脂多糖可影响及调控牙髓干细胞的增殖与迁移

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1801

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
人牙髓干细胞：来源于人体牙髓的一类具有自我增殖、分化能力的干细胞，由于具有高度的分化能力和自我增殖能力等生物学特性而受到干细胞研究者的极大关注。另外，由于具有非侵入性取材和获取途径相对简单等特点，其被认为在医学领域具有巨大的潜在应用价值。
活化的丝裂原活化蛋白激酶信号通路：是众多信号蛋白的一种，其激活调控一系列细胞活动。活化的丝裂原活化蛋白激酶通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关。

摘要
背景：大量研究证明人牙髓干细胞是一种具有高度自我更新能力以及多向分化潜能的细胞。
目的：研究脂多糖激活人牙髓干细胞后对细胞增殖及迁移的影响，并探索脂多糖对TLR4、矿化相关基因及MAPK信号通路的影响。
方法：脂多糖模拟深龋时细菌入侵牙髓的微环境。取人牙髓组织，采用组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞，①以0，0.1，1，10 mg/L脂多糖干预1，3，5，7 d，以MTT法检测脂多糖对人牙髓干细胞增殖能力；②将第3代人牙髓干细胞分为对照组和1 mg/L脂多糖处理组，以细胞免疫荧光检测牙髓干细胞中Toll样受体4的表达，以反转录PCR检测矿化相关基因碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白和骨桥素mRNA表达变化；③取0.1，1，10 mg/L脂多糖干预24 h牙髓干细胞，以Transwell小室检测细胞的迁移能力；④以1 mg/L脂多糖刺激牙髓干细胞0，15，30，60，120 min，以Western blot检测促分裂原活化蛋白激酶信号通路的蛋白p38及ERK1/2的活化水平。实验方案经海南省干部疗养院伦理委员会批准(伦理审批号：20180410)。
结果与结论：与对照组(0 mg/L脂多糖)相比，脂多糖组细胞增殖能力均下降，人牙髓干细胞中Toll样受体4表达增加，矿化相关基因牙本质涎磷蛋白、骨桥素和碱性磷酸酶mRNA的表达水平增加，迁移细胞数量增加，且随着脂多糖作用时间的延长被激活的p-p38及p-ERK1/2蛋白表达随之增强。提示脂多糖对牙髓干细胞的增殖能力、迁移能力有不同程度影响，且Toll样受体4以及促分裂原活化蛋白激酶信号通路蛋白可能参与脂多糖调控的牙髓干细胞定向分化过程。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-2759-7746(冯儒学)

关键词: 脂多糖, 人牙髓干细胞, Toll样受体4, p38, ERK1/2, 牙本质涎磷蛋白mRNA, 骨桥素mRNA, 碱性磷酸酶mRNA

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies have demonstrated that human dental pulp stem cells have highly self-renewing and multi-directional differentiation potentials.
OBJECTIVE: To study the effect of lipopolysaccharide on proliferation and migration of activated human dental pulp stem cells, and to explore the effect of lipopolysaccharide on Toll-like receptor 4 (TLR4), mineralization-related genes and mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway.
METHODS: The microenvironment of bacteria invading the pulp in human deep-carious teeth was simulated by lipopolysaccharide. Human dental pulp stem cells were isolated and cultured by tissue explant enzymatic digestion. (1) Human dental pulp stem cells were stimulated by 0, 0.1, 1, 10 mg/L lipopolysaccharide for 1, 3, 5, and 7 days, and the cell proliferation ability was then detected by MTT. (2) Immunofluorescence was used to observe the expression of TLR4 in the cells cultured normally (control group) or intervened with 1 mg/L lipopolysaccharide. RT-qPCR was used to observe the expression of mineralization-related genes alkaline phosphatase, dentin sialophosphoprotein and osteopontin mRNAs in the cells. (3) Transwell test was used to detect the migration ability of human dental pulp stem cells after 24-hour intervention with 0.1, 1, and 10 mg/L lipopolysaccharide. (4) Western blot assay was used to detect the activated levels of p-p38 and p-ERK1/2 in the MAPK signaling pathway after 0, 15, 30, 60 and 120 minutes of 1 mg/L lipopolysaccharide stimulation. The study protocol was approved by the ethic committee of Cadre Sanatorium of Hainan with an approval No. 20180410.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the blank control group, lipopolysaccharide stimulation decreased the cell proliferation ability, and increased the TLR4 expression as well as the mRNA expression of alkaline phosphatase, dentin sialophosphoprotein and osteopontin in the human dental pulp stem cells. The number of migrated cells was also increased after lipopolysaccharide stimulation. Moreover, the expression of p-p38 and p-ERK1/2 proteins yielded an increase as the lipopolysaccharide continued to work. To conclude, lipopolysaccharide has different effects on the proliferation and migration of human dental pulp stem cells. TLR4 and MAPK signaling pathway may be involved in the directional differentiation of human dental pulp stem cells regulated by lipopolysaccharide.

Key words: lipopolysaccharide, Human dental pulp stem cells, Toll-like receptor 4, p38, ERK1/2, dentin sialophosphoprotein mRNA, osteopontin mRNA, alkaline phosphatase mRNA

中图分类号:

冯儒学，蔡仁刚，解丹丹. 脂多糖可影响及调控牙髓干细胞的增殖与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(29): 4688-4693.

Feng Ruxue, Cai Rengang, Xie Dandan. Lipopolysaccharide can influence and regulate proliferation and migration of dental pulp stem cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(29): 4688-4693.

图/表（结果） 2

2.1 牙髓干细胞原代培养结果 倒置显微镜下可见，消化后牙髓组织块变得松散，接种3-7 d时，原代细胞从组织块附近游离出，见图1A。当细胞浓度达80%时，按1∶2传代培养，第3代后，细胞呈反射状或涡旋状排列，且形态稳定，见图1B。

2.2 牙髓干细胞的鉴定结果 人牙髓干细胞表面标记物阴性表达CD34(0.1%)、CD45(0.31%)；阳性表达CD44(98.3%)、CD90(99.24%)和CD29(99.16%)，符合间充质干细胞表面标记物特性，见图2。

2.3 脂多糖抑制牙髓干细胞的增殖 脂多糖刺激牙髓干细胞增殖检测结果显示，与对照组(0 mg/L)相比，脂多糖组细胞增殖能力均出现下降，且在第5，7天时差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.4 脂多糖刺激牙髓干细胞中TLR4的表达 细胞免疫荧光结果显示，与对照组相比，牙髓干细胞经脂多糖刺激后绿色荧光明显增强，说明TLR4是脂多糖的关键受体，在其刺激下被激活显色。而脂多糖阴性对照组仅见蓝染细胞核，见图3。

2.5 脂多糖刺激后牙髓干细胞中矿化相关基因的表达变化 实时定量PCR结果显示，与对照组相比，7 d和14 d时脂多糖组牙本质涎磷蛋白mRNA表达水平明显增加(P < 0.05)，在21 d时脂多糖组牙本质涎磷蛋白mRNA表达水平比对照组明显下降(P < 0.05)；脂多糖组碱性磷酸酶mRNA表达水平在14 d和21 d时均比对照组增加(P < 0.05)；脂多糖组骨桥素mRNA表达水平在各时间点均明显高于对照组(P < 0.05)，见图4。

2.6 脂多糖促进牙髓干细胞的迁移 Transwell实验结果表明，0.1，1，10 mg/L脂多糖组迁移细胞数量分别为(16.004±1.046)，(20.100±0.350)，(25.330±1.24)/400倍视野均高于对照组[0 mg/L，(11.675±1.109)/400倍视野] (P < 0.05)，见图5。说明脂多糖可以促进牙髓干细胞的迁移。

2.7 脂多糖促进牙髓干细胞中MAPK信号通路的蛋白活化 Western blot检测结果显示，脂多糖能激活p38和ERK1/2，且随着时间增加，p-p38和p-ERK1/2蛋白相对表达水平逐渐增加，这说明脂多糖能使p38和ERK1/2蛋白活化，且p38和ERK1/2蛋白可能参与脂多糖调控的牙髓干细胞定向分化过程，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年4至12月在海南省干部疗养院完成。

1.3 材料 经患者同意后，从海南省干部疗养院口腔外科门诊收集因正畸减数拔出的健康恒牙。用含双抗的PBS将离体牙洗涤3遍，分离牙髓，置于PBS内反复漂洗。所有实验方案经海南省干部疗养院伦理委员会批准(伦理审批号：20180410)，并与患者签订知情同意书。

实验用主要试剂及仪器：DMEM完全培养基购自Gibco公司；胰蛋白酶购自Sigma公司；CD34-PE、CD45-PE、CD 44-FITC、CD 90-PE、CD 29-PE直标特异性抗体购自Biolegend公司；Trizol试剂盒、反转录试剂盒购自日本 TaKaRa；脂多糖购自美国Invivogen公司；p38、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)单克隆抗体及辣根过氧化物标记的二抗均购自美国 Abcam公司；TLR4抗体购自美国Abcam公司；RNA提取试剂盒购自美国Omega；流式细胞仪购自BD公司；实时定量PCR仪购自美国 Applied Biosystems；BCA法测定蛋白定量试剂盒购自上海捷瑞生物科技有限公司；酶联免疫检测仪购自Bio-TEK公司；激光共聚焦显微镜购自ThermoFisher公司；CO₂培养箱购自美国SIM公司；电泳凝胶图像分析系统购自Bio-Rad公司；倒置显微镜购自日本OLYMPUS。

1.4 方法

1.4.1 细胞原代培养 用小剪将牙髓组织剪成约0.5 mm³，37 ℃下用Ⅰ型胶原酶对组织块进行消化10 min，然后加入DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗)，进行离心3 min，将上清弃去后，再少量加入完全培养基混匀后接种至6孔板内。

1.4.2 MTT法检测脂多糖对人牙髓干细胞增殖能力 取处于对数生长期的第3代细胞(2 000个/孔)，接种于96孔板，每组6个复孔，不同脂多糖浓度培养1，3，5，7 d，以MTT法检测牙髓干细胞增殖能力。待细胞完全贴壁后，更换含有0，0.1，1，10 mg/L脂多糖的完全培养基培养细胞。检测时每孔加MTT液20 μL、DMEM完全培养液200 μL，CO₂培养箱37 ℃ 4 h，去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，轻微震荡使结晶溶解。采用酶联免疫检测仪测定各孔光密度值。

1.4.3 细胞免疫荧光检测牙髓干细胞中TLR4的表达 将第3代人牙髓干细胞制成单细胞悬液，接种于6孔板中，分为2组，即对照组和1 mg/L脂多糖处理组，24 h后去培养液，以PBS清洗3次，然后以40 g/L多聚甲醛固定30 min后，PBS清洗3次，0.1% Triton-100孵育15 min，PBS清洗3次，体积分数1%胎牛血清封闭30 min，滴加一抗TLR4孵育，4 ℃孵育过夜；PBS清洗后，加入兔源二抗，37 ℃孵育1 h，DIPA核染5 min，自来水冲洗终止反应，封固，激光共聚焦显微镜下观察。

1.4.4 脂多糖对矿化相关基因碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白和骨桥素mRNA表达的影响 将第3代人牙髓干细胞制成单细胞悬液(2×10⁵个/孔)，接种于6孔板中，分为2组，即对照组和1 mg/L脂多糖处理组，每组设置7，14，21 d 3个观察时间点。分组干预后，采用矿化诱导液将细胞向成骨方向诱导分化，采用Trizol试剂提取细胞总RNA，并对浓度进行测定。采用反转录试剂盒进行反转录cDNA合成，反应条件为预变性95 ℃ 5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，74 ℃延伸30 s，循环40次。实时荧光使用ABI PRISM 7500 Sequence Detector检测。引物由武汉擎科创新生物科技有限公司设计并合成。人碱性磷酸酶上游引物：5'-CCC TTC TTT GTG AAC ACT TGT AG-3'，下游引物：5'-AGA CAG TAT CTG CGC TGG TGT-3'；人牙本质涎磷蛋白上游引物：5'-CCG TAC ACG CTA AGA GGA TGA-3'，下游引物：5'-TGC CCC GGA ATC CTT TGG AAT TGT ATT C-3'；人骨桥素上游引物：5'-AGC CAT ACA CGA TTG GCT GAG TG-3'，下游引物: 5'-GTG TGC GCC TGT TGA AGT TCG TCT GTA-3'。以β-actin为内参，上游引物：5'-GGA GAT CCG CCT CCA GAA AAT-3'，下游引物：5'-GTC GAG CTG TTG CTG TGG AGA TCT TCT ATG G-3'。每个样品重复测量3次，用Applied Biosystems系统软件进行结果分析，mRNA相对表达水平以2^-^??Ct分析，结果以与对照组比值表示。

1.4.5 Transwell实验 经胰酶消化后将0.1，1，10 mg/L脂多糖干预24 h牙髓干细胞(1×10⁶个/孔)接种于6孔板中，每孔加2 mL DMEM完全培养基。细胞贴壁后加入浓度为0，10，20 μmol/L的PBS，在37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育48 h后收集细胞，Transwell小室上层加入无血清的DMEM培养基(400 μL)，下层加入DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清)。在培养箱中继续培养1 d取出小室，用棉签将上室底部基底膜上的细胞刮除，室温下用40 g/L多聚甲醛固定，结晶紫染色。倒置显微镜下任选5个400倍视野拍照，统计迁移细胞数量。

1.4.6 Western blot检测MAPK信号通路的蛋白活化水平 采用第3代牙髓干细胞制成4×10⁵/孔的浓度的单细胞悬液，接种于培养皿中，当细胞融合度至80%后，以质量浓度1 mg/L脂多糖刺激牙髓干细胞，分别于0，15，30，60，120 min后进行观察。采用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解RIPA提取牙髓干细胞的总蛋白。经BCA法蛋白定量后上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，再经电泳、转膜后，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1.5 h。加一抗后4 ℃孵育过夜。加二抗37 ℃孵育2 h，TBST漂洗10 min×3次后，显影。用Quantity One软件测定蛋白条带吸光度值，目的蛋白的相对表达水平=目的蛋白的吸光度值/β-actin的吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①牙髓干细胞中TLR4的阳性表达情况；②牙本质涎磷蛋白、碱性磷酸酶及骨桥素的mRNA表达水平；③细胞迁移能力；④细胞外调节蛋白激酶和p38蛋白的表达水平。

1.6 统计学分析 实验结果用SPSS 19.0统计软件处理，数据以x(_)±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

龋齿病因其危害广、患病率高被世界卫生组织列为排名第三的非传染性慢性疾病^[6]。在许多发达国家60%-90%的儿童及成年人都受到龋病影响。早期龋病常是革兰阳性菌感染，而随着病情发展到牙髓-牙本质交界处时，变为以革兰阴性菌为主^[7]。因此认为龋病的致病菌可能是多种细菌的混合感染。牙髓则长期暴露在这样混合感染环境中。以往研究牙髓免疫反应主要是革兰阴性菌，对革兰阳性菌刺激牙髓后TLR4的变化研究较少^[8]。此次实验采用脂多糖刺激牙髓干细胞，模拟早期龋病下牙髓组织环境，研究革兰阳性菌对牙髓干细胞刺激后矿化相关基因、MAPK信号通路的表达及牙髓干细胞生物学改变。

脂多糖广泛存在于炎症牙髓、牙菌斑等部位，能在坏死牙髓中被检出，且可以进入根尖周围组织，导致根尖周炎^[9]。许多研究显示，牙髓炎主要有根管内革兰阴性厌氧菌表面的脂多糖引起的，脂多糖主要通过TLR4与CD14转导到胞内，激活转录因子移位入核，进而将细胞激活后，启动一系列免疫反应进而导致机体受损^[10]。

此次实验显示不同浓度脂多糖都可降低干细胞的增殖，即使0.1 mg/L的脂多糖也能抑制细胞增殖，这也被关于肿瘤细胞的研究所证实^[11]。脂多糖对牙髓干细胞刺激后，激活了TLR4信号通路，导致白细胞介素8和白细胞介素6等炎性细胞因子的释放增加^[12]；Transwell结果说明脂多糖具有促进牙髓干细胞迁移的能力。人类第一个Toll样受体是TLR4，被认为是跨膜传导中的关键受体，在免疫连接环节中起到重要作用^[13]。细胞免疫荧光染色结果显示，脂多糖能激活人牙髓干细胞表面的TLR4，且TLR4参与了牙髓干细胞的免疫反应。

碱性磷酸酶参与牙齿、骨的形成、再生等过程，是一种磷酸单酯水解酶^[14]。牙本质涎蛋白是牙本质矿化所必须的非胶原蛋白，在牙本质形成、成牙分化及矿化过程中起到重要作用^[15-16]。骨桥素是一种糖基化磷蛋白，参与Ca²⁺信号转导，可在牙本质桥初期矿化中起到重要作用^[17]。实时定量PCR结果说明脂多糖可能正向调控人牙髓干细胞成为牙本质细胞的定向分化。近年来有文献报道MAPK信号通路不仅参与牙齿细胞分化、发育及形成过程，并且在牙髓生物学领域也发挥了重要的作用^[18-19]。许多研究表明，当p-p38上游激活因子大量表达时，能够增加人牙髓干细胞的增殖和迁移能力，对牙髓组织损伤修复有着重要意义^[20-21]。p-ERK1/2信号通路属于最经典的牙髓信号传导通路途径，能够调控细胞增殖、分化和凋亡，同时还能加速牙髓成纤维细胞分化^[22]。Western blot检测结果显示，脂多糖能活化p38及ERK1/2信号通路，调控牙髓干细胞的分化过程，这与上述文献报道基本一致^[22]。研究结果还显示不同浓度脂多糖都可以降低干细胞的增殖，并激活p-p38，这提示脂多糖促进炎性因子释放可能抑制干细胞增殖的作用要大于其促进效应^[23]。

牙髓干细胞自我修复和保护过程是一个具有多种基因、蛋白调控的复杂生物学过程。此次实验结果表明，脂多糖能影响牙髓干细胞的增殖、迁移以及定向分化能力。同时，研究还表明牙髓炎过程中TLR4可能发挥了重要作用，因此应用抗TLR4抗体可以阻断TLR4受体与脂多糖结合，阻止炎症信号进一步传导。综上所述，该研究为了解牙髓炎症反应病理损害提供了理论基础，将为预防、治疗牙髓疾病提供实验依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程