κB受体活化因子等表达影响软骨下骨重塑[20]，但骨关节炎病程长，发病过程复杂，受应力、炎症因子和自由基等多种因素，及骨骼中骨髓基质细胞和造血细胞等的影响，因此体内实验研究很难明确透骨消痛方对骨组织和细胞的直接作用。实验拟通过透骨消痛胶囊干预大鼠成骨细胞ROS17/2.8，分析其在体外对成骨细胞增殖、分化及骨重塑相关因子骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的影响，探讨其防治骨关节炎的相关机制。

材料方法

设计：空白对照，细胞实验。

时间及地点：实验于2011年1月至2012年2月在福建中医药大学中西医结合研究院医学实验中心完成。

材料：

细胞：大鼠成骨细胞样细胞株ROS17/ 2.8购自中国科学研究院^[²¹^-22^]。

药物：透骨消痛胶囊为福建中医药大学附属二院院内制剂，由白芍、川芎、巴戟天、肿节风等中药提取组成，具体比例及制备工程暂时保密。

透骨消痛胶囊对成骨细胞增殖和分化影响实验的主要试剂：

方法：

细胞培养：大鼠成骨细胞样细胞株ROS17/2.8用含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在体积分数5%CO₂的37 ℃培养箱中培养，隔天更换培养基，每三四天用0.25%胰酶消化传代1次。

MTT法测定细胞增殖：将细胞收集后调节至浓度5×10¹⁰L^-1，按0.1 mL/孔种在96孔板中。细胞贴壁后，血清饥饿24 h，加入相当于生药质量浓度为0.125，0.25，0.5，1，2，4，8 g/L透骨消痛胶囊成分，每浓度设6个复孔，空白组不加透骨消痛胶囊，分别干预24，48和72 h后，每孔加入终浓度0.5 g/L MTT，37 ℃孵育4 h，弃去培养基，每孔加入100 μL的二甲基亚砜震荡溶解结晶，490 nm检测吸光度值。比较各质量浓度透骨消痛胶囊组与空白组吸光度值，观察其对细胞增殖的影响，并选择促增殖最明显的浓度进行后续试验。

碱性磷酸酶活性测定：细胞接种于6孔培养板，每孔为1×10⁵个细胞。分成空白对照组和透骨消痛胶囊组(透骨消痛胶囊质量浓度相当于生药0.5 g/L)，每组至少含3个样本。细胞培养2，4和8 d后，以1%Triton X-100提取细胞裂解液，BCA法测定蛋白浓度。比色法测定碱性磷酸酶活性，简要步骤如下：按试剂盒说明书中的操作表配制空白管、标准管和测定管的测试溶液，立即混匀，520 nm，1 cm光径比色，空白管调零，测各管吸光度值吸光度。以标准管为参照，按说明书计算公式计算各测试管碱性磷酸酶活性。结果进行蛋白质含量校正。

实时定量PCR分析细胞中骨保护素和核因子κB受体活化因子配体的表达：细胞接种于6孔培养板，1×10⁵/孔。分成空白对照组和透骨消痛胶囊组(质量浓度0.5 g/L)，每组至少含3个样本。细胞干预4，8和12 d后，用Trizol法分别提取RNA，并反转录成cDNA作为PCR模板。PCR反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，引物各0.4 μL，ROX染料0.4 μL，cDNA 2 μL，dH₂O 6.8 μL，总体积20 μL，每个样品设3个复孔。使用仪器为ABI7500，反应条件：95 ℃ 10 s预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s为一个反应周期，共40个循环得到溶解曲线。以β-actin 作为参比基因对所有样品进行校正，结果通过7500 System Software 进行分析，以阴性对照组某一样本 mRNA 的表达量作为“1”，计算出其他样本的相对量^[²³^]。

PCR引物：

酶联免疫吸附试验测量细胞中骨钙素、骨保护素和核因子κB受体活化因子配体的表达：细胞接种于6孔培养板，每孔为1×10⁵个细胞。分成空白对照组和透骨消痛胶囊组(透骨消痛胶囊质量浓度为0.5 g/L)，每组至少含3个样本。在第4，8和12天分别提取细胞裂解液，BCA法检测蛋白含量。ELISA具体实验方法参考试剂盒说明书，简要步骤如下：移液器取100 μL标准品和样品加入到抗体包埋的板孔内，37 ℃下孵育1 h；移去各孔内液体，以 300 μL洗涤液洗涤3次；向各孔加100 μL二抗，37 ℃下孵育1 h；移去各孔内液体，以300 μL洗涤液洗涤3次；向各孔加100 μL底物反应液，室温下避光下孵育10 min后，加100 μL反应终止液。实验结果用ELISA检测仪在492 nm处测定吸光度值，利用标准曲线计算各样本蛋白表达量，并对结果进行蛋白含量校正。

矿化骨结节形成实验：细胞接种于6孔培养板，每孔为1×10⁵个细胞。分成空白对照组和透骨消痛胶囊组(透骨消痛胶囊质量浓度为0.5 g/L)，每组至少含3个样本。连续培养15 d后，移去培养液，将细胞用40 g/L多聚甲醛固定10 min，茜素红染色30 min。在显微镜下拍照，矿化结节面积通过显微图像分析软件(Motic 6.0，厦门麦克奥迪医疗诊断系统有限公司)进行定量分析。

主要观察指标：成骨细胞的增殖和分化。

统计学分析：所有的实验数据用x(_)±s表示，组间差异采用SPSS 17.0软件(美国SPSS公司)进行单因素方差分析进行比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

透骨消痛胶囊由白芍、川芎、巴戟天、肿节风等中药组成，该方以“肾主骨”、“肝主筋”、“膝为筋之府”等中医理论为指导，以补肾作为治疗膝骨关节炎的根本法则，佐以养肝、活血、健脾、祛邪和止痛等，达到标本兼治的目的，在临床疗效上已得到充分肯定。实验发现透骨消痛胶囊组与空白对照组相比，成骨细胞增殖加快，碱性磷酸酶活性和骨钙素的表达增高，矿化结节形成面积增加。表明透骨消痛胶囊在体外可以促进成骨细胞的增殖和分化，从而促进骨质的形成和成熟。

除了直接的骨形成作用，成骨细胞还合成和分泌许多细胞因子，间接影响骨重塑平衡。其中核因子κB受体/核因子κB受体活化因子配体/骨保护素系统在骨吸收和骨形成的藕联中起着关键作用^[24-25]。核因子κB受体活化因子配体是肿瘤坏死因子受体配体超家族成员，在体内以膜结合型和可溶性羧基末端两种形式存在，成骨细胞、骨髓基质细胞、激活的T淋巴细胞均表达核因子κB受体活化因子配体。核因子κB受体是核因子κB受体活化因子配体的惟一已知受体，主要表达于单核/巨噬细胞系，在破骨前体细胞或成熟破骨细胞表面高度表达，直接促进破骨细胞的分化、活化及阻止破骨细胞的凋亡^[26]。成骨细胞同时还表达另一肿瘤坏死因子受体配体超家族成员骨保护素，以可溶性分泌蛋白形式存在，是核因子κB受体活化因子配体的诱骗受体，可与核因子κB受体活化因子配体竞争性结合，从而阻断核因子κB受体活化因子配体与核因子κB受体之间的相互作用，抑制破骨细胞分化和功能。因此在骨形成与骨吸收的动态平衡关系中，核因子κB受体活化因子配体/骨保护素是一个重要的调节杠杆^[27]。有研究表明，骨关节炎患者软骨下骨细胞中白介素6、基质金属蛋白酶、核因子κB受体活化因子配体等促骨吸收因子表达增强^[28]，骨关节炎患者的骨代谢失衡可能与骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达变化有关。实验发现，透骨消痛胶囊干预能提高成骨细胞骨保护素的表达水平，从而提高骨保护素/核因子κB受体活化因子配体表达率，调节骨代谢平衡。

综上，透骨消痛胶囊可以促进成骨细胞的增殖、分化和矿化，并通过调节成骨细胞骨保护素/核因子κB受体活化因子配体表达率影响骨重塑平衡，这可能是该方对骨关节炎软骨下骨的保护作用机制之一。

透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化

Tougu Xiaotong capsule promotes the proliferation and differentiation of osteoblasts

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