2.1  实验动物数量级分析  36只大鼠分为3组，实验过程中模型组死亡2只，治疗组死亡1只，33只大鼠进入结果分析。

2.2  影像学结果  拔牙后4周，拔牙窝处的牙槽骨有密度减低影，均出现模糊骨小梁影像。治疗组阴影密度略高于对照组和模型组，拔牙窝底较模糊，牙槽嵴顶吸收不明显。而相较于治疗组，模型组可观察到阴影面积较大，有牙槽骨间隔吸收，拔牙窝上2/3的骨质吸收明显，嵴顶的骨皮质影像不是很清晰。故拔牙4周后，治疗组相较模型组牙槽骨骨吸收减少及拔牙窝底的有新骨形成(图1)。

2.3  组织病理结构变化  苏木精-伊红染色发现，与对照组相比较，模型组的骨皮质变薄，骨小梁结构变细，甚至出现断裂，大量骨吸收陷窝，成骨细胞较少；而治疗组骨皮质增厚，骨小梁结构正常，只有少量骨吸收陷窝，成骨细胞增多(图2)。

2.4  TUNEL细胞凋亡检测结果  与对照组相比较发现，模型组出现大片的深棕色染色颗粒，说明有大量成骨细胞凋亡，而治疗组仅有少量的深棕色染色颗粒，成骨细胞凋亡减少。从成骨细胞凋亡数目的统计分析得出，对照组、模型组、治疗组的成骨细胞凋亡数目分别为1.833±0.753，12.500±1.643，4.000±0.632，组间比较差异有显著性意义(F=156，P < 0.001)，见图3。

2.5  免疫组织化学染色结果   RANKL蛋白属于分泌型蛋白，主要表达于细胞浆和细胞膜上。实验中有12只正常对照组大鼠低表达RANKL蛋白(±)，8只模型组大鼠高表达RANKL蛋白(++和+++)，9只治疗组大鼠RANKL蛋白表达下降(+)，对照组、模型组、治疗组吸光度值分别为25±5，     26 604±3 415，2 823±641，组间比较差异有显著性意义(F=212，P < 0.001)，见图4A，B，与对照组相比较，模型组的骨细胞胞浆和胞膜的RANKL表达较明显，而在唑来膦酸治疗后RANKL 表达明显减少；骨保护素蛋白的阳性部位与RANKL蛋白相同，10只正常对照组大鼠高表达骨保护素蛋白(++和+++)，8只模型组大鼠低表达骨保护素蛋白(±)，9只大鼠用药后骨保护素蛋白表达上升(++)，对照组、模型组、治疗组吸光度值分别为17 691±5 287，407±365，11 610± 6 879，组间比较差异有显著性意义(F=12.23，P < 0.002)(图4A，B)，对照组的骨保护素表达与其他组相比较略为明显，模型组阳性颗粒最少，骨保护素表达量最少；NF-KB p65蛋白主要位于细胞浆和细胞核上，有11只正常对照组大鼠低表达NF-κB蛋白(±)，9只模型组大鼠高表达NF-κB蛋白(++和+++)，9只大鼠用药后NF-κB蛋白表达下降(+)，对照组、模型组、治疗组吸光度值分别为3 175±437，22 532±3 500，4 181±2 055，组间比较差异有显著性意义(F=85.51，P < 0.001)，见图4A，B，模型组表达较其他组明显，用药后的治疗组与对照组无明显差异，表达较少。

2.6  Western Blot结果  与对照组相比较，模型组的RANKL、NF-κB蛋白高表达，用药后其表达量显著降低，甚至比正常大鼠的表达量略低些，对照组、模型组、治疗组的RANKL、NF-κB与内参β-Actin的灰度比值分别为0.305 8±0.081 1，0.732 0±0.054 9，0.345 7±0.034 7，组间比较差异有显著性意义(F=46.19，P < 0.001)和  0.374 7±0.082 4，0.892 6±0.108 0，0.281 7±0.072 9，组间比较差异有显著性意义(F=41.02，P < 0.001)，见图5，模型组表达较其他组明显，用药后的治疗组与对照组比较差异无显著性意义。

近年来，口腔种植义齿日益成为患者牙缺失的治疗选择^[1]，其就诊患者绝大部分为中老年人，尤其是中老年妇女，往往这部分患者的骨量减少、骨质不良，而种植义齿成功最关键的先决条件即为骨量充足和骨质健康，故骨质疏松症的高发病率给种植义齿带来了许多不良影响^[2]。骨稳态是通过耦合成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收进行动态调节的^[3]，破骨细胞过度分化导致增强的骨吸收引起骨丢失。骨质疏松症是一种以骨量少、骨显微结构破坏、骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病，而绝经后的骨质疏松症即为其中一大分类，是近年来医学研究的热点^[4-6]。该症的发病机制可能为：绝经后雌激素缺乏会使骨微环境中核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)水平升高，骨保护素水平下降，从而使RANKL/骨保护素比值增大，RANKL信号分子过表达后能够与骨保护素竞争性地结合核因子κB (nuclear transcription factor-κB，NF-κB)受体活化因子，在肿瘤坏死因子受体相关因子(TNF receptor associated factor，TRAFs)的参与下启动下游级连信号传导，刺激NF-κB信号通路激活破骨细胞分化相关基因如转录因子活化T细胞核因子、抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K等导致破骨细胞形成与活化，最终导致骨吸收活动增强，打破了成骨与破骨过程之间的动态平衡，使骨吸收大于骨形成，导致骨量减少、骨小梁变细及皮质骨变薄等变化^[7-8]。中国调研2012至2017年连续5年的多个省份骨质疏松患者，其患病率基本在50%左右，尤其是绝经后的女性比例较高^[9]。

目前有两大类治疗骨质疏松症药物，一类是通过抑制破骨细胞的骨吸收(如双膦酸盐)来保持骨量，另一类可通过刺激成骨细胞的骨形成(如生长因子、激素或氟化物)来逆转骨丢失^[10]。目前，双膦酸盐已被广泛应用，主要用于患有转移性骨癌、Paget病和骨质疏松症的患者^[11]，其中唑来膦酸为双膦酸盐类药物中治疗骨质疏松症的药效最强的药物，属于双膦酸盐的第三代含氮产物^[12-13]。该药的咪唑侧链上含有2个氮原子，对骨质中的羟磷灰石具有较高的亲和力，能优先被转运到骨质破坏部位，牢固地吸附在骨小梁的表面，与骨骼结合并在骨组织内沉积，干扰破骨细胞在骨面附着，导致破骨细胞超微结构发生变化，使得细胞程序性凋亡的时间间隔缩短，起到干扰破骨细胞功能并诱导其凋亡的作用^[14-15]，但此药对破骨细胞的具体作用机制还存在争论^[16-17]。尽管该药在临床上使用了近10年，尚未确定唑来膦酸盐的最佳剂量和给药间隔^[18]。由于长期服用大剂量的唑来膦酸会引起双膦酸盐相关性颌骨坏死^[19-21]，一种罕见但具有破坏性的不良反应，约有2/3病例发生于下颌骨^[22-23]，因此为避免此类并发症的发生，在短期内观察单次应用低剂量唑来膦酸对下颌骨的影响，并进一步探索其中的作用机制。

由于课题组前期体外实验证实唑来膦酸能抑制破骨细胞的分化及其功能，其抑制作用可能与NF-κB信号通路相关^[24-25]，但唑来膦酸体内动物实验抑制骨吸收机制是否与NF-κB信号通路可能相关尚不清楚，亟待研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  2018年9月至2019年1月在贵州医科大学动物中心进行饲养及标本取材，2019年2月至5月在贵州医科大学附属医院病理科对标本进行石蜡包埋切片。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  36只雌性SPF级SD大鼠，体质量为250-300 g，由贵州医科大学动物中心提供。动物在贵州医科大学实验动物中心清洁级动物房饲养，动物使用合格证号：SCXK(辽) 2015-0001。

动物饲养条件：4或5只/箱，群养，饲养温度与湿度：18-22 ℃，55%-60%，12 h光照/12 h黑暗的环境，自由进食、饮水；动物房饲养条件稳定，可保证实验结果的可靠性。实验对动物处置符合2006年的科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

1.3.2  实验主要试剂及仪器  唑来膦酸(瑞士：Novartis Pharma Stein AG)、伊红染液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、12%SDS-PAGE(北京Solarbio公司)、TUNEL凋亡试剂盒(江苏凯基生物公司)、一抗抗体均来自北京博奥森生物技术有限公司、二抗抗体及免疫组织化学技术相关试剂均来自北京中杉金桥生物技术有限公司、

1.4  实验方法

1.4.1  动物模型的建立及分组干预  骨质疏松模型组和唑来膦酸治疗组的大鼠行双侧卵巢摘除术，假手术对照组去除同等质量卵巢周围的脂肪。在无菌条件下，用体积分数10%的水合氯醛腹腔注射(3 mL/kg)麻醉动物，取俯卧位，固定，以背部肋骨下1 cm，脊柱2 cm处为中心备毛，碘伏消毒，在背部左右两侧作1.0-2.0 cm切口，剥离扩张可见乳白色脂肪团，在其中找到淡红色呈泡状的卵巢，4号线卵巢与子宫连接处作结扎，复位与分层缝合，内层撒青霉素粉，外层碘伏消毒创口。去卵巢3个月后，治疗组皮下一次性注射唑来膦酸20 μg/kg，对照组和模型组皮下注射相应剂量的的盐水。1周后拔除大鼠左侧下颌磨牙，进行缝合。

1.4.2  取材  拔牙后4周用体积分数10%水合氯醛腹腔注射麻醉动物取出拔牙侧下颌骨组织，并用含生理盐水的纱布仔细分离出软组织，将一部分分离干净的骨组织置于-80 ℃用于Wstern blot检测；一部分置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定48 h，行影像学检测后，用脱钙液进行脱钙，脱钙时间约7周，直到能够插入10 mL注射器针头为止，将已脱钙的标本横向解剖，石蜡包埋，4 μm切片，留作进行染色和免疫组织化学检测。

1.4.3  影像学检查  采用X射线牙片机，照射条件：电压70 kV，电流7 mA，照射时间为0.05 s。所有动物标本经固定后用X射线机拍片，使X射线牙片机的投照头、胶片和被照物的相对位置保持不变。

1.4.4  苏木精-伊红染色病理组织形态学观察  石蜡切片脱蜡水化，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯，Harris苏木精染核，10 mL/L盐酸乙醇返蓝，至水洗，10 mL/L伊红水溶液复染，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固镜检，镜下观察骨皮质和骨松质的结构改变。

1.4.5  TUNEL细胞凋亡检测  石蜡切片常规脱蜡水化，蛋白激酶K通透样本，体积分数3%H₂O₂封闭，脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT酶)反应液连接凋亡成骨细胞中断裂DNA的3-OH末端，辣根过氧化酶的链酶亲和素(Streptavidin-HRP)标记凋亡的成骨细胞，二氨基联苯胺(DAB)显色特异性定位正在凋亡的成骨细胞，苏木精进行核复染，1%盐酸甲醇5 s分化，乙醇按梯度脱水，二甲苯透化，中性树胶封固保存。

1.4.6  免疫组织化学染色  经脱蜡、梯度脱水、抗原修复(采用0.25%胰酶暴露抗原)，体积分数3%H₂O₂去离子水灭活内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭，滴加一抗(兔抗骨保护素抗体1∶30稀释，兔抗RANKL抗体1∶50，鼠抗核转录因子NF-KB抗体1∶50)，4 ℃孵育过夜，37 ℃复温30 min，按链霉亲和素-生物素复合物(SABC)法完成免疫组织化学染色，苏木精复染，盐酸乙醇分化，梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4.7  Western Blot检测  称取50-100 mg的下颌骨组织标本，液氮研磨后放入1.5 mL EP管中，每管加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液200 μL，冰上裂解40 min，4 ℃    12 000 r/min离心25 min，取上清，提取骨组织的总蛋白。BCA蛋白浓度检测试剂盒测定本次总蛋白浓度。从收集的上清液中提取蛋白质经过高温煮沸变性，经12%的SDS-PAGE，然后转移到硝化纤维素膜上，5%牛奶室温封闭1 h，一抗(RANKL、NF-κB)4 ℃孵育过夜，以β-Actin作内参，羊抗兔二抗(RANKL)、羊抗鼠二抗(NF-κB)室温孵育1.5 h，洗膜后ECL显影用凝胶图像处理器分析图像。

1.4.8  图片处理  在对照组和实验组样本中分别各取大致同一切面的2个横切面，光镜下400倍取每个横切面2个不重叠视野，免疫组织化学染色可采取以下方法进行评估^[26]：着色的深浅程度：无着色0分，浅棕色1分，棕黄色2分，深褐色3分；阳性颗粒所占百分比：≤5%为0分，6-25%为1分，26-50%为2分，≥75%为3分；着色点和百分比乘以10分制：0分为阴性(-)，1-3分为弱阳性(+)，4-6分为阳性(++)，7-9分为强阳性(+++)。应用Image proplus6.0图像分析软件测定各蛋白同等面积下吸光度值以及对凋亡的成骨细胞进行计数分析，ImageJ分析软件对条带的强度进行量化。

1.5  主要观察指标  ①观察拔牙窝剩余牙槽骨的大体形态；②下颌骨病理组织形态学的改变；③下颌骨成骨细胞的凋亡情况；④唑来膦酸对下颌骨骨保护素、RANKL、核因子κB受体活化因子、NF-κB表达的影响。         

1.6  统计学分析  应用GraphPad Prism 6.0统计学软件对数据进行统计分析，数据采用x(_)±s表示。两组间的比较使用t 检验或秩和检验，多组间的比较使用单因素方差分析检验或Kruskal-Wallis检验。显著性水准α=0.05，P < 0.05差异有显著性意义。

影响骨代谢的骨骼疾病，如骨质疏松症，会导致牙槽骨吸收，并可能导致牙种植体植入手术失败。绝经后妇女由于雌激素水平下降常常发生骨质疏松^[27]，这种疾病的特点是骨密度、强度、再生能力下降，以及显微结构恶化。因此，骨质疏松症被认为是牙科种植体植入手术应用的相对禁忌证^[2]。此次研究主要采取双侧去卵巢大鼠建立绝经后骨质疏松动物模型，这是一种公认且有效的骨质流失模型，与绝经后妇女中观察到的骨组织高转化、快速骨量丢失的转化状态非常相似^[28-29]。以往研究显示常用3月龄的SD雌鼠造骨质疏松研究模型^[30]。实验通过大鼠卵巢病理切片可见卵巢组织中黄体与卵泡结构，术后1周连续5 d的阴道涂片染色后无角质细胞，去卵巢后3个月大鼠体质量比正常重约10%，股骨密度变化QCT-BMD软件测定股骨远端骨密度明显降低，证实骨质疏松模型构造成功。

唑来膦酸为双膦酸盐中治疗骨质疏松症的药效最强的药物，属于双膦酸盐的第3代含氮产物，在体内、体外均有抑制骨吸收作用，并成功应用于临床治疗骨吸收及骨损失有关的全身性疾病^[31-32]，此药物的作用机制是通过在羟基磷灰石晶体和双膦酸盐之间形成强键来抑制破骨细胞的骨吸收^[33]。尽管该药在临床上使用了近10年，尚未确定唑来膦酸盐的最佳剂量和给药间隔^[18]，并且唑来膦酸长期大剂量应用会引起双膦酸盐相关性颌骨坏死^[19]，尤其是出现在下颌骨，该症的发生率主要取决于唑来膦酸给药的类型、持续时间和形式^[34]。有动物研究显示短期或单次皮下注射唑来膦酸对植入物周围骨密度的改变有积极的影响^[35-36]。故作者采用一次性皮下注射低剂量唑来膦酸，在短期内观察该剂量唑来膦酸对拔牙后下颌骨的作用与影响，并进一步探索其中的作用机制。结果发现，经低剂量的唑来膦酸治疗后，从影像学X射线可大体观察拔牙4周后大鼠下颌骨阴影密度略高于假手术对照组和模型组，说明该剂量的唑来膦酸对下颌骨骨形成具有一定的促进作用，这与之前研究数据表明拔牙并不是造成药物相关性颌骨坏死的主要病因的结论相一致^[37]。从下颌骨病理组织形态来看，用药后的骨皮质厚度稍增加，骨松质较致密，新骨形成增加。有研究显示去卵巢大鼠皮质骨厚度降低，新骨形成减少，骨多孔性增加，尽管静脉注射唑来膦酸增加了种植体周围的骨质疏松性骨再生，但仍低于正常大鼠^[38]。然而，也有研究结果表明，去卵巢大鼠的股骨颈和下颌骨骨小梁骨微结构变细，但股骨和下颌骨皮质骨形态变化不大，皮质骨形态没有实质性改变^[39]，这可能是因为卵巢切除后的时间很短^[40]。

在破骨细胞发生过程中，NF-κB是关键信号之一，RANKL与核因子κB受体活化因子结合后通过降解IκB-a使得NF-κB核易位，诱导NF-κB的激活，NF-κB激活有助于破骨细胞分化和成熟，从而增加骨破坏并减少骨形成^[41]，而骨保护素作为RANKL信号系统的制动器，与RANKL结合，减弱了RANKL-RANK系统作用。从此次实验结果可以看出，唑来膦酸治疗后，免疫组织化学中细胞浆和细胞膜上骨保护素蛋白稍有增加，RANKL、NF-κB蛋白表达明显下降，RANKL/骨保护素比值下降，致使骨保护素与核因子κB受体活化因子结合增多，核因子κB受体活化因子与RANKL两者结合减少，可能减弱下游信号通路NF-κB通路的启动，从而抑制破骨细胞分化与生成，骨吸收活动减弱，证实了KIMACHI等^[42]认为唑来膦酸可能抑制NF-κB信号通路的结论。尽管用药后有明显抑制骨吸收作用(与模型组相比较，P < 0.001)，但仍没有完全恢复到正常对照组，不过从统计数据来看两者无明显差异。

唑来膦酸是否对成骨细胞有影响，有证据表明唑来膦酸药物可能通过对成骨细胞的间接作用来抑制骨吸收^[43-44]，从此次实验TUNEL细胞凋亡检测可以看出，用药后的成骨细胞凋亡数目明显低于模型组(4.000±0.632，12.500±1.643，P < 0.001)，表明唑来膦酸可能对成骨细胞的凋亡具有抑制作用，而治疗组稍高于正常对照组(4.000±0.632，1.833±0.753，P < 0.01)，表明唑来膦酸对成骨细胞的调控效果较为局限，不过对骨的形成还是具有一定积极作用。同时对RANKL、NF-κB做了Western Blot检测同样发现，模型组两者表达量明显增加，在用药之后，两者表达量均下降，NF-κB的表达量下降较为显著，甚至稍低于正常对照组(0.281 7±0.072 9，0.374 7±0.082 4)，进一步证明唑来膦酸可能下调NF-κB，减弱破骨细胞分化与成熟，从而抑制骨的吸收。然而局限于该动物实验研究结果，实验虽能从一定程度上说明低唑来膦酸可能是通过抑制NF-κB信号通路对下颌骨骨吸收具有一定的抑制作用，但还需更进一步研究相关NF-κB阻断剂明确唑来膦酸是否通过下调NF-κB信号通路来抑制下颌骨骨吸收，还需要对其具体的作用位点、磷酸化修饰及其下游分子更进一步检测，此次研究主要针对于用药5周左右作用效果，还需要加长唑来膦酸用药时间，了解其作用效果最长时限。

总之，实验通过构建骨质疏松动物模型，应用低剂量唑来膦酸治疗后发现，唑来膦酸对拔牙4周后的下颌骨成骨细胞凋亡可能有调控作用，对下颌骨骨吸收具有一定抑制作用，而NF-κB信号通路可能参与该抑制作用。此次研究对临床上合理应用唑来膦酸提供了一定的参考作用，希望医生们合理应用该药物，能够在避免并发症的前提下最大限度发挥它的药效。

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文题释义：

去势大鼠：即通过去势法建立骨质疏松动物模型，该模型建造方法主要有3种：去势法、维甲酸灌胃法和糖皮质激素肌注法，而去势法是目前最常用、最成熟的造模方法，主要是通过去除大鼠双侧卵巢至少3个月，构建骨量少、骨显微结构退化而引起骨脆性增加及骨折发生率升高的一种全身性骨病，即骨质疏松疾病模型。

TUNEL细胞凋亡检测：用于检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况，其原理是生物素标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并可与连接辣根过氧化酶的链霉亲和素特异结合，在显色剂DAB的存在下，产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确定位正在凋亡的细胞。

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在破骨细胞发生过程中，NF-κB是关键信号之一，RANKL与核因子κB受体活化因子结合后通过降解IκB-a使得NF-κB核易位，诱导NF-κB的激活，NF-κB激活有助于破骨细胞分化和成熟，从而增加骨破坏并减少骨形成 ADDIN NE.Ref.{F958364C-CD9E-4208-9918-6E7919DC830D}^[41]，而骨保护素作为RANKL信号系统的制动器,与RANKL结合,减弱了RANKL-RANK系统作用。

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