Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.31.037

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来可诱导共刺激分子(inducible costimulator, ICOS)/可诱导共刺激分子配体(ICOS Ligand，ICOSL)在抗感染、抗移植反应、抗肿瘤、治疗自身免疫性疾病等多方面领域受到了越来越多的关注。目前对ICOS/ICOSL表达量的研究大多基于分子水平，国内外尚鲜见ICOS/ICOSL mRNA定量检测的报道。
目的：构建ICOS/ICOSL cDNA质粒标准品，建立Taqman探针检测ICOSL/ICOSL基因表达量的方法。
方法：以胃腺癌组织总RNA为模板、Random 9 mers为引物反转录合成cDNA，用该cDNA为模板聚合酶链反应扩增人ICOS/ICOSL基因相应的cDNA目的片段，构建PMD-18-ICOS/ICOSL重组质粒，鉴定测序后，用Taqman探针实时荧光定量聚合酶链反应制作标准曲线。
结果与结论：组织提取的总RNA完整性良好，构建的ICOS/ICOSL质粒测序结果与目的片段一致，质粒的原始浓度为6.10×10¹³，4.31×10¹³ copies/mL，倍比稀释后用Taqman探针荧光定量聚合酶链反应检测，在10¹²~10¹³copies/mL线性关系良好(R²=1)，提示成功建立了Taqman探针定量检测ICOS/ICOSL基因表达的方法。

关键词: 共信号分子, 可诱导共刺激分子, 配体, mRNA, 实时定量聚合酶链反应

Abstract:

BACKGROUND: The inducible costimulatory molecule (ICOS) / its ligand (ICOSL) become more and more attractive in the field of anti-infection, anti-transplantation reaction, anti-tumor and treatment of autoimmune disease. Current studies focus on molecular level of ICOS/ICOSL gene expression, no study reports quantitative detection of ICOS/ICOSL mRNA expression.
OBJECTIVE: To construct the plasmid standard samples of ICOS/ICOSL cDNA, and to detect the ICOS/ICOSL gene expression by the Taqman Probe technology.
METHODS: The cDNA was synthesized by reverse transcription with Random 9 mers as the primer and total RNA from the gastric adenocarcinoma tissues as the template. The target sequences of human ICOS/ICOSL cDNA were amplified by polymerase chain reaction amplification from the resulting cDNA as mentioned above. The PMD-18-ICOS/ICOSL recombinant plasmids were constructed. Standard curve was made by Taqman Probe fluorescence polymerase chain reaction technology after gene sequencing.
RESULT AND CONCLUSION: The composition of total RNA extracted from the tissues was complete and the sequences of the ICOS/ICOSL plasmid were consistent with the target fragments. The initial concentration of plasmids was 6.10×10¹³, 4.31×10¹³copies/mL. The different diluted concentration of the plasmids had good linear relationship (R²=1) after amplifying by Taqman PCR and the linear range was 10¹²-10¹³ copies/mL, suggesting that the method which can quantitatively detect the concentration of ICOS/ICOSL gene by Taqman Probe technology was successfully constructed.

中图分类号:

R318

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Zhao Lin, Gu Guo-hao, Shi Jin-fang, Jiang Min, Chen Yong-jing, Zhang Guang-bo. Quantitative detection of ICOS/ICOSL gene expression using Taqman Probe technology[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(31): 5849-5852.

参考文献

引言

材料方法

讨论

ICOS/ICOSL共信号分子是CD28和B7家族成员，在细胞免疫和体液免疫中发挥重要作用。ICOS的相对分子量为Mr55 000~60 000，是由二硫键连接的二聚体，包含Mr27 000和Mr29 000两条链，它主要表达于活化后的T细胞表面^[1] 。ICOSL即B7同源蛋白(B7 homologue protein，B7h)，又称B7RP-1，也称B7-H2或GL50，是由Yashinga等^[3]从鼠的iELcDNA 文库中分离出的一种全长cDNA 所编码一种新的蛋白质，该蛋白质是1型跨膜糖蛋白，其胞膜外有一个IgV样区和一个IgC样区，还有一个疏水的跨膜区和胞浆尾区，在同源区的l38，185和242位有保守的半胱氨酸残基，并且它的全长和跨膜区的相对位置也与B7分子相似，因此命名为B7同源蛋白，主要表达在静止的B细胞、树突状细胞和单核细胞上，也可表达在非专职提呈细胞上，如成纤维细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞、造血母细胞和胚胎干细胞。研究表明ICOS/ICOSL共信号途径参与Th2细胞的分化，诱导Th1和Th2细胞因子的产生，并在T细胞依赖的B细胞的活化中起重要作用^[9-12] 。
基于ICOS/ICOSL共信号通路在免疫系统中的重要作用，近年来ICOS/ICOSL已经在多种疾病领域受到了越来越多的研究和关注，目前检测标本中ICOS/ICOSL的表达多采用流式细胞术，免疫组化等方法，但流式细胞术是在分子水平上的检测，免疫组化方法检测的结果是对分子基因水平相对含量的比较，本实验旨在运用TaqMan探针聚合酶链反应技术建立一种对标本中ICOS/ICOSL基因表达水平绝对定量的方法。
实时荧光定量聚合酶链反应技术的出现使分子诊断领域发生革新的变化，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。实时荧光定量聚合酶链反应技术是通过在聚合酶链反应反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测聚合酶链反应扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。Ct值即聚合酶链反应扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。目前根据实时荧光聚合酶链反应技术所使用的荧光化学方法的不同，荧光定量聚合酶链反应技术主要分两类，分别是荧光染料和荧光探针。常用的荧光染料方法为内插式荧光染料(如SYBR GreenⅠ)荧光定量法，其优点是可以用于不同的模板，使用方便，价格相对便宜，灵敏度很高，但易与非特异性产物结合导致荧光本底较高和结果的不准确。TaqMan探针聚合酶链反应方法不仅操作简单，快捷高效，而且和SYBR GreenⅠ法相比具有较高的敏感性和特异性, 已成功应用于转基因检测、药物疗效评价、基因表达研究、传染病诊断等诸多领域^[13-16] 。为此，作者设计TaqMan探针，5’端以报告集团6-羧基荧光素标记，3’端以淬灭基团6-羧基-四甲基罗丹明标记。当探针完整时，由于报告基团和淬灭基团发生荧光共振能量转移，所以检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光。在聚合酶链反应扩增过程中，由于Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来游离于反应体系中，不能发生荧光共振能量转移而发出荧光信号。这个过程中切割的荧光分子数与聚合酶链反应产物的量成比例，因此根据聚合酶链反应反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
在荧光定量-聚合酶链反应中，模板的定量有两种方法，即绝对定量和相对定量^[17] ，绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。此方法标准品的量是预先已知的。将标准品稀释成不同浓度的样品,并作为模板进行聚合酶链反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的Ct值为纵坐标,绘制标准曲线。对未知样品进行定量时，根据未知样品的Ct值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。质粒DNA和体外转录的RNA常作为绝对定量的标准品，无论是体外转录的RNA还是dsDNA用作标准品构建标准曲线时其稳定性与重复性都不及质粒DNA^[18-20] ，故本实验采用质粒DNA作为参考标准。选择一胃腺癌组织标本提取总RNA，经检测其完整和纯度好(结果2.1所示)，反转录后聚合酶链反应扩增，电泳后得到两清晰条带且位置与预期相符(ICOS目的片段：587 bp，ICOSL目的片段：892 bp)，切割后进行回收纯化，然后与PMD18-T载体连接，转入JM109感受态细胞，在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂板上培养，克隆筛选阳性菌落即白色菌落，经聚合酶链反应和序列测定证实目的片段被完整插入质粒载体。扩大提取并纯化同一菌落的细菌质粒，再用紫外分光光度计定量，计算出原始拷贝浓度分别为为6.10×10¹³ copies/mL(ICOS)、4.31×10¹³ copies/mL (ICOSL)。将其进行稀释10个梯度，对不同梯度的标准品进行荧光定量聚合酶链反应检测，结果表明，质粒标准品的聚合酶链反应荧光吸收皆呈现典型的s形动力学曲线，各梯度的起始模板拷贝浓度(log值)与Ct值之间呈良好的线性关系，相关系数为1.00。本实验成功构建了ICOSL/ICOSL质粒标准品，经测序正确，利用合成的Taqman引物和探针扩增后，在E12-E3均能得到良好的线性关系，为进一步研究ICOSL/ICOSL的生物学意义奠定了方法学基础。　

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