白杨素抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的小鼠破骨细胞生成

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1776

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (25): 3978-3986.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1776

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白杨素抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的小鼠破骨细胞生成

李翔翮¹，罗伟¹，胡峻贤²，杨静³，韩欣赟²，董世武⁴，杨先腾⁵，李森磊⁵，鄢志辉⁵，聂瑛洁⁶，田晓宾¹，孙立⁵

¹贵州医科大学，贵州省贵阳市 550025；²陆军军医大学第一附属医院骨科，重庆市 400038；³大坪医院创伤外科，重庆市 400042；⁴陆军军医大学生物医学材料学教研室，重庆市 400038；贵州省人民医院，⁵骨科，⁶中心试验室，贵州省贵阳市 550002

修回日期:2019-02-26 出版日期:2019-09-08 发布日期:2019-09-08
通讯作者: 田晓宾，教授，博士生导师，贵州医科大学，贵州省贵阳市 550025；通讯作者：孙立，博士，主任医师，教授，博士生导师，贵州省人民医院骨科，贵州省贵阳市 550002
作者简介:李翔翮，男，1991年生，贵州省贵阳市人，汉族，贵州医科大学附属医院(贵州省人民医院)关节外科在读硕士，主要从事干细胞靶向研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81560356)，项目负责人：田晓滨；贵州省社发攻关项目[(2015) 3044]，项目负责人：孙立

Chrysin inhibits mouse osteoclastogenesis induced by receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

Li Xianghe¹, Luo Wei¹, Hu Junxian², Yang Jing³, Han Xinyun², Dong Shiwu⁴, Yang Xianteng⁵, Li Senlei⁵, Yan Zhihui⁵, Nie Yingjie⁶, Tian Xiaobin¹, Sun Li⁵

Revised:2019-02-26 Online:2019-09-08 Published:2019-09-08
Contact: Tian Xiaobin, Professor, Doctoral supervisor, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China; Sun Li, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China
About author:Li Xianghe, Master candidate, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, Guizhou Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560356 (to TXB); Social Development Project of Guizhou Province, No. (2015) 3044 (to SL)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
白杨素：是存在于许多天然植物提取物中的黄酮醇类化合物，具有抗炎作用在内的多种生物学功能。
脂多糖：革兰阴性菌外膜的一种两亲分子，可激活免疫系统，招募包括单核细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞，刺激免疫细胞产生前体破骨细胞因子，促进破骨细胞的形成和活化，从而导致骨吸收。
活化T细胞核因子1蛋白：由P65转移入核后表达，在破骨细胞分化早期高表达，为破骨细胞分化标志基因之一，直接参与调控破骨细胞分化和骨吸收能力。

摘要
背景：白杨素存在于多种天然植物提取物的黄酮醇类化合物，具有广泛的治疗作用并且参与机体内的炎症反应，而炎症反应可增强破骨细胞生成从而导致骨侵蚀。
目的：探究白杨素在炎症环境和非炎症环境下对破骨细胞分化的影响以及对骨侵蚀的保护作用。
方法：选择RAW264.7细胞为种子细胞，首先，通过核因子κB受体活化因子配体(50 μg/L)、巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)将细胞诱导分化为破骨细胞后，以0，20，40，60 μg/L白杨素干预。其次，通过脂多糖模拟炎症环境，并将RAW264.7细胞在脂多糖诱导的炎症环境下诱导分化为破骨细胞，观察0，20，40，60 μg/L白杨素在炎症环境下对破骨细胞分化的影响。
结果与结论：①白杨素有效抑制破骨细胞分化，在60 μg/L时抑制效果达到最大；②白杨素显著抑制了破骨细胞的骨吸收功能，提示白杨素对破骨细胞造成的骨侵蚀具有保护作用；③白杨素通过核因子κB信号通路，抑制多种破骨细胞分化关键蛋白和基因表达；④白杨素对炎症有明显的抑制作用，并对炎症环境导致的破骨细胞分化有强烈的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0001-7723-9114(田晓宾)

关键词: 白杨素, 破骨细胞生成, 炎症性骨破坏, 炎症反应, 脂多糖, 骨侵蚀, 核因子κB信号通路, 核因子κB受体活化因子配体

Abstract:

BACKGROUND: Chrysin (5,7-dihydroxyflavone) is a flavonol in many natural plant extracts. It has a wide range of therapeutic effects and is involved in inflammatory reactions in the body that can enhance osteoclast formation and lead to bone erosion.

OBJECTIVE: To investigate the effects of chrysin on osteoclast differentiation and its protective effect on bone erosion in inflammatory and non-inflammatory environments.

METHODS: RAW264.7 cells were selected as seed cells. First, the RAW264.7 cells were induced with receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (50 μg/L) and macrophage colony-stimulating factor (25 μg/L) to generate osteoclasts. The cells were randomly divided into four groups according to chrysin concentration (0, 20, 40, and 60 μg/L). Second, lipopolysaccharide was used to simulate the inflammatory environment. RAW264.7 cells were induced by lipopolysaccharide to differentiate into osteoclasts, and the effect of different concentrations of chrysin (0, 20, 40, 60 μg/L) on osteoclast differentiation was observed in the same way.

RESULTS AND CONCLUSION: Chrysin effectively inhibited osteoclast differentiation, with the maximum effect at 60 μg/L. Chrysin significantly inhibited the bone absorption function of osteoclasts, suggesting that chrysin has a protective effect on bone erosion caused by osteoclasts. Chrysin suppressed the protein and gene expression related to osteoclast differentiation by nuclear factor kappa B signaling pathway. Therefore, chrysin has an anti-inflammatory effect and it is also powerful to inhibit osteoclast differentiation in an inflammatory environment.

Key words: chrysin, osteoclastogenesis, inflammatory bone destruction, inflammatory response, lipopolysaccharide, bone erosion, nuclear factor kappa B signaling pathway, receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

中图分类号:

R453
R392

李翔翮, 罗伟, 胡峻贤, 杨静, 韩欣赟, 董世武, 杨先腾, 李森磊, 鄢志辉, 聂瑛洁, 田晓宾, 孙立. 白杨素抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的小鼠破骨细胞生成[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(25): 3978-3986.

Li Xianghe, Luo Wei, Hu Junxian, Yang Jing, Han Xinyun, Dong Shiwu, Yang Xianteng, Li Senlei, Yan Zhihui, Nie Yingjie, Tian Xiaobin, Sun Li.

Chrysin inhibits mouse osteoclastogenesis induced by receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(25): 3978-3986.

图/表（结果） 3

2.1 白杨素对RAW264.7细胞活性的影响 0，20，40，60，80 μg/L白杨素处理RAW264.7细胞24-72 h后，CCK8分析结果显示，白杨素质量浓度在80 μg/L时能明显抑制细胞增殖，而在质量浓度为20-60 μg/L时，细胞增殖不受影响，见图2。因此，后续研究中白杨素的质量浓度设为20和60 μg/L。

2.2 白杨素抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和形成 用RANKL(50 μg/L)、巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)和白杨素(0，20，60 μg/L)诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞。通过抗酒石酸酸性磷酸酶染色分析白杨素对RANKL诱导的破骨细胞分化的影响。结果显示，白杨素显著抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，且以质量浓度依赖的方式抑制RAW264.7细胞中抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞数量，见图3A，B。此外，通过FAK染色分析破骨细胞中F-actin环结构的形成，F-actin环结构对破骨细胞骨吸收功能是必不可少的^[19]。结果显示，白杨素质量浓度为60 μg/L时，F-actin环结构的尺寸明显减小，见图3C-E。表明白杨素能有效抑制破骨细胞分化和形成。

2.3 白杨素在体外降低骨吸收活性 由于白杨素抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，实验利用骨陷窝形成分析白杨素是否能抑制破骨细胞体外骨吸收活性。结果显示，白杨素以浓度依赖的方式明显的抑制骨吸收面积，见图4。

2.4 白杨素抑制RANKL诱导的破骨细胞标志基因表达 为进一步阐明白杨素对破骨细胞分化的影响，实时定量PCR结果显示，在破骨细胞分化过程中，RANKL显著上调破骨细胞特异性基因NFATc1、C-FOS、组织蛋白酶K、抗酒石酸酸性磷酸酶、OC-STAMP、DC-STAMP的mRNA表达水平。而白杨素以浓度依赖的方式对上述mRNA表达具有抑制作用，见图5A-F。Western blot分析结果表明，RANKL明显上调了NFATc1和C-FOS的表达，而白杨素则抑制这2种蛋白的表达图5G。该结果与实时定量PCR结果一致。表明白杨素在体外可以抑制RANKL诱导的破骨细胞关键基因表达。

2.5 白杨素通过抑制核因子κB信号通路来抑制破骨细胞分化 RANKL诱导的核因子κB信号通路的激活对破骨细胞的分化和功能是必不可少的^[20]。为了探讨白杨素在破骨细胞发生中的作用机制，在白杨素(60 μg/L)存在或不存在的条件下，用RANKL(50 μg/L)和巨噬细胞集落刺激因子 (25 μg/L)分别处理RAW264.7细胞0，15，30和60 min，Western blot分析结果显示，当白杨素(60 μg/L)存在时，核因子κB p65的磷酸化表达被白杨素下调。实验进一步发现，白杨素同时还显著抑制IκBα的磷酸化和退化，见图5H-M。表明，白杨素通过减弱核因子κB信号通路的活性来抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。

2.6 白杨素下调脂多糖诱导的破骨细胞形成 为了研究白杨素在脂多糖介导的炎症条件下对破骨细胞分化的影响，RAW264.7细胞使用RANKL(50 μg/L)和巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)预处理24 h。然后，这些细胞再用脂多糖(100 μg/L)和白杨素(0，20，60 μg/L)孵育72 h，诱导细胞分化为破骨细胞，抗酒石酸酸性磷酸酶染色用来分析脂多糖诱导的破骨细胞分化。作者观察到抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核破骨细胞呈浓度依赖性的减少，见图6A，B。

为了进一步研究白杨素对脂多糖诱导破骨细胞分化的影响，采用实时定量PCR方法对多种破骨细胞标志基因进行分析。如图6所示，白杨素明显下调这些标记基因的表达，与抗酒石酸酸性磷酸酶染色结果一致，见图6C-H。

同样，利用Western blot分析脂多糖诱导的NFATc1和C-FOS蛋白表达，也获得了相同的结果，NFATc1和C-FOS的蛋白表达均明显降低，见图6I，M，N。表明白杨素在脂多糖诱导的炎症条件下对破骨细胞的形成有负性调节作用。

因为白杨素抑制脂多糖诱导的破骨细胞形成，因此分析了在脂多糖刺激条件下，能够促进破骨细胞形成并导致骨丢失的促炎细胞因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6)的表达情况。实时定量PCR在mRNA水平上分析这些基因的表达。结果显示白杨素能显著抑制这些促炎细胞因子基因的表达，见图6J-L。

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引言

骨溶解是引起骨质疏松、关节炎、骨肿瘤、Paget病和无菌性松动等多种破坏性骨骼疾病的关键病理过程。这些疾病的主要原因均为炎症和创伤^[1]。例如促炎细胞因子的产生和被白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等促炎因子刺激后，破骨细胞生成增多和活性增强^[2]。这些过程的共同因素是炎症递质的局部水平增高，从而促进破骨细胞的分化和骨吸收，导致骨量的丢失^[3]。具体的来说，这些促炎细胞因子通过激活在破骨细胞分化中重要的信号通路——骨保护蛋白/核因子κB受体活化因子/核因子κB受体活化因子配体(osteoprotegerin/receptor activator of NFκB/receptor activator of NF-κB ligand，OPG/RANK/ RANKL)信号通路和核因子κB信号通路，诱导并激活在破骨细胞分化、形成和调节破骨细胞骨吸收功能中都起到关键作用的因子——活化T细胞核因子1蛋白(nuclear factor of activated T cell 1，NFATc1)，最终导致骨质溶解疾病中的骨质破坏^[4]。

破骨细胞起源于单核/巨噬细胞前体，是融合多核巨细胞，是惟一负责骨吸收的细胞类型^[5]。RANKL和巨噬细胞集落刺激因子共同作用有效的促进破骨细胞生成。当RANKL和其配体结合后，激活一系列的信号通路，其中就包括典型与非典型的核因子κB信号通路^[6]。一系列的分子信号导致了核因子κB转移进入细胞核并且激活破骨细胞分化转录因子NFATc1和核蛋白转录因子(C-FOS)，这两个分子共同参与了包括抗酒石酸磷酸酶5、基质金属蛋白酶9和组织蛋白酶K在内的多种破骨细胞分化关键基因转录的调控并最终导致破骨细胞的形成^[7]。

目前，使用相关药物抑制破骨细胞的功能广泛应用于骨溶解性疾病的治疗，但是都不可避免的产生许多严重的不良反应^[8]。例如，长期使用双膦酸盐导致长骨不典型骨折、下颌骨坏死和潜在的食管癌^[9]。因此，开发治疗骨溶解性疾病的新药具有十分重要的意义。

白杨素(5，7-二羟基黄酮)是存在于蜂蜜、蜂胶和许多天然植物提取物中的黄酮醇类化合物^[10]，结构式见图1。大量研究证实黄酮类化合物具有广泛的治疗作用，如抗肿瘤活性、抗炎、抗氧化、抗过敏、抗衰老、抗高血压、抗血管生成、抗病毒、抗动脉粥样硬化、抗菌、抗糖尿病、神经保护、保肝、肾保护和对生殖系统的积极影响^[11-14]。最近研究发现，白杨素可以抑制血清中主要炎性细胞因子(核因子κBp65，肿瘤坏死因子α，白细胞介素1β和白细胞介素6)和诱导型一氧化氮合酶活性，此外，越来越多的证据表明白杨素表现出抗炎活性并抑制免疫炎症反应^[15-17]。正如之前提到的，促炎细胞因子能够导致破骨细胞生成增多和骨吸收活性增强并最终导致骨质破坏，并且核因子κB信号通路参与其中，所以作者提出假设：白杨素过通过抑制核因子κB信号通路活性，抑制炎症反应，抑制破骨细胞分化及其骨吸收活性，在骨溶解疾病中起到保护作用。

此次实验拟通过观察破骨细胞形态、分析破骨细胞相关基因和蛋白质表达，检测核因子κB信号通路在破骨细胞分化的整个过程中所发挥的作用来研究白杨素对破骨细胞分化和骨吸收功能的影响，探讨白杨素对溶骨性疾病的保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学实验。

1.2 时间及地点 实验于2018年5至11月在陆军军医大学生物医学材料学教研室完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞 巨噬细胞谱系细胞株RAW264.7由美国模式培养物集存库提供。

1.3.2 实验用主要试剂及仪器 重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠RANKL购自美国R&D Systems公司；CCK8试剂盒购自北京Solarbio公司；白杨素(纯度>95%)、抗酒石酸酸性磷酸酶染色试剂盒和脂多糖购自美国Sigma-Aldrich公司；DMEM和胎牛血清购自美国Gibco公司；NFATc1和C-FOS抗体购自美国Abcam公司。TRIzol试剂盒、磷酸化-核因子κB p65，核因子κB p65，磷酸化IκBα，IκBα一抗购自美国Cell Signaling Technologies公司；β-Actin多克隆抗体购自美国Bioworld Technology公司；TRIzol购自美国Life Technologies公司；反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq II购自日本TaKaRa Bio, Inc.；骨吸收用胶原孔板购自美国Corning公司；96孔读板机购自美国Bio Tek公司；光学显微镜(DMI 6000b)购自德国Leica公司；PCR检测系统、chemdoc XRS+成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养

1.4.2 细胞毒性实验 RAW264.7细胞(3×10³个)接种在3块96孔板上，用以检测白杨素的细胞毒性。在37 ℃，体积分数5%CO₂条件下孵育24 h之后，细胞用不同质量浓度的白杨素(0，20，40，60，80 μg/L)处理24-72 h。在细胞培养到指定时间后，更换细胞培养基，每孔加入含有1/10 CCK-8试剂的新鲜培养基并在37 ℃下孵育2 h，之后在96孔读板机下检测各孔在450 nm波长处的吸光度。整个实验过程依据CCK8试剂盒说明书执行。

1.4.3 破骨细胞分化 为诱导破骨细胞分化，将RAW264.7细胞(3×10³个)接种于96孔板中，培养过夜。用含体积分数10%胎牛血清和1%青-链霉素的DMEM培养基、RANKL(50 μg/L)、巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)以及不同质量浓度的白杨素(20，40，60 μg/L)培养72 h，使RAW264.7细胞分化为破骨细胞。含有3个或3个以上细胞核的多核细胞认为是破骨细胞^[18]。空白对照组仅用基础培养基培养；对照组为RANKL(50 μg/L)+巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)或脂多糖(100 μg/L)诱导为破骨细胞并且白杨素质量浓度为0 μg/L。

1.4.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色和FAK染色 RAW264.7细胞(3×10³个)接种在96孔板中，培养24 h后，加入RANKL (50 μg/L)、巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)和不同质量浓度的白杨素(0，20，40，60 μg/L)培养72 h，每3 d更换一次培养基。达到指定的时间后，吸出培养基，PBS洗涤细胞2次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，抗酒石酸酸性磷酸酶染色液按说明进行配置并染色。抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞包含3个或3个以上的细胞核认为是破骨细胞，并在光学显微镜下计数。

研究白杨素在脂多糖诱导的条件下对破骨细胞分化的影响，RAW264.7细胞(3×10³个)接种在96孔板中，使用RANKL(50 μg/L)和巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)预处理24 h。然后更换含有脂多糖(100 μg/L)的培养基与不同质量浓度白杨素(0，20，40，60 μg/L)再培养7 h，诱导RAW264.7细胞分化为破骨细胞，培养基每3 d换一次。72 h后，细胞按前述方法进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色。抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞包含3个或3个以上的细胞核认为是破骨细胞，并在光学显微镜下计数。

RAW264.7细胞(3×10³个)接种在96孔板中，RANKL (50 μg/L)+巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)及不同质量浓度的白杨素(0，20，40，60 μg/L)培养72 h诱导细胞分化为破骨细胞，并依据FAK试剂盒说明书对RANKL诱导的破骨细胞进行FAK染色。

1.4.5 骨吸收陷窝检测 RAW264.7细胞(3×10个)接种在骨吸收用胶原孔板上，用RANKL(50 μg/L)，巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)和不同剂量的白杨素(0，20，40，60 μg/L)培养7 d，将RAW264.7细胞诱导分化成为破骨细胞。在第7天，室温下次氯酸钠裂解细胞5 min，蒸馏水洗涤2次，单个坑或多个坑集群使用光学显微镜观察并用ImageJ1.46r (美国NIH)分析了吸收区域。

1.4.6 实时定量PCR RAW264.7细胞(3×10⁴个)接种在12孔板上，并用RANKL(50 μg/L)，巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)和不同剂量的白杨素(0，20，40，60 μg/L)培养72 h，诱导分化破骨细胞。同时，RAW264.7细胞以同样浓度接种在另一块12孔板上，RANKL(50 μg/L)和巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)预处理24 h，之后用脂多糖(100 μg/L)与不同剂量的白杨素(0，20，40，60 μg/L)培养72 h，诱导分化为破骨细胞。

采用TRIzol分离总RNA，利用反转录试剂盒将RNA合成为cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II和PCR检测系统进行实时定量PCR分析，以GAPDH为内参。引物序列如表1所示。

1.4.7 Western blot分析 将RAW264.7细胞(3×10⁵个)接种在6孔板中，按之前描述的方法诱导为破骨细胞。同时，RAW264.7细胞以同样浓度接种在另外4块6孔板中，分别以0，60 μg/L白杨素预处理2 h，之后用RANKL(50 μg/L)和巨噬细胞集落刺激因子(25 μg/L)分别处理0，15，30和60 min。随后PBS洗涤细胞2次，在裂解缓冲液(10 mmol/L Tris，pH 7.2，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，0.1% SDS，1% Triton X-100，1%脱氧胆酸)中加入蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂裂解细胞。蛋白样品(30 µg)通过电印记法转移在聚偏二氟乙烯膜上。之后用体积分数5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃下孵育过夜(抗体浓度分别为：C-FOS 1∶1 000，NFATc1 1∶1 000，核因子κB p65 1∶1 000，磷酸化-核因子κB p65 1∶1 000，IκBα 1∶1 000，p-IκBα 1∶1 000，β-actin 1∶5 000)。接下来，用TBST冲洗聚偏二氟乙烯膜膜3次，每次10 min，二抗(1∶5 000)室温孵育1.5 h。孵育完成后用TBST洗涤3次，每次10 min。抗体反应通过chemdoc XRS+成像系统进行分析，β-actin作为内参。

1.5 主要观察指标 ①TRAP染色观察破骨细胞形态；②FAK染色观察破骨细胞融合；③Western blot观察NFATc1、C-FOS蛋白表达；P65和IκBα蛋白表达及其磷酸化；④实时定量PCR观察NFATc1、C-FOS、DC-STAMO、OC-STAMP、TRAP和组织蛋白酶K mRNA的表达情况。

1.6 统计学分析 所有数据至少进行3次独立实验，采用GraphPad Prism 7统计学软件分析，实验数据以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差及t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨重塑是以骨吸收和骨形成依次发生在同一部位为特征，参与骨重塑的细胞严格按照时间、部位和功能活动进行协调。因此，骨重建是骨吸收和骨形成的有序耦合的过程，分为起始、过渡和终止阶段^[21]。破骨细胞前体的招募、分化、活化和骨吸收发生在起始阶段。在过渡阶段，骨吸收活性逐渐受到抑制，破骨细胞通过细胞死亡调节剂/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3轴或Fas/fasl调控的程序性细胞死亡反馈形成新骨。最后，在终止阶段，骨吸收完全修复，局部骨重建活动进入静止阶段，而过多的破骨细胞形成和骨吸收是许多骨溶解性骨病的主要机制^[22]。

破骨细胞属于单核/巨噬细胞谱系，主要来源于从造血干细胞分化而来的巨噬细胞^[23-24]。造血干细胞分化为多能单核/巨噬细胞谱系细胞的前体后，通过各种基因调控，细胞因子的直接或间接刺激，通过增殖、分化、存活和融合^[25]，发育为多核成熟破骨细胞。破骨细胞是惟一具有吸收和重塑骨骼能力的生物多核巨细胞。它们在骨发育、骨形成、骨吸收和骨量调节中起着关键作用。然而，目前涉及抑制破骨细胞分化来治疗骨丢失的方法，受到一些不良反应的挑战，如二膦酸盐骨坏死^[8]；因此，需要一种安全有效、不良反应小的治疗方法。实验证明白杨素显著地抑制破骨细胞形成和骨吸收，下调破骨细胞相关基因表达和减弱RANKL诱导的核因子κB和NFATc1活性。表明白杨素是一种有效的抑制破骨细胞分化和骨吸收的自然提取物。

RANKL在破骨细胞分化和功能形成的过程中是促进破骨细胞生成的关键因素，在单核巨噬细胞系诱导破骨细胞分化过程中发挥着独特的作用^[26]。RANKL诱导细胞向破骨细胞的最终分化包括以下步骤：①活化抗酒石酸酸性磷酸酶：参与骨吸收和破骨细胞的表达标志物；②抗酒石酸酸性磷酸酶阳性细胞肌动蛋白环，形成多核破骨细胞^[27]。此外，许多研究指出，RANKL与破骨细胞前体上的配体结合，触发并激活一系列的下游信号通路，其中就包括RANKL介导的核因子κB信号通路。通常，核因子κB与IκB-α (一种抑制亚基)以非活性的形式保留在细胞质中^[28]。当RANKL结合RANK，并通过泛素依赖方式磷酸化和IκB-α退化，并导致p65从胞质转移至细胞核，从而激活靶基因NFATc1、C-FOS的转录，紧接着触发多个破骨细胞相关基因的转录激活，这个过程是破骨细胞分化和发挥功能所必须的^[29-30]。然而，白杨素可以减弱P65和IκB的磷酸化，导致P65入核减弱并抑制NFATc1的生成，因此，抑制核因子κB核易位可以考虑为白杨素参与抑制破骨细胞分化的作用机制。

另一个不可或缺的调节破骨细胞形成的转录因子——NFATc1，在RANKL信号通路中调控破骨细胞特异性基因的表达也发挥着重要作用^[31]。破骨细胞的早期分化，NFATc1的表达增强是通过与转录因子结合，其中就包括核因子κB^[32-33]。因此，抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶9等被NFATc1调控的破骨相关基因在RANKL诱导的最终分化阶段高表达，从而促进骨吸收^[34-35]。结果表明，白杨素对RANKL诱导的NFATc1表达具有质量浓度依赖性的抑制作用。白杨素还能降低大多数破骨细胞相关基因的表达水平。然而，目前尚不清楚白杨素通过核因子κB信号通路直接还是间接的抑制NFATc1的表达，或者白杨素能够靶向抑制核因子κB信号通路。但我们的研究结果表明，白杨素在调控破骨细胞分化和骨吸收功能上，抑制NFATc1的表达和抑制核因子κB通路的活性可能起到至关重要的作用。

白杨素是存在于自然界中的黄酮醇类化合物，具有多种生物学功能^[36]。在此次实验中首次证实了白杨素抑制核因子κB信号通路的激活，从而抑制RANKL介导破骨细胞分化，减少骨吸收，并减少脂多糖诱导的炎症反应。提示白杨素在破骨细胞相关疾病中的潜在的预防和治疗价值。

脂多糖是存在于革兰阴性菌外膜的一种两亲分子，可激活免疫系统，招募包括单核细胞和巨噬细胞在内的免疫细胞，刺激免疫细胞产生前体破骨细胞因子，促进破骨细胞的形成和活化，从而导致骨吸收^[37]。各种研究表明，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6作为促炎细胞因子和改变白细胞浸润的性质最终导致急性炎症成为慢性炎症^[38]。因此，慢性炎性疾病和脂多糖诱导的小鼠模型显示骨密度降低，骨质脆性增加，易感性和促炎细胞因子活性增强。因此研究了白杨素对脂多糖诱导骨丢失的预防作用。结果证明，白杨素减少破骨细胞生成，有效减少促炎细胞因子如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6的表达。但在整个实验过程中，不能排除白杨素可能影响成骨细胞的形成。因此，白杨素对成骨细胞功能的影响是下一步研究的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

白杨素抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的小鼠破骨细胞生成

Chrysin inhibits mouse osteoclastogenesis induced by receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

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