骨髓间充质干细胞外泌体调节哮喘小鼠Foxp3+ Treg/Th17的平衡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0871

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (17): 2637-2643.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0871

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骨髓间充质干细胞外泌体调节哮喘小鼠Foxp3⁺ Treg/Th17的平衡

林颖¹，胡锦章²，颛孙永勋¹，冉丕鑫³，陈瑞¹，杜雨末¹，林琳¹，李建国¹

¹中山大学孙逸仙纪念医院呼吸内科，广东省恶性肿瘤表观遗传与基因调控重点实验室，广东省广州市 510120；²广州市增城区永宁街宁西社区卫生服务中心，广东省广州市 511300；³广州医科大学第一附医院广州呼吸疾病研究所，广东省广州市 510120

修回日期:2018-05-14 出版日期:2018-06-18 发布日期:2018-06-18
通讯作者: 李建国，博士，教授，硕士生导师，中山大学孙逸仙纪念医院呼吸内科，广东省恶性肿瘤表观遗传与基因调控重点实验室，广东省广州市 510120
作者简介:林颖，男，1991年生，安徽省歙县人，汉族，中山大学孙逸仙纪念医院在读硕士，主要从事支气管哮喘的病因及发病机制研究。
基金资助:
广东省自然自由申请项目(2015A030313134)；广州市科技计划项目(201604020103)

Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells regulate the balance of Foxp3⁺ Treg/Th17 in asthmatic mice

Lin Ying¹, Hu Jin-zhang², Zhuansun Yong-xun¹, Ran Pi-xin³, Chen Rui¹, Du Yu-mo¹, Lin Lin¹, Li Jian-guo¹

¹Department of Respiratory Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China; ²Ningxi Community Healthy Service Center of Yongning Street, Guangzhou 511300, Guangdong Province, China; ³the State Key Laboratory of Respiratory Disease, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2018-05-14 Online:2018-06-18 Published:2018-06-18
Contact: Li Jian-guo, M.D., Professor, Master’s supervisor, Department of Respiratory Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Lin Ying, Master candidate, Department of Respiratory Medicine, Guangdong Provincial Key Laboratory of Malignant Tumor Epigenetics and Gene Regulation, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2015A030313134; the Science and Technology Foundation of Guangzhou, No. 201604020103

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
Th细胞：Th细胞全称辅助性T细胞，Th均表达CD4，通常所称的CD4⁺T细胞即指Th。Th细胞是根据功能分类的T细胞亚群，根据其分泌的细胞因子的不同可分为Th1，Th2，Th17，Th9，Th22，Tfh及TregTr1。
骨髓间充质干细胞抑制哮喘的作用：是否通过其分泌的外泌体提高Foxp3⁺ Treg的比例及功能，降低Th17比例改善哮喘症状，减轻肺部炎症。

摘要
背景：Th1/Th2失衡是哮喘的基本的病理生理表现，但近来的研究表明哮喘还与调节T细胞(Foxp3⁺ Treg)/ Th17的失衡有关。许多研究表明间充质干细胞的免疫调节作用与其分泌的外泌体相关。
目的：观察骨髓间充质干细胞外泌体注射对哮喘小鼠气道炎症及 Foxp3⁺ Treg细胞、Th17细胞及支气管肺泡灌洗液中细胞因子的影响。

方法：将27只SPF级BALB/c小鼠分为3组：正常对照组、哮喘模型组、外泌体处理组。除正常对照组外，其他两组以卵白蛋白致敏和激发的方法建立哮喘动物模型，外泌体处理组在第21天激发的同时尾静脉注射外泌体。最后1次激发后24 h，检测各组小鼠脾中Foxp3⁺Treg及Th17占淋巴细胞的比例，检测Foxp3⁺ Treg中CTLA-4及PD-1 表达，检测CD4⁺T细胞中 p27^kip1表达，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数及分类计数，肺泡灌洗液中白细胞介素4，5，13，10，17及干扰素γ表达，并进行肺组织病理观察。
结果与结论：①小鼠脾组织中Foxp3⁺ Treg占淋巴细胞比例及Foxp3⁺ Treg上CTLA-4和PD-1表达：外泌体处理组高于哮喘模型组(P < 0.01)；②脾组织中Th17细胞占淋巴细胞的比例：哮喘模型组>外泌体处理组>正常对照组(P < 0.01)；③支气管肺泡灌洗液中炎症细胞总数及分类计数：外泌体处理组炎症细胞总数、嗜酸性粒细胞计数，单核巨噬细胞计数显著低于哮喘模型组(P < 0.01)；④肺组织病理变化：正常对照组气道无明显炎症细胞浸润，哮喘模型组气道炎症显著，外泌体组气道炎症明显减轻；⑤支气管肺泡灌洗液中细胞因子水平检测：与哮喘模型组相比，外泌体处理组白细胞介素13和Th17相关的白细胞介素17水平降低(P < 0.05，P < 0.01)，Foxp3⁺ Treg相关的白细胞介素10水平升高(P < 0.01)；⑥CD4⁺T细胞中p27^kip1的表达：外泌体处理组p27^kip1的表达高于哮喘模型组；⑦结果表明：骨髓间充质干细胞外泌体可以抑制哮喘小鼠气道炎症反应，逆转哮喘小鼠Foxp3⁺ Treg/Th17失衡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-1281-0559(李建国)

关键词: 哮喘, 间充质干细胞, 外泌体, 调节性T细胞, 免疫调节, 炎症, 细胞毒T淋巴细胞抗原4, 程序性死亡受体1, 细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子, 免疫失衡

Abstract:

BACKGROUND: Imbalance of Th1/Th2 immune response is an crucial pathophysiological manifestation of asthma, but recent studies have proved that asthma also has a close correlation with the imbalance of Foxp3⁺ Treg/Th17. Accumulating evidence indicate that the immunoregulatory capacity of mesenchymal stem cells are mainly related to exosomes secreted by the cells.
OBJECTIVE: To observe the effect of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes on Foxp3⁺ Treg cells, Th17 T cells and airway inflammation of asthmatic mice as well as cytokines in the bronchoalveolar lavage fluid.
METHODS: Twenty-seven BALB/c mice of SPF grade were randomly divided into three groups: normal control group, asthmatic model group, and exosomes group. Except the normal control group, each mouse in the other groups was sensitized by ovalbumin to establish asthma models. In the exosomes group, each mouse was intravenously administrated with exosomes at 21 days of sensitization. At 24 hours after the final administration of ovalbumin, the proportion of Foxp3⁺ Treg and Th17 in the sleep of asthmatic mice as well as the expression of CTLA-4 and PD-1 in Foxp3⁺ Treg cells were detected by flow cytometry. The total number of inflammatory cells, and the number of eosinophils, lymphocytes, monocytes and neutrophils in the bronchoalveolar lavage fluid were counted to analyze the degree of airway inflammation in the combination with pathological observation. We also detected the expression of interleukin-4, 5, 13, 10, 17 and interferon-γ in the bronchoalveolar lavage fluid as well as p27^{kip1 in CD4+ T cells.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The proportion of Foxp3⁺ Treg in splenic lymphocytes and the CTLA-4 and PD-1 expression in Foxp3⁺Treg were significantly higher in the exosomes group than the asthmatic model group (P < 0.01). (2) The proportion of Th17 in splenic lymphocytes was ranked as follows: asthmatic model group > exosomes group > normal control group (P < 0.01). (3) The total number of inflammatory cells and the number of eosinophils, lymphocytes, neutrophils and monocytes in the bronchoalveolar lavage fluid were ranked as follows: asthmatic model group > exosomes group > normal control group (P < 0.01). (4) Pathological observation of the lung showed that the asthmatic mice appeared to have severest airway inflammation. However, mesenchymal stem cell exosomes could significantly alleviate the airway inflammation. (5) The detection of cytokines in the bronchoalveolar lavage fluid showed that levels of interleukin 13 and interleukin 17 were significantly reduced (P < 0.05, P < 0.01), while the level of interleukin 10 increased (P < 0.01). (6) The p27^kip1 expression in the CD4⁺ T cells was obviously higher in the exosomes group than the asthmatic model group. In conclusion, exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells can reverse the imbalance of Foxp3⁺ Treg/Th17 and significantly inhibit the airway inflammation in asthmatic mice.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程}

Key words: Asthma, Mesenchymal Stem Cells, Exosomes, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

林颖，胡锦章，颛孙永勋，冉丕鑫，陈瑞，杜雨末，林琳，李建国. 骨髓间充质干细胞外泌体调节哮喘小鼠Foxp3⁺ Treg/Th17的平衡[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(17): 2637-2643.

Lin Ying, Hu Jin-zhang, Zhuansun Yong-xun, Ran Pi-xin, Chen Rui, Du Yu-mo, Lin Lin, Li Jian-guo. Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells regulate the balance of Foxp3⁺ Treg/Th17 in asthmatic mice[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(17): 2637-2643.

图/表（结果） 3

2.1 外泌体鉴定结果 图1A为电镜下的外泌体，呈中间凹陷的杯口样形态，直径50-150 nm，背景清晰，少见杂质。图1B为Western blot鉴定外泌体表面标记分子CD9，CD63，CD81的表达结果阳性，符合外泌体的生物学特征。

2.2 各组小鼠支气管肺泡灌洗液炎症细胞计数结果的比较 哮喘模型组、外泌体处理组炎症细胞总数，嗜酸性粒细胞计数，单核巨噬细胞计数均显著高于正常对照组(P < 0.01)，外泌体处理组炎症细胞总数，嗜酸性粒细胞计数较哮喘模型组有所下降(P < 0.01)，但高于正常对照组(P < 0.01)，见表1。

2.3 肺病理组织学变化 哮喘模型组支气管、细支气管上皮下和小血管周围可见明显炎症细胞浸润，气道上皮部分脱落，管腔内渗出增加，肺泡间质增厚，亦可见炎症细胞浸润；正常对照组细小气管上皮黏膜完整，气道纤毛上皮排列整齐，气管、血管周围无炎性细胞浸润、无充血水肿；外泌体处理组支气管、细支气管和伴行小血管周围炎症细胞浸润程度减轻，充血水肿状况明显改善，见图2。

2.4 肺泡灌洗液白细胞介素4，5，13，10，17及干扰素γ水平变化 哮喘模型组白细胞介素4，5水平较正常对照组明显升高(P < 0.01)，白细胞介素13水平稍许升高(P < 0.01)。外泌体处理组较哮喘模型组白细胞介素4，5，13水平下降(P < 0.01)。白细胞介素10水平哮喘模型组低于正常对照组(P < 0.01)，经外泌体处理后白细胞介素10水平有所提高(P < 0.01)。白细胞介素17哮喘模型组明显高于正常对照组(P < 0.01)，经外泌体处理后显著下降(P < 0.01)。干扰素γ水平正常对照组明显高于哮喘模型组(P < 0.01)，外泌体处理组干扰素γ水平略高于哮喘模型组(P < 0.05)，见图3。

2.5 各组小鼠Foxp3⁺ Treg比例及其CTLA-4，PD-1表达 正常对照组，哮喘模型组，外泌体处理组脾中CD4⁺T细胞中Foxp3⁺ Treg细胞比例分别为(17.54±2.10)%，(4.95± 0.51)%及(17.10±2.20)%，可以看出哮喘模型组Foxp3⁺ Treg比例较正常对照组明显下降(P < 0.01)，经外泌处理后Foxp3⁺ Treg比例回升(P < 0.01)。正常对照组，哮喘模型组，外泌体处理组Foxp3⁺ Treg表达CTLA-4分别为(8.41±1.01)%，(5.39±0.54)%及(6.07±0.71)%，PD-1分别为(45.67±3.91)%，(41.12±4.41)%及(65.00±6.74)%。哮喘模型组Foxp3⁺ Treg表达CTLA-4，PD-1较正常对照组有所下降(P < 0.01)，经外泌体处理后表达提高(P < 0.01)，见图4。

2.6 各组小鼠Th17比例 正常对照组、哮喘模型组、外泌体处理组Th17细胞分别为(1.04±0.12)%，(3.21± 0.41)% 及(2.21±0.31)%，从图5可以看出哮喘模型组较正常对照组Th17比例显著提高(P < 0.01)，经外泌体处理后比例有所减低(P < 0.01)。

2.7 CD4⁺T细胞分选及p27^kip1的表达 分选后的CD4⁺T细胞纯度高达(98.01±1.44)%, 从图中可以看出哮喘小鼠CD4⁺T细胞中p27^kip1表达较正常小鼠明显减低，经外泌体处理后p27^kip1表达提高，见图6，7。

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引言

支气管哮喘是由多种细胞包括气道的炎症细胞和结构细胞(如嗜酸粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞及气道上皮细胞等)及细胞组分参与的气道炎症性疾病^[1-2]。全球约有3亿哮喘患者，中国约有3 000万哮喘患者，伴随工业化的进展和环境污染的加重，哮喘的发病率和病死率居高不下，给患者和社会造成了巨大的经济负担。哮喘的首选治疗为糖皮质激素，但长期大量吸入糖皮质激素可导致严重的不良反应^[3]，且有一部分患者存在激素抵抗治疗效果不佳，因此有必要寻求新的哮喘治疗方法。

既往的研究发现，Th1/Th2失衡是哮喘的基本病理生理表现，Th2细胞释放炎症相关因子白细胞介素4，5，13等细胞因子，引发过敏炎症及Th2相关组织损伤，最终导致哮喘。干扰素γ作为Th1细胞代表性因子，能促进天然T细胞向Th1的分化，抑制Th2细胞分化，调节嗜酸粒细胞的募集和活化，减少炎症细胞的浸润，对哮喘的发病起保护作用^[1]。新近的研究表明哮喘的变态反应性除了与传统观点认为的Th1/Th2失衡有关外，还与Foxp3⁺ Treg/Th17失衡有关。Foxp3⁺ Treg是目前已知的抑制功能最强、抑制谱最广泛的一类免疫细胞，在维持自身免疫耐受中发挥重要作用。研究表明Foxp3⁺ Treg的免疫调节功能与其细胞表面表达的PD-1，CTLA-4及CD4⁺胞内p27^kip1有关^[4-7]。Th17特异产生的白细胞介素17，可诱导中性粒细胞在局部的募集和活化，上调Th2细胞调控的嗜酸粒细胞炎症，与气道炎症和高反应性密切相关^[8]。

骨髓间充质干细胞是骨髓造血干细胞外的另一类具有高度可塑性的细胞群体，在特定的条件下具有多分化潜能，具有广泛的临床应用前景。近年研究表明间充质干细胞除了具有多向分化潜能外，还具有免疫调节作用，可以抑制系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、自身免疫性脑脊髓炎及炎症性肠病等多种炎症疾病状态^[9-11]。越来越多的研究表明，骨髓间充质干细胞的免疫调节能力与其旁分泌有关^[12-13]。骨髓间充质干细胞外泌体是其分泌的一种胞外囊泡，其中包含多种生物活性物质是其旁分泌作用的主要执行者。

作者以往研究显示骨髓间充质干细胞移植可以改善哮喘小鼠肺部炎症，并提高外周血Foxp3⁺ Treg细胞的比例。该实验因此探究骨髓间充质干细胞是否通过其分泌的外泌体提高Foxp3⁺ Treg的比例及功能，降低Th17比例改善哮喘症状，减轻肺部炎症。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2017年6月至2018年2月在中山大学附属第二医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 动物 6周龄SPF级BALB/c小鼠27只，均由中山大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2016-0029。

1.3.2 骨髓间充质干细胞 第2代人骨髓间充质干细胞购自赛业生物科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 人骨髓间充质干细胞外泌体的分离 人骨髓间充质干细胞(苏州赛业生物科技有限公司)传代后于下一次传代前2 d换成无血清培养基，在传代前收集人骨髓间充质干细胞培养基，超速离心法提取外泌体。提取外泌体后用投射电子显微镜(美国FEI公司)和Western Blot鉴定外泌体。

1.4.2 哮喘模型小鼠构建及外泌体尾静脉注射 SPF级BALB/c小鼠购自中山大学实验动物中心，饲养于专用消毒饲料盒内，过滤空气，光照10-12 h/d，饲料水皆经消毒处理。将27只小鼠随机分为正常对照组，哮喘模型组，外泌体处理组，每组9只。哮喘模型组小鼠腹腔注射鸡卵白蛋白(Sigma，美国)抗原溶液0.2 mL(鸡卵白蛋白100 μg/明矾20 mg)进行致敏，第14，21天以同样的剂量和方式加强致敏，然后于第28-34天将小鼠放在自制的密闭容器内，以体积分数5%鸡卵白蛋白溶液雾化吸入30 min/d，连续7 d诱发哮喘模型。正常对照组的处理同模型对照组只是用生理盐水替代卵白蛋白。外泌体处理组同哮喘模型组，但在第28天注射溶于100 μL生理盐水的外泌体^[14]。建模成功的主要标准是观察小鼠肺部病理切片是否有炎症细胞浸润，肺泡灌洗液中出现大量炎症细胞。

1.4.3 末次激发后24 h检测Foxp3⁺ Treg、Th17及Foxp3⁺ Treg上CTLA-4和PD-1水平 脱颈处死小鼠，腹部朝上体位暴露小鼠右侧腹部。体积分数75%乙醇消毒，切开腹部切取脾脏。将脾脏放入预先放置好的无菌PBS培养皿中，用无菌折射器柄充分研磨脾脏。轻柔吹打细胞至充分重悬，收集到1个无菌15 mL离心管中，于4 ℃ 400×g，离心5 min。离心后弃上清的脾脏细胞用5 mL红细胞裂解液轻柔充分吹打混匀，于冰上裂解5 min。裂解结束后加入10 mL PBS终止裂解反应，于4 ℃ 400×g离心5 min。弃上清后，再用含体积分数10%胎牛血清的1640重悬细胞，调整细胞浓度至2×10⁶。在24孔板每孔加入1 mL重悬细胞，加入2 μL的500×淋巴细胞刺激剂(BD eBioscience，美国)，在37 ℃、5%CO₂孵箱中共同孵育6 h。收集孵育后的细胞离心去上清，混匀后加入荧光标记抗体Rat antimouse CD4-FITC (BD eBioscience)，室温避光孵育30 min，PBS 洗2次离心去上清，加入1 mL固定破膜液孵育40 min，到时间后加入2 mL破膜缓冲液终止破膜，400×g离心5 min，弃上清。加入 Rat anti mouse白细胞介素17-PE(BD eBioscience)，室温避光孵育30 min，离心去上清后加入200 μL PBS 混匀后用流式细胞仪检测。

Foxp3⁺Treg细胞的检测：加入Rat antimouse CD4- FITC (BD eBioscience)、Rat-anti mouse CD25-APC (BD eBioscience)，Rat-anti mouse PD-1-V450(BD Bioscience)， Rat-anti mouse CTLA-4-PE-Cy7(BD Bioscience)室温避光孵育30 min，用PBS洗2次去上清，破膜固定液固定30 min，到时间后加入破膜缓冲液，400×g离心5 min，离心后去上清。加入Rat-anti mouse Foxp3-PE (eBioscience)室温避光孵育30 min，400×g离心5 min后弃上清。用PBS再洗1次，然后用100 μL PBS重悬后细胞上流式细胞仪检测。

1.4.4 灌洗液细胞涂片的制作、细胞计数和分类 各组小鼠均在末次激发后24 h收集支气管肺泡灌洗液，戊巴比妥钠麻醉后气管分离，在会厌软骨处做一T形切口，插入改良的20 G气管插管，用1 mL注射器吸入PBS往复灌洗收集，0.4 mL/次×3次，确保每次回收率在80%以上。灌洗液收集于1.5 mL Ep管中并置于冰盒上，以备细胞总数计数、细胞染色分类计数及上清液的制备。将收集到的肺泡灌洗液，4 ℃、3 000 r/min 离心5 min，收集上清，放入-80 ℃冰箱保存。以1 mL PBS重悬沉淀，血细胞计数板计数。余液再次离心后弃上清，以100 μL PBS重悬后涂片，空气中晾干后固定过夜，行常规的瑞士染色。每张片子在计数400个细胞，通过分类计数其中的嗜酸性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，从而获得各类细胞的百分比。

1.4.5 肺泡灌洗液中白细胞介素4，5，13，10，17和干扰素γ水平的检测 所有的ELISA试剂盒均够自于R&D公司(RD systems，美国)，稀释白细胞介素4标准品至500 μg/L，再用标准稀释液做倍比稀释，浓度分别为500，250，125，62.5，31.25，15.625，7.8125，0 μg/L。每孔加50 μL的Assay Diluent，处空白孔外，分别加入样本和不同浓度的标准品。每样品设3个复孔，振荡器上温和震荡混匀后用封板膜封住反应孔，在室温下孵育2 h。用1×Wash Buffer洗板，每孔300 μL/well每次，共5次，最后1次洗涤后将洗涤液弃尽，并在吸水纸倒扣，确保孔内无多余水分。加入白细胞介素4 Conjugate antibody，100 μL/well，封板膜封住反应孔，室温下孵育2 h。1×Wash Buffer洗板，每次300 μL/well，共5次，最后1次洗涤后弃尽洗涤液，并在吸水纸上倒扣，确保孔内无多余的水分。每孔加入100 μL Substrate solution，封板膜封住反应孔，室温下避光孵育30 min。每孔加100 μL Stop Solution，置于水平摇床上充分混匀，15 min内酶标仪测吸光度值，读板3次取平均值。白细胞介素5，13，10，17及干扰素γ水平的检测方法同白细胞介素4。

1.4.6 CD4⁺T细胞分选 将从脾中获得的单个核细胞用2 mL auto MACS Running Buffer(Miltenyi Biotec，德国)重悬，取20 μL细胞计数。计数后，将细胞300×g离心10 min。每1×10⁷细胞添加20 μL CD4⁺T细胞磁珠(Miltenyi Biotec)，4 ℃、避光孵育15 min。15 min后加入5 mL auto MACS Running Buffer清洗(Miltenyi Biotec)，300×g，10 min离心。离心后加入500 μL auto MACS Running Buffer重悬。将MS柱置于分选器上(Miltenyi Biotec，德国)，MS柱下接一15 mL离心管。用500 μL auto MACS Running Buffer润柱，然后将孵育磁珠的细胞悬液加到MS柱上，在MS柱液体快要流尽时加500 μL autoMACS Running Buffer，重复3次。在最后1次加入的500 μL autoMACS Running Buffer快要流尽时，将MS柱从分选器中拿出转移到另一个15 mL离心管，在MS柱中添加1 mL auto MACS Running Buffer 然后用力快速推动与MS柱配套的活塞，第2根15 mL离心管中即为CD4⁺T细胞。用细胞冻存液冻存CD4⁺T细胞(赛业生物科技有限公司，苏州)。

1.4.7 Western Blot实验 细胞解冻离心弃上清后，将提取的CD4⁺T细胞，加入RAPA裂解液同时加入蛋白酶抑制剂(北京康为世纪有限公司)，冰上裂解30 min。30 min后，12 000×g、20 min离心。离心后，将上清转移到新的EP管中。用BCA法测蛋白浓度。测完蛋白浓度后，98 ℃、10 min煮蛋白。在10%浓缩胶，每孔加入20 μL，30 μg分装好的蛋白，恒压70 V，电泳30 min。然后，恒压120 V，电泳120 min。电泳后200 mA电转60 min。电转后用体积分数5%去脂奶粉TBST封闭1 h，然后用TBST洗3次每次10 min。清洗后孵育一抗，4 ℃、摇床过夜。一抗孵育完成后用TBST洗3次，每次10 min。清洗后孵育二抗90 min，室温下摇床。二抗孵育完成后用TBST洗3次，每次10 min。按体积比1∶1混合ECL试剂盒中A液和B液，混合液铺在膜表面，凝胶成像系统曝光。

1.5 主要观察指标 各组p27^kip1，CD9，CD63，CD81及各炎性因子的表达水平。

1.6 统计学分析 由第一作者采用SPSS 22.0软件进行数据分析，数据以x(_)±s表示，多组比较采用方差分析，两两比较用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

近些年的研究表明骨髓间充质干细胞移植能够改善哮喘的症状，减轻气道炎症，提高外周血细胞Foxp3⁺ Treg的比例^[15-16]，作者在以往研究的基础上向前推进一步，证实了骨髓间充质干细胞外泌体能够改善哮喘小鼠症状，减轻肺部炎症。作者的研究发现给哮喘小鼠注射外泌体减轻哮喘小鼠肺部炎症的同时，逆转了小鼠体内Foxp3⁺/Th17的失衡。这与一些研究证实间充质干细胞胞外囊泡能够减轻哮喘小鼠肺部炎症一致^[13]。临床研究证实间充质干细胞可以有效治疗多种疾病，但间充质干细胞移植也存在一定的风险。例如移植的间充质干细胞可能生长不受控制有致癌的风险，注射不当可能堵塞血管^[17-18]。

许多的研究表明骨髓间充质干细胞的免疫调节主要通过其旁分泌作用。间充质干细胞外泌体包含许多生物活性物质，也是间充质干细胞旁分泌作用的主要执行者，但又无其移植的不良反应，所以外泌体注射比间充质干细胞安全。所以作者课题想探究骨髓间充质干细胞改善哮喘小鼠症状是否通过其分泌的外泌体。

有研究比较了人与小鼠骨髓间充质干细胞胞外囊泡对曲霉菌丝提取物诱导的哮喘小鼠的治疗效果，结果显示人骨髓间充质干细胞胞外囊泡比小鼠骨髓间充质干细胞胞外囊泡更能改善哮喘小鼠肺部炎症，所以该研究选取人骨髓间充质干细胞提取外泌体^[19]。

传统的观点认为Th1/Th2失衡是哮喘发病的主要原因，通过对肺泡灌洗液细胞因子的分析，证实哮喘小鼠确实存在Th1/TH2失衡且外泌体注射能逆转Th1/Th2失衡。但近年研究表明哮喘和其他动物模型中存在中Foxp3⁺ Treg/Th17失衡^[20-21]。近年的研究发现Foxp3⁺ Treg和Th17细胞功能上相互拮抗，从而维持机体免疫状态的相对稳定。作者的实验也证实了哮喘小鼠存在Foxp3⁺ Treg/ Th17失衡，外泌注射后能够提高Foxp3⁺ Treg细胞比例、降低Th17细胞比例。Foxp3⁺ Treg细胞是目前研究最多的具有免疫抑制能力CD4⁺T细胞，对机体免疫系统产生重要的调节作用。支气管哮喘是气道慢性炎症疾病，同时也是外周免疫耐受机制发生缺陷的疾病。实验研究表明，Foxp3⁺ Treg比例下降或者功能失调与支气管哮喘的发生发展密切相关^[22-24]。因此，恢复哮喘患者Foxp3⁺ Treg的数量和功能可能是治疗哮喘的一个有效途径。CTLA-4及PD-1属于CD28/CTLA-4家族，研究表明Foxp3⁺ Treg免疫抑制能力与表面的CTLA-4和PD-1相关^[25-28]，作者的实验发现哮喘小鼠Foxp3⁺ Treg表达CTLA-4和PD-1较正常对照组下降，经外泌体注射后哮喘小鼠Foxp3⁺ Treg表达CTLA-4和PD-1有所提升。有研究表明p27^kip1是正CD4⁺细胞中的转化生长因子β信号正向调控器，能调控CD4⁺T向Foxp3⁺ Treg的分化并提高Foxp3⁺ Treg活性^[29]，实验发现哮喘小鼠CD4⁺T细胞P27^kip1表达下降，经外泌体处理后p27^kip1表达提高。外泌体注射后哮喘小鼠p27^kip1，CTLA-4和PD-1的表达提高，提示哮喘小鼠Foxp3⁺ Treg免疫抑制活性的提高。

综上所述，作者推断骨髓间充质干外泌体改善哮喘小鼠症状主要是依靠提高Foxp3⁺ Treg数量和功能，降低与之拮抗的Th17，比以往间充质干细胞对哮喘小鼠作用的研究更近一步。但作者的实验并没有直接检测各组Foxp3⁺ Treg的免疫抑制能力，接下来将从各组小鼠中提取Foxp3⁺ Treg与Tconv共培养从而检测Foxp3⁺ Treg的免疫抑制能力。此外作者的研究只是证实骨髓间充质干细胞能够减轻哮喘小鼠肺部炎症，逆转Foxp3⁺ Treg/Th17失衡。未来要设置Treg和Th17敲除组小鼠进行实验，从而证实外泌体改善哮喘小鼠肺部炎症确实依赖逆转Foxp3⁺ Treg/Th17失衡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞外泌体调节哮喘小鼠Foxp3⁺ Treg/Th17的平衡

Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells regulate the balance of Foxp3⁺ Treg/Th17 in asthmatic mice

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骨髓间充质干细胞外泌体调节哮喘小鼠Foxp3+ Treg/Th17的平衡

Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells regulate the balance of Foxp3+ Treg/Th17 in asthmatic mice

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Exosomes from bone marrow mesenchymal stem cells regulate the balance of Foxp3⁺ Treg/Th17 in asthmatic mice