2  结果  Results

2.1  筛选2组的表达差异基因表达  骨量正常组和骨质疏松组的表达差异基因主要聚类为2类(图1A)。火山图反应总体基因的表达情况，其中灰色为非显著性差异的基因，红点代表表达上调的差异基因，绿点代表表达下调的差异基因其中；X轴为log2 FoldChange的展示，Y轴方向为-log10P value的展示(图1B)。2组中表达上调的差异基因为131个，表达下调的差异基因为56个(图1C)。

2.2  表达差异基因的GO富集分析  GO富集分析top30 (筛选3种分类中对应差异基因数目大于2的GO条目，按照每个条目对应的-log10P value由大到小排序的各10条)，结果显示表达差异基因主要集中于生物学过程，细胞组分和分子功能三个大的方面(图2)。

2.3  免疫相关表达基因的筛选  在上述GO富集分析结果中，聚类免疫系统过程中的免疫相关表达差异基因，共29个表达差异基因，其中表达上调的25个，表达下调的4个(图3)。

2.4  KEGG信号通路分析  将免疫相关的29个表达差异基因导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8在线软件，结果提示，KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL4、KLRD1及HSPA6在NK细胞介导的细胞毒作用中的抗原加工与递呈过程中发挥重要作用(图4)。

2.5  Real-time PCR  Real-time PCR显示KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL4、KLRD1及HSPA6在骨质疏松组较骨量正常组的表达明显升高(P < 0.05)，见图5。

绝经后骨质疏松症是绝经后女性由于雌激素缺乏和衰老导致的一种慢性进行性疾病，主要表现为低峰值骨量和/或快速而持续的骨量丢失^[1]。绝经后骨质疏松性骨折的发生率超过中风、心肌梗死和乳腺癌，治疗费用巨大，并可导致患者残疾甚至死亡^[2]。但迄今为止，其确切的分子机制尚不十分清楚。因此，研究绝经后骨质疏松症的发病机制，寻找其治疗的分子靶标和信号通路，有助于其预防和治疗。目前认为骨骼是一种免疫器官，在骨髓中形成的多种免疫细胞可与骨骼系统的细胞相互作用，共同调控骨代谢^[3]。研究证实，一方面活化的T细胞表达核因子κB受体活化因子配体，与破骨细胞表达的核因子κB受体活化因子相结合，促进破骨细胞的成熟和活化，从而通过核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子/骨保护素(RANKL/RANK/OPG)系统调节骨改建过程；另一方面，活化的T细胞可分泌γ干扰素，激活泛素蛋白酶体通路，进而降解肿瘤坏死因子受体相关因子6蛋白，从而抑制核因子κB受体活化因子配体诱导的破骨细胞分化。雌激素亦可通过免疫系统直接和间接地调节破骨细胞的形成^[4]。当雌激素缺乏时，促进破骨细胞形成的细胞因子(巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配体)表达明显增加；抗原递呈明显增多，促进T细胞活化；胸腺中T细胞亦加速释放于外周血中^[5]。基于上述既往雌激素与骨骼系统、免疫系统的相互作用研究，文章通过全转录组测序(RNA-seq)检测绝经后骨质疏松症女性外周血白细胞中与免疫相关基因mRNA的变化，探讨免疫调控因子在绝经后骨质疏松症的表达变化。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  对象和方法  Subjects and methods

1.1  设计  病例-对照研究。

1.2  时间及地点  于2018年10至12月在上海市浦东新区公利医院骨科完成。

1.3  对象  选取2018年10至12月因发生骨折在上海市浦东新区公利医院骨科住院治疗的绝经后0-20年的女性共40人，年龄48-70岁。首先采用Lunar Prodigy双能X射线骨密度仪(美国GE公司)行骨密度扫描后，并依据骨密度T值分为2组：骨量正常组(T>-1)20人，年龄48-55(50.4±2.4)岁；骨质疏松组(T<-2.5)20人，年龄61-70(65.2±4.4)岁；2组的年龄差异有显著性意义(P < 0.05)。全转录组测序分别抽取2组共10人(每组各5人)的外周血样本；验证KEGG PATHWAY生物信息学分析的结果，收集2组共40人(每组各20人)的外周血样本。

1.3.1  纳入标准  ①骨折女性；②绝经后0-20年；③患者对检测方案均知情同意。

1.3.2  排除标准  代谢性疾病及肿瘤等患者。

研究方案的实施符合上海市浦东新区公利医院的相关伦理要求(20170301)。

1.4  方法 

1.4.1  建库测序流程  由上海欧易生物医学科技有限公司执行。分别抽取上述2组共10个女性的外周血样本，进行全转录组测序。

首先需要提取样品总RNA，具体方法如下：采集外周血2 mL，迅速转入2 mL的EDTA抗凝管中，颠倒混匀。吸取EDTA抗凝管中的全血2 mL，转入10 mL离心管中，再加入3倍体积红细胞裂解液6 mL，反复颠倒混匀，室温放置10 min，期间反复颠倒数次。3 000 r/min离心5 min，吸去上清，细胞沉淀中再加入2 mL的红细胞裂解液，轻轻悬浮。3 000 r/min 离心5 min，吸去上清，留下白细胞。在白细胞中加入1 mL trizol，用移液枪反复吹打均匀，然后转入   2 mL的冻存管中，-80 ℃保存。使用mirVana miRNA ISOlation Kit(Ambion-1561)提取样品总RNA，通过NanoDrop 2000进行RNA质量检测；然后使用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold试剂盒消化核糖体RNA，加入打断试剂将RNA打断成短片段；以打断后的RNA为模板，用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP，然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的RNA文库用Agilent 2100 Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina测序仪进行测序。

1.4.2  原始数据以及数据产出统计  高通量测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储。利用hisat2将Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息。使用htseq-count软件获取每个样本中比对到蛋白编码基因上的reads数，cufflinks软件来计算蛋白编码基因的表达量FPKM值。

1.4.3  表达差异基因筛选  利用DESeq软件对各个样本基因的counts数目进行标准化处理(采用basemean值来估算表达量)^[6]，计算差异倍数，并采用NB(负二项分布检验的方式)对reads数进行差异显著性检验，最终根据差异倍数(Fold Change>2)及差异显著性检验结果(P < 0.05)来筛选差异蛋白编码基因。

1.4.4  火山图与聚类分析  通过绘制火山图可以了解差异表达基因的整体分布情况。对差异表达基因进行非监督层次聚类。

1.4.5  表达差异基因GO富集分析  得到差异表达基因之后，对差异表达基因进行GO富集分析，描述其功能。方法：将全部蛋白编码基因/转录本作为背景列表，差异蛋白编码基因/转录本列表作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用超几何分布检验计算代表GO功能集在差异蛋白编码基因/转录本列表中是否显著富集的P 值，再对P 值经Benjamini & Hochberg多重检验纠正后得到FDR。

1.4.6  KEGG PATHWAY分析  将上述免疫相关表达差异基因导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8在线软件，进行生物信息学分析。

1.4.7  Real-time PCR验证免疫相关的表达差异基因  为进一步验证KEGG PATHWAY生物信息学分析的结果，收集40例患者(骨量正常组和骨质疏松组各20例)外周血，按照1.4.1方法中描述，提取总RNA，反转录为cDNA，然后进行Realtime PCR扩增、验证，引物序列请详见表1。

1.5  主要观察指标  ①筛选2组的表达差异基因表达；②表达差异基因的GO富集分析；③免疫相关表达基因的筛选；④KEGG信号通路分析；⑤Real-time PCR验证免疫相关基因。

1.6  统计学分析  计量资料以x(_)±s表示，采用独立样本t 检验，在α=0.05的检验水准下，P < 0.05为差异有显著性意义。

雌激素是主要由卵巢分泌的性激素，不仅可以调节生殖器官的生理功能，而且还在骨骼、免疫等非生殖器官系统中发挥重要的作用^[12]。雌激素可以直接与成骨细胞、破骨细胞及骨细胞发生相互作用从而维持骨量平衡^[13-14]。绝经后妇女体内的雌激素水平迅速下降，导致以骨量降低、骨强度下降为特征的绝经后骨质疏松症^[15]。但目前对于绝经后骨质疏松症的确切机制仍未明确。

2000年，ARRON等^[3]首次提出骨免疫学在骨代谢中发挥重要作用，认为骨是一种免疫器官，多种免疫细胞在骨髓中起源，与骨组织细胞共享同样的骨髓微环境、调控因子和受体。T淋巴细胞、B淋巴细胞、细胞因子、趋化因子和共刺激分子等均能与成骨细胞和破骨细胞相互作用，共同调节骨形成和骨吸收，进而调控骨改建过程。2018年SRIVASTAVA等^[16]和2019年TILKERIDIS等^[17]相继提出“免疫疏松”的概念，进一步揭示免疫学在骨质疏松症中调节机制。

鉴于上述既往研究提示各种免疫细胞均与骨代谢密切相关，因此，文章收集绝经后骨质疏松患者外周血白细胞进行RNA-Seq检测，探讨绝经后骨质疏松症患者外周血白细胞中与免疫相关的基因表达谱的变化。结果显示，免疫相关基因KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL4、KLRD1及HSPA6在骨质疏松组较骨量正常组的表达明显升高。

自然杀伤(NK)细胞是淋巴细胞的独特谱系，可在免疫刺激后介导细胞毒活性并分泌细胞因子。KIR和KLRD1基因在染色体的定位不同，属于不同自然杀伤细胞受体家族，从功能上均包含抑制型受体和活化型受体两大类。KIR基因具有多态性且高度同源，KIR蛋白按细胞外免疫球蛋白结构域(2D或3D)的数目以及它们具有长(L)或短(S)胞质结构域进行分类^[18]。KIR3DL1，KIR3DL2，KIR3DL4是具有长细胞质结构域的KIR蛋白，它们与配体结合后通过免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)传递抑制信号^[19]。而具有短细胞质结构域的KIR蛋白缺乏ITIM基序，而是与TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白作用后释放激活信号^[20]。KIR蛋白的配体是HLA I(1a、1b)类分子的子集，因此，KIR蛋白在调节免疫应答中起重要作用。KLRD1(CD94)是一种优先在自然杀伤细胞上表达的抗原，也可作为自然杀伤细胞和某些细胞毒性T细胞识别MHC I类HLA-E分子的受体发挥作用。CD94/NKG2家族分布于自然杀伤细胞和部分T细胞，NKG2A/B与CD94组成抑制性受体^[21]，NKG2C或NKG2E与CD94组成活化性受体^[22]。

自然杀伤细胞活性是衰老的生物标志物，其年龄依赖性功能下降是由于：①对正调节剂(干扰素α，白细胞介素2，白细胞介素12)的反应降低，②对ATP的反应增加，③细胞膜的微粘度增加。既往研究表明，自然杀伤细胞功能低下与老年受试者感染风险更大相关^[23]。2018年中国学者发现在LRP5^+/-小鼠中，脾脏和骨髓中自然杀伤细胞、CD3e⁺细胞和CD8a⁺ T细胞的百分比增加的同时，其成骨细胞分化受到抑制^[24]，提示免疫调节Wnt信号通路的潜在机制。2019年TILKERIDIS等^[17]的最新研究发现，尽管绝经后骨质疏松症患者中不变的自然杀伤性T细胞(iNKT)未克隆扩增，但其自然杀伤性T细胞特异性表达破骨细胞活性调节因子-核因子κB受体活化因子配体，提示自然杀伤性T细胞对骨代谢及骨质疏松症患者的骨质流失中起重要作用。此次研究中自然杀伤细胞受体KIR和KLRD1在绝经后骨质疏松患者外周血中表达显著升高，其与Wnt、核因子κB受体活化因子配体信号通路的潜在关联可能在绝经后骨质疏松症中发挥重要作用，需在今后工作中进一步研究证实。

既往研究表明，表达于肿瘤细胞表面的HSPA6，可作为配体与活化的自然杀伤细胞结合，发挥自然杀伤细胞介导的细胞毒作用。在低氧条件下，低氧诱导因子1可诱导肿瘤细胞表面的HSPA6表达降低，从而使肿瘤细胞逃脱自然杀伤细胞介导的细胞毒作用^[25]。而此次研究中自然杀伤细胞配体HSPA6在绝经后骨质疏松患者外周血中表达显著升高，提示自然杀伤细胞介导的细胞毒作用可能在绝经后骨质疏松症中发挥重要作用，需在今后工作中进一步研究证实。

此次研究存在诸多不足，如样本量偏少、研究内容较单薄等，需在今后工作中进一步深入研究证实。文章通过RNA-Seq检测绝经后妇女外周血白细胞中的表达差异基因，初步研究结果显示，与免疫相关的表达差异基因HSPA6及KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL4、KLRD1，在抗原加工与递呈过程中发挥重要作用，其参与的自然杀伤细胞介导的细胞毒作用可能与绝经后骨质疏松症的发生密切相关。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

RNA-seq技术：利用高通量测序技术进行转录组测序分析，检测mRNA、miRNA、circRNA及lncRNA等所有转录本的表达水平，从而探究特定组织或细胞中基因的结构和功能，探寻特定疾病发生、发展的分子机制和信号通路。

骨免疫学：2000年首次提出，认为骨骼是一种免疫器官，在骨髓中形成的多种免疫细胞可与骨骼系统的细胞相互作用，通过经典的RANKL/RANL/OPG系统等信号通路共同调控骨代谢过程。最近提出的“免疫疏松”，进一步揭示骨免疫学在骨质疏松症中的调节作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括 mRNA和非编码RNA 。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过新一代高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程