2  结果  Results 

2.1  干细胞扩增过程检测  

2.1.1  多能性  在干细胞长期大规模扩增过程中，生长因子和转录因子的添加、细胞密度的增加以及外界环境的刺激等因素均会诱导干细胞提前分化，致使干细胞功能丧失。为了获得扩增后功能性完整的干细胞，需要对培养过程中细胞的多能性进行在线检测，以便通过及时干预提高扩增质量。

GREUEL等^[7]、CELIZ等^[8]通过检测八聚体结合因子4、Nanog同源异形盒基因、SPY盒基因2、碱性磷酸酶等多能性标志以及分化标志物如甲胎蛋白、配对盒基因6等的表达，验证了人多能干细胞多能性的维持。CHEN等^[9]、XIE等^[10]认为原代成体多能干细胞标志物，例如人间充质干细胞标志物——内皮糖蛋白、波形蛋白，人肝祖细胞标志物——上皮细胞黏附分子、重组蛋白24、细胞角蛋白19；多能干细胞标志物如：人胚胎干细胞表面标志物——肿瘤排斥抗原1-81、阶段特异性胚胎抗原4等，也是表征干细胞自我更新能力保持的重要指标^[9-10]。目前，蛋白质组学和基因组分析是对上述指标检测的2种主要方式。FATHI等^[11]提出利用表面等离子共振生物传感器可以实现对分化早期细胞表面特异性标志物和蛋白质的在线检测，并利用表面等离子共振信号评估了人成体多能干细胞对内胚层谱系的分化。这种检测方法具有高灵敏度、无破坏性以及快速准确等优势；但在应用于细胞检测时要考虑消逝波深度不够的问题；并且易受外界环境波动的影响，标定困难；同时检测完成后需要对靶点清洗，因此传感器的使用寿命和可重复性也值得关注。

2.1.2  代谢活性  干细胞扩增过程伴随着物质和能量的交换。在线检测反映干细胞代谢活性的相关指标，对干细胞扩增水平以及活力的间接表征具有重要意义。

GREUEL等^[7]提出培养液中葡萄糖和乳酸的含量变化，是反映干细胞代谢活性的重要指标。黄剑锋等^[12]、武发菊等^[13]证实培养基中氨浓度过高将抑制细胞的代谢生长，最终引发细胞的凋亡。PARRY-BILLINGS等^[14]表明培养基内谷氨酰胺浓度下调会降低细胞的增殖速率以及代谢水平，同时谷氨酰胺在细胞长期培养过程中也易分解产生焦谷氨酸等有毒物质。因此，在干细胞扩增过程中，有必要对氨和谷氨酰胺的浓度在线检测。此外，培养基溶解氧水平也是维持干细胞代谢活性的重要因素。滴定法、试剂盒比色法、高效液相色谱法以及酶膜电极法是对上述指标检测的常用方法。LEE等^[15]、辛联庆等^[16]、张峰等^[17]通过电化学方法实现了对葡萄糖、乳酸以及溶解氧浓度的高灵敏度原位在线检测^[15-17]，并对耗材的成本以及酸性气体透膜扩散等问题进行了优化。BAINGANE等^[18]研发的自供电乳酸电化学生物传感器具有更稳定的工作性能，并且检测体系和传感器结构都具备小型化的优势。未来利用这种基于酶生物燃料电池的电化学生物传感器进行在线检测更具发展前景。P?UCEAN等^[19]、王计元等^[20]、NAFTALY等^[21]提出利用光学方法如光谱分析法等，也可实现对葡萄糖、乳酸、氨和溶解氧的可靠、快速检测，其中王计元等^[20]和TAHERI等^[22]研究的基于荧光猝灭原理的生物探针技术，配合光纤传感器与红外光谱分析法，具备高灵敏度、高选择性和极稳定的光学特性。未来这种多技术交叉的光学方法也有望应用于在线检测。目前基于光谱分析法或荧光强度分析法研制的溶解氧传感器已在市面销售，如OXY-1 SMA单通道光纤测氧仪，可实现原位非接触在线检测。此外，韩雨钊等^[23]在检测人血浆中谷氨酰胺浓度时，采用的液相色谱串联质谱法具有高特异性、准确性和灵敏度的优势。通过将生化检测分析设备串联使用，显著提升了检测结果的可靠性，可应用于在线检测系统的标定与校准。

目前，对于细胞水平的代谢指标如胞外酸化率、胞外氧化还原电位等的检测，还处于实验阶段。蔡华^[24]曾对上述两指标的检测方法做了系统的研究，并开发了基于集成芯片的多功能细胞生理自动分析仪，实现了对微量细胞生理状态的实时检测。但原位在线评估单个细胞的代谢水平对检测系统的控制精度要求苛刻，并且不便于对大量细胞开展。未来仍需深入研究这些指标在干细胞大规模扩增场景下的在线检测方法。

2.1.3  存活状况  生物反应器内干细胞的存活率由培养方法、培养条件等多因素决定，是衡量细胞扩增效率的重要指标。目前，检测培养基内活细胞的数量、群体倍增时间以及集落形成效率是判断存活率的主要手段，常用的检测方法包括流式细胞仪分析法、染色镜检分析法等。这些方法面临检测成本高、实时性差并且难以集成小型化等问题。

取样后添加反应物或标志物，利用光学或声学检测方法，实现对细胞膜通透性、细胞内活性物质以及培养基中分泌蛋白的检测，将有望用于在线评估干细胞活性。例如：GREUEL等^[7]通过荧光反应试剂Celltiter-Blue^?的添加，配合荧光计检测到了反映细胞活性的荧光强度变化；FU等^[25]研究发现荧光标记的效率是影响检测结果的重要因素，他们将非荧光钙黄绿素乙酰甲氧基加入到聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒中，开发出一种可均匀高效标记存活干细胞的纳米传感器，但该传感器信号受快速细胞分裂和胞吐作用的影响稀释明显，稳定性有待提升；YOO等^[26]注意到传统的荧光检测需要对样品进行采样，严重影响检测结果的实时性，他们研发的基于外源性光声造影剂吲哚菁绿的光声检测法具有高对比度、灵敏度和安全性的优势，并且吲哚菁绿可随着细胞代谢排出胞外，未来这种光声检测法还有望用于对生物反应器中干细胞活力的原位在线检测。此外，岳伟伟等^[27]利用酶促发光原理定量检测腺苷三磷酸含量，从而实现菌落计数。这种方法具有检测速度快、灵敏度高、可小型化的优势，对干细胞活力的在线检测具有借鉴意义。

虽然光学或声学的检测方法可实现对细胞活力的有效评估，但荧光探针或染料试剂的使用通常会造成细胞的损伤，难以实现对动态响应的原位在线检测。HUANG等^[28]通过电阻抗法连续检测二维培养条件下干细胞的迁移与黏附，进而实现了对干细胞活力的实时原位在线检测。MCKEE等^[29]曾表示利用传统的二维培养技术，细胞扩增程度有限，且长期传代后细胞往往失去克隆和分化能力，而通过三维细胞生长来模仿体内环境是干细胞扩增的新方法。在此基础上，LEE等^[30]采用四对垂直对齐电极组成的三维电容传感器，实现了对细胞增殖、凋亡以及定向跃迁的实时原位在线检测。电阻抗检测法与介电检测法具有出色的实时性和灵敏度，但标定困难，特异性差，易受外界因素干扰。CELIZ等^[8]、LIU等^[31]在扩增人多能干细胞过程中对细胞黏附机制的研究发现：整合素α2、整合素α5、整合素α6、整合素αv、整合素β1等是细胞黏附和参与局部黏附信号传导的关键因子，并且表达模式与细胞基质的特性密切相关。未来通过在敏感元件表面修饰整合素抗体，配合电阻抗、表面等离子共振等技术，有望实现特异性更好、精度更高的细胞活性原位在线检测。

2.1.4  转癌趋势  研究表明，如果成年人干细胞离体培养增殖太久，有可能发生癌变^[32]。及时在线检测扩增过程干细胞的转癌趋势，对规避使用风险、减少资源浪费具有重要意义。

染色体异常^[31]、端粒酶的表达与活性^[32]、原癌和抑癌基因的突变情况、细胞表面糖蛋白的表达以及特异性肿瘤标志物均可作为干细胞转癌趋势的检测指标。但是检测过程大多需要聚合酶链式反应仪、生化分析仪、荧光显微镜、酶标仪等昂贵的大型设备，使得在线检测不便于开展。在临床上，广谱肿瘤标志物——癌胚抗原可作为早期癌症筛查的重要指标。JIN等^[33-37]先后利用基于石墨烯薄片的多纳米材料电化学生物传感器、基于叉指电极微流控芯片的无标记非接触阻抗免疫传感器以及基于抗体修饰石墨烯场效应晶体管的无标记免疫传感器，对癌胚抗原进行了高灵敏度、高特异性的快速在线检测，其中重点解决了酶活性对传感器的影响、电化学反应对电极的腐蚀等问题，并利用微流控技术推动传感器的小型化。未来小型化在线检测癌胚抗原将有望实现对干细胞转癌趋势的判断。

2.1.5  检测现状  目前保证细胞正常生长及代谢的部分指标已应用于细胞培养过程的在线检测包括温度、溶解氧和酸碱度^[38]。温度主要利用铂热敏电阻进行在线检测，而溶解氧和酸碱度的在线检测主要通过电化学检测法或光学检测法实现。此外，葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺的在线检测设备也已商品化如IST AG LV5生物传感器等。在干细胞多能性、存活状况以及转癌趋势检测方面，目前还没有已应用的在线检测指标，但存在对部分指标在线检测方法的研究。利用光学检测法(如光学比色分析法等)和电化学检测法(如基于电极表面修饰的电化学检测法等)对培养液中标志物的在线检测将更易实现，而基因、胞内标志物以及细胞水平的检测指标则难以应用于干细胞大规模扩增过程的在线检测。

2.2  干细胞肝向分化过程检测  目前，科研领域已实现肝向分化的干细胞主要分为3类：多能干细胞(胚胎干细胞、人诱导多能干细胞)、中胚层谱系成体多能干细胞(人脂肪组织干细胞等)以及内胚层谱系成体多能干细胞(肝干/祖细胞)，其中前两类细胞先分化为定向内胚层细胞，再分化为成熟肝(样)细胞，而以肝干/祖细胞为主的内胚层谱系成体多能干细胞可直接向成熟肝(样)细胞分化。

2.2.1  多能干细胞肝向分化过程检测  研究认为，多能干细胞的肝向分化主要分为6个阶段，即多能干细胞、内胚层诱导、肝性特化、肝母细胞扩张和增殖、肝性成熟、成熟肝(样)细胞。多位学者对多能干细胞肝向分化进行了深入研究^[5，39-41]，他们认为通过检测下述标志物可反映细胞所处的具体分化阶段，见表1。

2.2.2  中胚层谱系成体多能干细胞肝向分化过程检测  新生儿间充质干细胞、人骨髓间充质干细胞、人脐血间充质干细胞和成人脂肪组织干细胞是常见的中胚层谱系成体多能干细胞。已有研究证实它们均具有分化为肝(样)细胞的潜力和重要的临床应用价值^[4，42-44]。分化过程主要包括4个阶段：中胚层谱系成体多能干细胞、前肠祖细胞产生、肝祖细胞产生、肝(样)细胞产生与成熟，其中各阶段的标志物见表2。

2.2.3  内胚层谱系成体多能干细胞肝向分化过程检测  此类干细胞可直接分化为成熟肝(样)细胞，其中肝祖/干细胞是肝脏来源的干细胞，也是可分化为成熟肝(样)细胞的主要内胚层谱系成体多能干细胞。在发育学上与肝外来源的干细胞相比，其具有更接近成熟肝(样)细胞的优势，是生物人工肝等应用领域很有前景的细胞源。多位学者对肝祖/干细胞肝向分化过程进行了系统的研  究^[3，10]。他们通过检测下述标志物验证了肝祖/干细胞肝向分化的进行，见表3。

此外，由于肝祖/干细胞可双向分化成肝(样)细胞与胆管上皮(样)细胞，因此有必要检测由此类或经由此类干细胞分化得到的成熟肝(样)细胞中，细胞角蛋白19、γ-谷氨酰转肽酶等胆管(样)细胞标志物，确保它们为阴性表达。

2.2.4  检测现状  目前上述特征标志物通常是利用定量反转录聚合酶链式反应和免疫细胞化学方法，配合大型生化检测分析设备，进行高精度、高准确性的离线定量检测。而它们的在线检测方法还有待研究，其中检测灵敏度和特异性的提升、取样过程的规避、检测设备的小型化以及分析时间的缩短是需要解决的关键问题。曹越^[45]已利用微流控技术研制了自动在线微检测系统，可用于对生物反应器中尿素的检测，具有耗样量小、实时性好以及灵敏度高的优势。项红升等^[46]利用溴甲酚绿比色原理可对肝(样)细胞白蛋白分泌情况进行在线快速定性检测。未来分泌蛋白以及胞外酶含量也有望应用电化学方法(如酶促反应法)以及光学方法(如吸光光度法、光谱分析法)等实现在线检测，而涉及蛋白或酶活性的检测通常涉及药物的代谢过程，因此在应用于在线检测时需考虑检测的实时性问题。其他标志物如基因、包内蛋白和酶、糖原和脂肪滴的积累、低密度脂蛋白的摄取以及转录因子等，由于它们的检测工序复杂需要标记、离心、静置等过程^[47]，检测周期长，并且需要依靠聚合酶链式反应仪、显微镜及成像分析系统等大型设备，检测成本高不便于小型化集成，因此难以在线检测。此外，HUANG等^[28]认为电阻抗法也可实现对干细胞分化过程的表征，并利用电阻抗法对成脂分化过程进行了连续原位在线观测。但该方法存在传感器标定困难，检测的特异性不足等问题。

干细胞因具有自我更新的能力，并且可分化为特定的细胞类型，而被广泛应用于临床医学、药物研发以及器官重建等多个方面。在再生医学和组织工程学领域，组织或器官损伤患者急需得到及时有效的修复和治疗，然而现有的医疗技术难以实现。干细胞作为进行细胞替代治疗以及组织和器官再生的基础，具有很高的应用价值。近年来，干细胞与再生医学领域国际竞争激烈，已逐步成为衡量一个国家或地区生命科学与医学发展水平的重要标志^[1]。尽管再生医学和组织工程学领域具有美好的发展前景，但同时也受到干细胞领域发展水平的影响。当下关键任务是实现干细胞快速、高效的大规模扩增与定向、均匀的分化。目前，国内外众多学者对干细胞的获取、干细胞的大规模扩增及定向分化、培养系统的设计等方面做了深入的研究，成就显著。未来干细胞的扩增和分化过程将得到智能化、自动化的检测控制，从而为解决干细胞供不应求以及分化质量不高等关键问题奠定基础，再生医学和组织工程学领域也将得到长足发展。

目前，临床应用研究需要对干细胞进行大规模扩增和定向分化。生物人工肝作为再生医学领域的重要研究方向之一，可以显著降低病死率，是目前最有希望帮助患者摆脱肝衰竭的治疗技术^[2]。生物人工肝的工作依赖于生物反应器中肝(样)细胞功能的发挥，其中肝(样)细胞的来源是值得关注的重要问题。干细胞是常用的肝(样)细胞来源之一。它具有产生功能性肝(样)细胞的潜能，可实现大规模扩增，并且与猪肝细胞、肝癌细胞系等相比具有同种、低风险等优势。多位学者曾证实多能干细胞和成体多能干细胞均可实现肝向分化^[3-6]。

然而干细胞在生物人工肝上的应用，面临细胞数量不足、分化质量不高等问题。未来智能化干细胞培养仪的研发，将推动肝(样)细胞生产向批量化、标准化方向发展，其中干细胞扩增及肝向分化过程的自动在线检测系统，是该仪器的关键组成部分。通过在线检测培养过程中细胞的功能状态，配合反馈控制系统，有望实现对胞外环境的及时调节以及对营养物质的适时供给，最终生产出可直接用于生物人工肝支持系统的细胞。同时这套系统也将推动对干细胞大规模扩增以及肝向分化有同样需求的其他应用领域发展。基于上述问题，文章综述了干细胞扩增及肝向分化过程中临床和科研领域普遍认可的反映细胞状态、功能的检测指标和这些指标配套的检测方法，总结了现已应用于在线检测的指标与检测方法，讨论了部分指标与检测方法应用于在线检测的局限性，最后展望了未来有望应用于在线检测的指标和检测技术。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1  资料和方法  Data and methods

1.1  资料来源  英文检索词为“stem cells，expansion，hepatic differentiation，monitoring，real-time online”；中文检索词为“干细胞，扩增，肝向分化，监测，实时在线”。由第一作者检索1990至2019年PubMed数据库、Web of Science核心合集、Elsevier数据库、中国知网等收录的与干细胞扩增及肝向分化过程相关的文献。优先选择近期或高权威性杂志发表的原著、综述和述评，共计93篇。

1.2  入选标准  ①内容相关度高；②具有创新性；③观点明确，论点、论据可靠；④类似研究选择近期或在权威杂志发表的文献。

1.3  质量评估  通过阅读题目和发表日期，初检获得93篇近期发表的相关文献，进一步浏览摘要和杂志名称，排除内容重复、缺乏创新以及论证不充分的文献40篇，纳入53篇作为标准文献进行综述。文献筛选流程见图1。

文章综述的干细胞扩增及肝向分化过程的相关检测指标与检测技术，对研发自动在线检测系统具有重要的指导意义，为干细胞在生物人工肝等领域的应用搭建了桥梁。目前基于商品化的大型生化检测分析设备的检测方法，虽然检测结果可靠，但实时性不理想，并且难以集成小型化，不便于实现自动在线检测。近年来新型传感技术的发展，为在线检测技术在细胞培养领域的应用提供了机遇。干细胞扩增及肝向分化过程自动在线检测的实现还有待从以下几个方面进行深入研究。

3.1  检测指标的现存问题  目前，细胞群落的倍增情况是划分干细胞扩增过程不同阶段的主要依据。然而各阶段待检指标的检测标准还未有定论，造成检测结果难以定量评估。未来应依据细胞群落密度、营养物质的供给情况、倍增次数等因素结合细胞类型进行检测标准的研究和制定。

此外，现有研究虽然已将不同类别干细胞的肝向分化过程做了阶段性划分，并且找出了特征指标来表征细胞所处阶段，但现存指标种类繁多，需针对指标的关键性进行筛查，便于在线检测技术的实际应用。另外，各指标在不同阶段的表达水平不一，并且同一指标(如白蛋白、甲胎蛋白、细胞角蛋白18等)可能存在于分化过程的多个阶段，因此检测指标的检测标准同样有待研究。

3.2  检测技术及实现  目前，在线检测技术在干细胞扩增及肝向分化过程的应用正处于研究阶段，相关报道中涉及的指标主要为温度、酸碱度、溶解氧、湿度等物理指标以及氨和葡萄糖等生化指标^[48-53]。研究主要针对干细胞培养过程在线检测的实现^[50-51，53]，对于扩增或分化等特定过程的研究较少。氨、酸碱度和溶解氧主要采用电化学原理，通过在电极表面修饰(离子或氧)选择透过膜，制成电位传感器实现在线检测^[50，52]，而葡萄糖主要采用酶促反应原理制成的电流型电化学传感器进行在线检测^[50]。RAJAN等^[48]研发的在线检测系统已验证了骨髓间充质干细胞扩增和分化，可实现对酸碱度、温度以及湿度的小型化原位在线检测，其中酸碱度的检测依据吸光光度法，通过检测培养基内酸碱指示剂的颜色变化进行表征^[48-49]，而湿度则利用基于热固性聚合物材料的电容传感器检测^[48]，这项工作是在线检测技术应用于细胞扩增和分化过程的成功案例之一，可为今后更多生化指标参与的干细胞扩增及肝向分化过程在线检测的实现奠定基础。

然而，对于胞内标志物(如基因、转录因子、胞内蛋白等)、细胞水平的检测指标以及反映肝(样)细胞功能的指标(如代谢、转化、糖原的积累等)检测，通常需要长时间的反应过程和复杂的操作流程，并使用大型精密的生化检测分析设备，因此实时在线检测这类指标的方法，仍有待研究。目前认为通过荧光染料的添加，检测样品的荧光强度将有望实现对胞内标志物的在线检测，但染料的标记效率、特异性以及是否可被细胞代谢降解是值得关注的问题。YOO等^[26]、FU等^[25]曾对该问题进行了系统研究，并研制了符合标准且可检测细胞活性的染料，但标记过程的反应时间仍较长，难以应用于在线检测。

未来，利用光学(声)检测法、表面等离子共振法和电化学检测法配合表面修饰以及荧光标记等技术，将有望实现对细胞培养液中标志物的在线检测。利用吸光光度法，通过光敏二极管、单色激光二极管以及光纤配合相应电路系统，可实现对光学检测设备的小型化。利用表面增强拉曼光谱法、表面等离子共振法以及电阻抗检测法，通过对传感器表面进行特异性修饰，将有望实现对细胞表面标志物的在线检测。另外，介电检测法和电阻抗检测法将有望通过检测细胞的迁移能力和黏附性来反映细胞的活性。此外，在生物芯片、微流控技术、无线射频识别技术、三维打印技术以及纳米材料等领域的推动下，干细胞扩增及肝向分化过程的在线检测将向着自动化、智能化、集成化、小型化、高性能、低成本、实时原位的方向发展。  

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

#br#

文题释义：

干细胞肝向分化：是指来自于胚胎、胎儿或成体内具有在一定条件下无限制自我更新与增殖分化能力的一类细胞，通过形态、功能的特殊变化，建立起肝细胞特征的过程。这一过程与细胞分裂共同发生，并伴随干细胞多能性的减弱与肝功能表达的增强。

生物人工肝：是以培养肝(样)细胞为基础的生物或混合生物人工肝支持系统。它的基本要素包括高活性和功能的肝(样)细胞、适合的生物反应器与外部控制系统、有效的体外循环系统，可通过暂时或部分替代肝脏功能，实现对肝脏功能不全或相关疾病的治疗。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

随着干细胞领域研究的深入，人们逐渐探索出干细胞在组织工程学、再生医学、细胞治疗以及药物研究等方面的应用价值。近年来，以生物人工肝为例的应用研究需要大规模扩增出高质量的干细胞并最终定向分化为肝细胞。为了满足临床和科研领域的需要，智能化干细胞培养设备的研发是目前的一大研究热点，而用于及时反馈培养过程中细胞功能状态的自动在线检测系统是该设备的核心部分之一。该综述就干细胞扩增及肝向分化过程中相关的检测指标与检测方法进行了探讨，总结了现已应用于在线检测的指标与方法，讨论了部分指标与方法应用于在线检测的局限性，展望了未来有望应用于在线检测的指标和检测技术，对今后的研究具有抛砖引玉的作用。未来通过搭建智能化的干细胞培养设备，推动细胞的生产向批量化、标准化方向发展，可为解决干细胞数量不足、分化质量不高等问题奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程