2.1  参与者数量分析  纳入患者28例和健康受试者28名，试验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2  受试者基本资料及分组流程  2组受试者基本资料见表2；分组流程图见图1。

2.3  中性粒细胞分离结果  使用密度梯度分离法分离外周血中性粒细胞，将多形核细胞分离成单独的层。然后收集富含嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的细胞层。细胞用PE缀合的抗体染色：CD3、CD4、CD8、CD14、CD20和Seglic-8，形成用于排除嗜酸性粒细胞(Seglic-8⁺)和残留单核细胞、淋巴细胞的转储通道。然后使用细胞分选仪将中性粒细胞(PE信号阴性的细胞群)分选出来并悬浮在不含Ca²⁺/Mg²⁺的HBSS中以供进一步使用。流式细胞术检测中性粒细胞特异性标志物CD66b和CD16，评估结果中性粒细胞纯度超过95%，见图2A。

2.4  细胞因子刺激后中性粒细胞中白细胞介素17A和白细胞介素17F的mRNA表达  在用Th-17细胞因子刺激后，测量了从健康和哮喘受试者分离的外周血中性粒细胞上白细胞介素21受体和23受体的表达水平，见图2B。

在用白细胞介素21和白细胞介素23调节细胞因子刺激分离的中性粒细胞后，从哮喘患者中分离出的中性粒细胞中白细胞介素17A和白细胞介素17F mRNA表达明显增加，而在来自健康受试者的细胞中，这些刺激没有显著的效果，见图2C，D。

细胞因子浓度较高(高达100 μg/L)的刺激对哮喘和对照中性粒细胞的影响相似(数据未显示)。与相应的非刺激对照相比，在哮喘受试者中观察到白细胞介素17A表达增加2.0-2.2倍，白细胞介素21(2.35倍，P ≤ 0.001)和白细胞介素23(2.08倍，P ≤ 0.001)以及组合(白细胞介素21+白细胞介素23：2.43倍，P ≤ 0.001)，见图2C。白细胞介素21和白细胞介素23细胞因子相对于哮喘患者的非刺激对照也诱导白细胞介素17F表达增加2.0-2.5倍(白细胞介素21：2.49倍，P ≤ 0.001；白细胞介素23：2.04倍，P ≤ 0.001；白细胞介素21+白细胞介素23：2.46倍，P ≤ 0.001)，见图2D。阳性对照白细胞介素6也显著诱导哮喘中性粒细胞的白细胞介素17A和白细胞介素17F mRNA表达，见图2C，D。

图2E和F分别比较来自严重哮喘患者和自健康受试者的中性粒细胞之间白细胞介素17A和17F mRNA的表达。当用白细胞介素21，白细胞介素23或组合刺激时，来自哮喘的中性粒细胞中的表达白细胞介素17A和白细胞介素17F显著大于健康对照中的表达。

2.5  流式细胞术检测细胞因子刺激后中性粒细胞中白细胞介素17A和白细胞介素17F的表达  通过流式细胞术定量了细胞因子刺激后表达白细胞介素17A和白细胞介素17F的中性粒细胞的百分比，见图3。

与从健康受试者分离的中性粒细胞相反，哮喘患者中性粒细胞对Th-17调节细胞因子的刺激作出反应而产生白细胞介素17细胞因子显著增加。用白细胞介素21，23，6刺激哮喘中性粒细胞后，白细胞介素17A和白细胞介素17F阳性细胞的频率均显著升高(白细胞介素21刺激P=0.05，P=0.01；白细胞介素23刺激P=0.05，P=0.008；白细胞介素6刺激P=0.04，P=0.04)；用细胞因子的组合刺激神经营养素导致白细胞介素17A(P=0.003)和白细胞介素17F(P= 0.003)的最高表达频率；从任何Th-17调节细胞因子刺激后，从健康对照中分离的中性粒细胞没有显著升高白细胞介素17阳性细胞，见图3A和B。事实上，如图3A，B所示，在大多数情况下，哮喘患者中性粒细胞对细胞因子刺激的反应明显高于健康人群中性粒细胞。哮喘中性粒细胞中白细胞介素17A和白细胞介素17F表达的代表性数据分别显示在图3C，D中。

此外，作者还分析白细胞介素17A和白细胞介素17F的平均荧光强度(MFI)作为白细胞介素17阳性细胞内表达强度的估计。与未刺激比较，白细胞介素17A的平均荧光强显著增加(白细胞介素21：2.04倍，P=0.003；白细胞介素23：2.32倍，P ≤ 0.001；白细胞介素6：1.42倍，P > 0.05；白细胞介素21+白细胞介素23：2.46倍，P ≤ 0.001)和白细胞介素17F(白细胞介素21：2.35倍，P=0.004；白细胞介素23：2.50倍，P重度哮喘≤ 0.001；白细胞介素6：2.07倍，P=0.03；白细胞介素21+白细胞介素23：2.59倍，与基线相比，刺激性哮喘中性粒细胞P ≤ 0.001)。哮喘中性粒细胞的这些白细胞介素17A平均荧光强水平也显著高于对照组，见图4。

同时，分析了中性粒细胞增强的白细胞介素17细胞因子的产生通过Western免疫印迹在全细胞裂解物中用Th-17调节细胞因子刺激。在低强度下存在15-20 ku的白细胞介素17A免疫反应条带非刺激细胞，而表达随白细胞介素21，白细胞介素23，白细胞介素21+白细胞介素23和白细胞介素6(阳性对照)细胞因子刺激显著增加；测量数据进一步证实细胞因子刺激后白细胞介素17A产量增加两三倍(白细胞介素21刺激后增加3.24倍，P=0.002；白细胞介素23刺激后增加2.92倍，P=0.009；白细胞介素21+白细胞介素23细胞因子刺激后增加2.52倍，P= 0.015)，见图5。

2.6  白细胞介素21/白细胞介素23诱导的中性粒细胞中白细胞介素17产生及STAT3途径激活  见图6。

用白细胞介素21+23细胞因子刺激哮喘中性粒细胞 15 min，通过流式细胞术定量磷酸化激活的STAT3阳性细胞百分比(pSTAT3)。与未刺激的细胞相比(18.0%)，用白细胞介素21+白细胞介素23刺激后pSTAT3显著增加(44.3%，P=0.005)，见图6A。在存在Stattic(Sc-202818)的情况下刺激细胞后，pSTAT3的这种增加显著降低(20.1%，P=0.002)。用白细胞介素21+23或白细胞介素6细胞因子刺激健康的中性粒细胞可上调pSTAT3水平，但不显著。使用Sc-202818可抑制白细胞介素21+白细胞介素23诱导的磷酸化，见图6A，B。

在存在或不存在Sc-202818的情况下，细胞被饥饿并用白细胞介素21+白细胞介素23细胞因子刺激，然后通过流式细胞术测定表达白细胞介素17A和白细胞介素17F的细胞的频率。在缺乏白细胞介素21+白细胞介素23细胞因子刺激神经营养素时，观察到白细胞介素17A阳性细胞显著增加(22.3% vs. 白细胞介素21+白细胞介素23：42.6%，P=0.011)抑制剂，见图6C。对于白细胞介素17F观察到类似的结果(27.50% vs. 白细胞介素21+白细胞介素23：55.3%，P=0.009)，见图6D。然而，当使用Sc-202818抑制STAT3磷酸化时，白细胞介素17A阳性细胞明显减少(22.3% vs. 白细胞介素21+白细胞介素23：23.5%，P=0.020)和白细胞介素17F(观察到27.5% vs. 白细胞介素21+白细胞介素23：18.6%，P=0.003)，表明白细胞介素21和白细胞介素23诱导的中性粒细胞中白细胞介素17的表达需要STAT3磷酸化，见图6C，D。直方图反映了在存在或不存在Sc-202818的情况下用白细胞介素21+白细胞介素23刺激后白细胞介素17A和白细胞介素17F表达的哮喘细胞百分比，见图6E，F。

既往的研究已经证实中性粒细胞和Th-17细胞在重症哮喘发病机制中发挥着重要的作用^[1]。根据痰液分析，哮喘表型可分为嗜酸性粒细胞型、中性粒细胞、混合细胞型(嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞)和低粒细胞型^[2]。虽然轻度哮喘患者的气道组织通常以嗜酸性粒细胞浸润和Th-2细胞因子为特征，但在重症哮喘或持续性哮喘患者的肺组织中，中性粒细胞能够优先被Th-17细胞浸润并导致白细胞介素4，6，8，17，21，23和转化生长因子β的表达水平升高^[3]。在这些患者中，过敏可引起气道强烈的Th-17炎症反应，并伴有中性粒细胞浸润和急性气道高反应^[4]。

一般而言，中性粒细胞通过进入感染部位而发挥吞噬防御作用，并破坏入侵的微生物^[5]。然而，在哮喘患者的肺组织中，这些细胞与Th-17淋巴细胞一起释放介质，并导致持续的炎症状态，这些介质直接或间接地刺激气道平滑肌细胞的增殖和迁移，导致气道变窄，使呼吸变得困难^[6]。更重要的是，有证据表明中性粒细胞确实与Th-17细胞直接或间接地交换生化信号^[7]。

体外实验表明，哮喘患者的中性粒细胞对来自非哮喘患者的兴奋剂反应不一，表明患者体内细胞中发生了生理和生化变化^[8]。因此，由于已知Th-17调节细胞因子，白细胞介素21、白细胞介素23和白细胞介素6在哮喘中被活化，假设这些细胞因子可激活哮喘患者的外周中性粒细胞以产生白细胞介素17A和白细胞介素17F细胞因子，哮喘患者中性粒细胞对刺激的反应可能与非哮喘患者的中性粒细胞反应不同。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  病例-对照。

1.2  时间及地点  实验于2017年5月至2018年5月在桂林医学院附属医院完成。

1.3  对象  共计28例哮喘患者，其中14例男性和14例女性，平均年龄(32.5±4.3)岁；28名正常健康受试者，其中14名男性和14名女性，平均年龄(34.1±5.4)岁。

1.3.1  严重哮喘诊断标准  参照2017年重度哮喘诊断与处理中国专家共识进行诊断。严重哮喘患者需要满足以下2个标准：每日需要短效β-激动剂，或持续强迫呼气量(FEV1)<60%和FEV1/FVC(用力肺活量)<75%，或前一年至少3次类固醇爆发，或者在过去3年内因类固醇剂量减  少<25%或过去3年内曾出现几乎致命的哮喘发作。

1.3.2  纳入标准  ①患者均符合严重哮喘诊断标准，被桂林医学院附属医院诊断为严重哮喘；②患者外周血中性粒细胞计数高(>65%)；③患者在前一年接受高剂量吸入糖皮质激素或每日抗白三烯治疗的比例超过50%，并且每年接受至少1次其他附加治疗；④患者和对照受试者签署了书面知情同意书。

1.3.3  排除标准  ①服用奥马珠单抗、有吸烟史或任何其他慢性肺病或其他疾病、合并其他疾病，包括胃食管反流病(GERD)或肥胖患者(体质量指数高于30 kg/m²)的患者；②对照受试者是吸烟者，肺功能测试异常，有过敏史或慢性呼吸道疾病，并且在过去4周内未服用任何药物者。

该研究由桂林医学院附属医院的伦理委员会审查和批准，伦理审批号：院字2017第013号。

1.4  方法

1.4.1  中性粒细胞的分离  在肝素化试管中收集外周血样品(40 mL/人)，使用密度梯度分离方法分离外周血中性粒细胞供进一步使用。通过流式细胞仪(LSRII，Becton Dickinson，USA)检测中性粒细胞特异性标志物CD66b和CD16(R&D Systems)，评估中性粒细胞纯度是否超过95%。

通过Cytospin分析测定纯化的细胞含有<0.5%的单核细胞/淋巴液，并且没有嗜酸性粒细胞污染，使用qRT-PCR测定CD3、CD4、CD8和CD161 mRNA的表达。若没有观察到CD161 mRNA的表达，表明分离株中不存在Th-17细胞。通过锥虫蓝排除试验测定，中性粒细胞存活率>97%。然后在含有体积分数10%胎牛血清的1640培养基中培养中性粒细胞，并现配现用。

1.4.2  RT-PCR测定  用白细胞介素21、白细胞介素23、白细胞介素21+白细胞介素23或白细胞介素6细胞因子 (20 μg/L)刺激或不刺激中性粒细胞(每次处理3×10⁵个细胞)4 h进行评估。使用RNA分离试剂盒(RNeasy Mini kit，Qiagen，CA，USA)提取RNA。使用M-MLV反转录酶(Promega Corporation，Maddison，WI，USA)将RNA反转录成cDNA。然后通过实时定量PCR(AB H7900 Fast R-T-PCR，Applied Biosystems)扩增cDNA。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)用作内部参考。使用SYBR Green Master PCR混合物(Applied Biosystems)，如前所述，使用特异性cDNA引物(Integrated DNA Technologies，Leuven，Belgium)扩增白细胞介素17A、白细胞介素17F、白细胞介素21R、白细胞介素23R和GAPDH。对每位患者进行3次测量，使用RQ Manager软件(Applied Biosystems)测定基因表达相对于GAPDH的定量和表达的倍数变化。引物序列见表1。

1.4.3  流式细胞仪分析  从哮喘和健康受试者分离的中性粒细胞用细胞因子白细胞介素21、白细胞介素23、白细胞介素21+白细胞介素23和/或白细胞介素6(20 μg/L)进行刺激(每次处理3×10⁵个细胞)12 h。用布雷菲德菌素A处理细胞最后4 h以增强细胞内细胞因子的检测，12 h细胞存活率>75%。用CD66b-PE(R&D Systems)染色细胞15 min。然后将它们用4%PFA固定15 min，用0.25%皂苷进行1h固定，并用荧光团缀合的抗白细胞介素17A-APC(R&D Systems)在黑暗中染色30 min，抗白细胞介素17F-FITC和抗-IgG同种型抗体(R&D System)，遵循标准技术。对每位患者进行3次测量。使用LSRII流式细胞仪和DIVA软件(BD Biosciences，CA，USA)分析细胞。

1.4.4  Phosflow分析  进行磷酸盐测定以确定中性粒细胞酪氨酸磷酸化STAT3(pSTAT3)的不同。对每位患者进行3次测量。在另一组实验中，测试了pSTAT3是否是白细胞介素17产生所必需的。在存在或不存在STAT3 转录因子抑制剂(Sc-202818，2.5 μmol/L)的情况下，同样用白细胞介素21或白细胞介素23细胞因子刺激嗜中性粒细胞。温育 12 h后，将布雷菲德菌素A加入细胞中并继续培养1 h。用抗白细胞介素17A和白细胞介素17F抗体染色细胞，并用BD LSR II流式细胞仪和DIVA软件定量。

1.4.5  Western blot分析  在0.5%FBS培养基中饥2 h的中性粒细胞(3×10⁶个细胞)用白细胞介素21、白细胞介素23、白细胞介素21+白细胞介素23或白细胞介素6(20 μg/L)刺激18 h。18 h细胞存活率>70%。使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche，Mannheim，Germany)的裂解缓冲液   (50 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠，1%Triton X-100)提取蛋白质。将蛋白质裂解物(20 μg)在10%丙烯酰胺十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上分离并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并依次用抗肌动蛋白和抗白细胞介素17A一抗探测印迹(0.5 mg/L，R&D Systems)，二抗使用IRDye-缀合的IgG。使用Odyssey成像软件3.0(Li-COR Biosciences，Inc)，用Odyssey CLx扫描仪分析信号。

1.5  主要观察指标  ①Th-17调节细胞因子白细胞介素21和白细胞介素23在中性粒细胞中诱导白细胞介素17A和白细胞介素17F表达；②白细胞介素21/白细胞介素23诱导的中性粒细胞中白细胞介素17产生及STAT3途径激活结果。

1.6  统计学分析  使用方差分析(ANOVA)随后进行Bonferroni-Dunn事后检验评估白细胞介素17细胞因子的表达；进行双因素方差分析以确定正常和严重哮喘之间的平均值是否存在显著差异；非参数Mann-Whitney U 检验(Systat，7.0版，SPSS，Chicago，IL)用于评估转录激活因子3(STAT3)的差异磷酸化的显著性；P < 0.05时认为差异有显著性意义。

尽管最近报道白细胞介素17产生的外周血CD177⁺中性粒细胞在过敏性哮喘受试者中有所增加^[9]，但所涉及的介质和机制尚未得到很好的研究。在此次研究中，发现与从健康对照分离的中性粒细胞相比，从哮喘患者中分离的人外周血中性粒细胞在用Th-17调节细胞因子白细胞介素21、白细胞介素23、白细胞介素6单独刺激后产生白细胞介素17A和白细胞介素17F，以及白细胞介素21+白细胞介素23组合具有更高的效力。这表明哮喘神经营养因子被引发或极化以更好地响应白细胞介素21和白细胞介素23细胞因子刺激。白细胞介素6已知可增强白细胞介素21受体和白细胞介素23受体的细胞表达^[10]，其在哮喘患者的外周血中显著上调^[11]。白细胞介素6可作用于哮喘中性粒细胞以上调白细胞介素21受体和白细胞介素23受体的水平，这可能有助于增强它们对细胞因子刺激的反应。事实上，作者观察到，与健康受试者相比，从哮喘患者中分离的中性粒细胞中这些受体略有增加，但没有达到显著水平。值得注意的是，STAT3是白细胞介素21、白细胞介素23和白细胞介素6信号传导的主要调节因子^[12]，并增加中性粒细胞在内的各种细胞类型中白细胞介素17的表达^[13]，且在调节RORγt的表达中具有关键作用。

细胞因子诱导的哮喘中性粒细胞中STAT3磷酸化的增加可诱导RORγt表达，其导致白细胞介素17产生的上调。与仅用一种细胞因子刺激相比，用白细胞介素17产生刺激性哮喘中性粒细胞与细胞因子的组合具有相加的效果。此外，在用几乎每种Th-17调节细胞因子刺激后，与白细胞介素17A相比，白细胞介素17F能够更显著的升高。这可能是由于另一种调节机制涉及其他STAT因子成员，如STAT1或STAT5，在用Th-17调节细胞因子刺激时被激活^[14]。研究发现在低白细胞介素2、高白细胞介素6的条件下，STAT3信号主导白细胞介素17A和白细胞介素17F产生^[15]。然而，在高白细胞介素2和高白细胞介素6条件下，STAT5抑制白细胞介素17A转录，而STAT3维持白细胞介素17F的表达，因为STAT5在白细胞介素17F基因座处取代STAT3被阻   止^[16]。已知白细胞介素6在哮喘患者中上调^[17]，而白细胞介素2在非过敏性重症哮喘患者的呼出气冷凝物中显著上调^[18]。因此，在患有特应性哮喘的患者中，例如参与此次研究的患者，STAT3信号可能主导并驱动白细胞介素17A和白细胞介素17F细胞因子的产生。此外，在用白细胞介素21/白细胞介素23刺激后，对照组中性粒细胞中STAT3适度增加，但未达到显著水平。 Sc-202818还抑制白细胞介素21+白细胞介素23诱导的STAT3磷酸化，证实在健康的中性粒细胞中细胞因子触发该途径。然而，STAT3磷酸化的这种增加不足以诱导显著的白细胞介素17产生。白细胞介素21/23受体对哮喘细胞与健康细胞表达水平的差异并不能解释哮喘和健康中性粒细胞之间STAT3磷酸化的不同增加。一个可能的解释是，在哮喘等炎症性疾病中，STAT3-RORγt途径可以引发对白细胞介素21/白细胞介素23刺激的有效反应。或者，除了STAT3之外，其他递质/途径可以在炎症状态下共同调节白细胞介素17产生，并且在正常条件下可能不存在。

越来越多的证据证实，白细胞介素17细胞因子在自身免疫和各种炎症性疾病中起着关键作用，此外还有其在防止细菌和真菌感染的作用^[19]。由于白细胞介素17产生或信号传导缺陷导致白细胞介素17反应受损的基因突变患者表现出对粘膜皮肤念珠菌病的易感性^[20]。尽管Th-17细胞被认为是白细胞介素17的主要来源，但已显示其他细胞也能够显著表达白细胞介素17，包括γδT细胞，自然杀伤细胞(NK细胞)和B细胞^[21]。据报道，中性粒细胞在人类外周血，银屑病皮损和几种自身免疫和感染性小鼠模型中产生白细胞介素17^[22-23]。

除了在中性粒细胞上调白细胞介素17R外，白细胞介素6和白细胞介素23可以在气道炎症期间上调肺结构细胞上的这些受体。白细胞介素17R在上皮细胞和成纤维细胞上的激活触发它们的产生并释放促炎细胞因子和化学策略细胞因子，这些细胞因子介导神经营养细胞在肺组织中的募集^[24]。在哮喘和慢性阻塞性肺病期间上调的白细胞介素21、白细胞介素23、白细胞介素6的肺组织水平将引发浸润的中性粒细胞自身产生白细胞介素17。这种肺组织中高白细胞介素17水平的环境刺激中性粒细胞产生高反应性氧自由基^[25-30]，这将通过其细胞毒性和组织破坏性活动加剧炎症反应。这可能有助于慢性炎症性肺病期间气道组织重塑的持续存在。因此，药物干扰白细胞介素21、白细胞介素23和白细胞介素6对中性粒细胞的影响可能有助于减少肺组织重塑，特别是在严重疾病的情况下。

结论：严重哮喘患者肺部的中性粒细胞浸润可能是促炎性细胞因子白细胞介素17A和白细胞介素17F的重要来源，STAT3途径可能是严重哮喘期间调节中性粒细胞的潜在靶点。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

辅助性T细胞17(T helper cell 17，Th17)：是一种新发现的能够分泌白细胞介素17的T细胞亚群，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。β转化生长因子、白细胞介素6、白细胞介素23和白细胞介素21在Th17细胞的分化形成过程中起着积极的促进作用，而γ干扰素、白细胞介素4、细胞因子信号传送阻抑蛋白3和白细胞介素2则抑制它的分化。

白细胞介素17(interleukin 17，IL17)：是已发现的30余种白细胞介素之一，按序号排在第17位。白细胞介素17由CD4⁺ T细胞分泌，能够诱导上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞合成分泌白细胞介素6、白细胞介素8、粒细胞集落刺激因子、前列腺素E2，促进ICAM-1的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

白细胞介素6是1980年发现成纤维细胞经Poly I-C刺激后能产生一种抑制病毒复制的细胞因子，称为β2干扰素（IFN-β2）。它具有其他多方面的生物学功能，根据实验系统和功能的不同，分别被命名为杂交瘤/浆细胞瘤生长因子，B细胞分化因子、B细胞刺激因子、溶细胞性T细胞分化因子和肝细胞刺激因子等。1986年统一命名白细胞介素6（interleukin 6,IL-6)。

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