2.1  骨髓间充质干细胞的培养及鉴定  接种72 h后可见少量的细胞贴壁，细胞形态不规则；接种7 d后细胞呈旋涡状生长，形态呈短梭形；此后细胞迅速生长，形态多呈长梭形，第3代细胞呈长梭形贴壁生长。流式细胞仪检测显示，细胞高表达CD44、CD90和CD29表面标记物，低表达CD45表面标记物，符合间充质干细胞表面标记物表达特征，见图2。

2.2  两种脱细胞组织的细胞毒性  培养的7 d内，脱细胞羊膜组与脱细胞羊膜下层组的骨髓间充质干细胞生长良好，该两组培养3-7 d的细胞吸光度值高于阴性对照组(P < 0.05)，两实验组间各时间点的吸光度比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.3  两种脱细胞组织的细胞相容性  倒置显微镜下可见，在两种材料周围的骨髓间充质干细胞贴壁生长，形态为长梭形，在材料内部也可见细胞生长，细胞形态与周围的骨髓间充质干细胞一致，见图4A，B。扫描电镜下可见，骨髓间充质干细胞黏附于两种脱细胞材料表面生长并伸出伪足，细胞排列稀疏，形态不规则，见图4C，D。

2.4  创面愈合率  术后大鼠均存活，创面干燥，无红肿等感染与排斥现象。随着术后时间的延长，各组创面逐渐减小。至术后7 d时，空白组创面粘连、结痂，可见出血；观察组与对照组植入的材料与创面周围黏附，并且观察组黏附更牢靠，创面周围未见明显的红肿与渗出。术后14 d时，3组的创面面积均较术后7 d时明显缩小，空白组依然可见明显的血痂，观察组创面大部分闭合，对照组创面闭合介于观察组与空白组之间。术后21 d时，空白组可见部分残留的血痂，观察组与对照组创面基本闭合完全，见图5。各组术后不同时间点的创面愈合率见表1。

2.5  创面病理观察  术后7 d时，观察组与对照组可见少量肉芽组织形成，空白组未见明显肉芽组织形成；术后14 d时，3组均可见明显的肉芽组织形成，观察组肉芽组织较厚、致密且排列规则，对照组与空白组新生肉芽组织较薄，并且结构疏松、排列不规则；术后21 d时，观察组与对照组创面基本愈合，创面上皮化，出现腺样结构，见图6。

2.6  创面相关基因检测  随着术后时间的延长，3组中的Ⅲ型胶原、CK18基因表达量逐渐升高。观察组、对照组术后7，14，21 d的Ⅲ型胶原、CK18基因表达量均高于空白组(P < 0.05或P < 0.01)，观察组术后7，14，21 d的Ⅲ型胶原、CK18基因表达量均高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。随着术后时间的延长，3组的Ⅰ型胶原与血管内皮生长因子基因相对表达量呈先升高后降低的趋势，在术后7 d时两种基因表达达高峰。观察组、对照组术后7，14，21 d的Ⅰ型胶原与血管内皮生长因子基因表达量均高于空白组(P < 0.05或P < 0.01)，观察组术后7，14，21 d的Ⅰ型胶原与血管内皮生长因子基因相对表达量均高于对照组(P < 0.05或P < 0.01)。各组不同时间点的相关基因表达量见图7。

2.7  创面相关蛋白检测  随着术后时间的延长，3组的CK18蛋白表达量逐渐升高，血管内皮生长因子蛋白表达量呈先升高后降低的趋势。观察组术后各时间点的CK18蛋白与血管内皮生长因子蛋白表达量均高于对照组、空白组  (P < 0.05或P < 0.01)，对照组术后各时间点的CK18蛋白与血管内皮生长因子蛋白表达量均高于空白组(P < 0.05)。具体结果见图8。

由创伤、烧伤等原因造成的皮肤缺损是临床较常见的疾病，大面积皮肤缺损会严重影响患者的健康^[1-2]。临床上自体皮肤移植是治疗皮肤缺损的最佳方法^[3-4]，但是对于大面积皮肤缺损患者，有限的可供移植的自体皮肤限制了其临床应用。同种异体移植物与异种移植物虽可用于创面覆盖，但是存在免疫排斥、伦理制约问题与传播疾病的风险^[5-8]。近年来组织工程研究发展迅速，学者们致力于制作不同种类的组织工程皮肤替代物，给大面积皮肤缺损治疗提供了新的途径^[9-13]。组织工程化组织中最基本的结构是支架，其可为细胞与组织提供有力的生长环境，并且在自身组织构建过程中逐渐降解，促进新的具有形态与功能组织及器官的形成，因此支架是成功构建组织工程化皮肤的关键因素之一。

人源羊膜与脐带具有同源性且均属于医疗废物，均具有较低的免疫原性与一定的韧性，研究已显示两者可作为组织工程支架材料。谢雪锋等^[14]研究显示脱细胞羊膜基质是良好的组织工程化尿道支架材料；杨继滨等^[15]的基础研究显示人脱细胞羊膜可以促进人羊膜间充质干细胞增殖及黏附，具有良好的生物相容性；梁远锋等^[16]采用3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐联合十二烷基硫酸钠脱细胞处理获得的脐带动脉细胞血管支架具有良好的生物相容性和力学性能。羊膜下层位于脐带最外层，具有一定的韧性，其作为组织工程支架的研究较少。实验将羊膜与羊膜下层进行脱细胞处理作为组织工程支架，观察二者分别复合骨髓间充质干细胞修复皮肤缺损的效果。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  体外细胞学观察实验，对比观察动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2019年1至8月在江南大学完成。

1.3  材料  新鲜的人羊膜及脐带材料来自江南大学附属医院妇产科的健康产妇。材料获取前告知患者及家属实验目的，患者及家属对实验知情同意并签署知情同意书。

1.3.1  主要试剂及仪器  胎牛血清与Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)培养液购自深圳子科生物科技有限公司；PCR反应试剂盒(PR2101)购自北京百泰克生物技术有限公司；Anti-VEGF抗体购自博士德生物；anti-CK18抗体购自上海微蒙生物技术有限公司；BLD-220型倒置显微镜购自北京世纪科信科学仪器有限公司；SHZ-82A恒温水浴振荡器购自江苏金怡仪器科技有限公司；HF151二氧化碳培养箱购自武汉益普生物科技有限公司；SIGMA 300扫描电镜购自北京欧波同光学技术有限公司。

1.3.2  实验动物  38只清洁级雄性SD大鼠，6周龄，体质量200-230 g，由江南大学动物实验中心提供，其中2只用于提取骨髓间充质干细胞。动物实验获得江南大学动物伦理委员会批准。

1.4  方法

1.4.1  脱细胞羊膜与脱细胞羊膜下层的制备

脱细胞羊膜：于无菌条件下获取健康产妇的胎膜组织，钝性分离羊膜与绒毛膜组织，同时去除羊膜基底面残留的绒毛膜与血管组织，随后以生理盐水反复冲洗，随后置于1%TritonX-100溶液中，放入37 ℃恒温水浴振荡器中  100 r/min震荡24 h；PBS反复冲洗后，放入含0.02%EDTA的胰酶溶液内37 ℃100 r/min震荡4 h；PBS反复冲洗后真空冷冻干燥^[17]，环氧乙烷消毒后备用。

脱细胞羊膜下层：于无菌条件下获取健康产妇的脐带，以高压灭菌预冷的PBS反复冲洗，剥离脐带最外层中羊膜下层的血管、结缔组织与华通氏胶，PBS反复冲洗；置于   2 g/L SDS低渗溶液中37 ℃100 r/min震荡12 h；弃掉SDS低渗溶液，加入2 g/L SDS等渗溶液37 ℃100 r/min震荡 12 h；放入PBS中37 ℃100 r/min震荡12 h；弃掉PBS，放入核酸酶中37 ℃100 r/min震荡9 h；弃掉核酸酶，PBS反复冲洗，环氧乙烷消毒备用^[17]。

1.4.2  骨髓间充质干细胞的分离培养  利用10%水合氯醛以0.3 mL/kg的剂量麻醉后脱臼处死大鼠，采用体积分数75%乙醇消毒整只大鼠，获取大鼠胫骨与股骨，去除两端关节与周围肌肉及其他组织后置于Hanks液中清洗；剪开一端髓腔，将DMEM培养液从另一端髓腔注入反复冲刷骨髓腔，当骨髓腔冲洗颜色发白后停止；将冲洗液吹打均匀后200目不锈钢网过滤去除杂质，采用密度梯度离心法分离单个核细胞，加入10 mL的低糖DMEM培养液(含体积分数10%胎牛血清)轻轻吹打，调整细胞浓度为2×10⁸ L^-1，接种于细胞培养瓶内，置于37 ℃含体积分数5%CO₂的培养箱内培养。5 d后首次换液，而后每三四天进行一次换液。观察细胞融合达到85%时进行传代培养。选择第3代细胞进行后续实验。

  胰酶消化第3代骨髓间充质干细胞，制成单细胞悬液后分装于EP管内，向管内分别加入CD44-FITC、CD90-FITC、CD29-PE和CD45-PE抗体，置于流式细胞仪中检测细胞表面标记物表达。

1.4.3  两种脱细胞组织的细胞毒性   

制备浸提液：将消毒后的脱细胞羊膜与脱细胞羊膜下层裁成1 cm×1 cm大小，放入含5 mL无血清DMEM培养液的培养皿中，4 ℃孵育24 h。将溶液以3 000×g离心5 min，取上清液，0.22 µm虑菌器过滤，置于4 ℃无菌离心管内密封保存。

CCK-8检测：将第3代骨髓间充质干细胞以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于96孔板内，每孔100 µL，分3组培养，每组6孔：两实验组分别加入对应的浸提液，阴性对照组加入无血清的DMEM培养液，置于37 ℃体积分数5%CO₂培养箱内培养。每24 h向各孔中加入CCK-8溶液10 µL，孵育4 h后酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，总共检测7 d。

1.4.4  两种脱细胞组织的细胞相容性  取消毒后的脱细胞羊膜与脱细胞羊膜下层，浸于无菌生理盐水中漂洗10次；将脱细胞羊膜基质面与脱细胞羊膜下层内表面朝上铺于6孔培养板内，向培养板内注射1×10⁹ L^-1的第3代骨髓间充质干细胞，每孔注射1 mL；4 h后每孔加入1 mL培养基，培养于37 ℃体积分数5%CO₂培养箱内，每2 d换液一次。培养7 d后每孔加入2 mL中性甲醛溶液中固定30 min，弃掉中性甲醛溶液，PBS冲洗2次，倒置显微镜下观察。培养14 d后取出复合物，PBS清洗3次，每次10 min，梯度乙醇脱水，加入乙酸异戊酯室温下孵育2 h，临界点干燥后真空喷金，扫描电镜下观察。

1.4.5  大鼠背部急性创面模型制备  10%水合氯醛    30 mg/kg麻醉大鼠，背部剃毛后暴露皮肤，乙醇消毒后在一侧脊柱背部标记2个直径约1.2 cm的圆形区域，两标记相距至少2 cm，利用无菌手术刀根据标记切除皮肤，制作全层皮肤缺损，见图1；随后将36只大鼠随机分为3组，每组12只，观察组植入脱细胞羊膜下层与骨髓间充质干细胞复合物(共培养7 d的复合物)，将铺有骨髓间充质干细胞一面的脱细胞羊膜下层紧贴创面；对照组植入脱细胞羊膜与骨髓间充质干细胞复合物(共培养7 d的复合物)，将铺有骨髓间充质干细胞一面的脱细胞羊膜紧贴创面；空白组未植入任何材料；3组均以凡士林纱布覆盖，适当压力下打包缝合。术后分笼饲养。术后1周拆除缝线。

1.4.6  创面愈合率  术后7，14，21 d每组随机取4只，麻醉后拆开创面，数码相机采集创面图像，并利用ImagePro Plus 6.0图像分析软件进行分析。创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

1.4.7  创面病理观察  各时间点采集创面图像后取创面组织，体积分数10%中性甲醛固定8 h，无水乙醇冲洗后梯度乙醇脱水，依次进行透明、浸蜡、包埋、切片，切片厚度6 µm，进行常规苏木精-伊红染色，封固后显微镜下观察。

1.4.8  创面相关基因检测  将各时间点的创面组织放入冻存管中，液氮中保存24 h，提取总RNA，按照试剂盒说明书反转录合成cDNA，反应程序为：95 ℃ 5 min，95 ℃20 s，60 ℃1 min，共45个循环。Ⅰ型胶原引物序列，正向：AGT CTC CGT GCG CCT CTT，反向：ACT CGC CCT CCC GTC TTT；Ⅲ型胶原引物序列，正向：AAG GGC GAA GAT GGC AAA GA，反向：TTC CGG GCA TAC CCC GTA TC；血管内皮生长因子引物序列，正向：CAG ACA GTG CTC CAG CCG，反向：CTG GGA CCA CTT GGC ATG G；CK18引物序列，正向：GGG CTC AGA TCT TTG CGA AT，反向：TGT CAT CTA CCA CCT TGC GG。每个样品重复3次实验。利用2^-∆∆Ct法分析目的基因的相对表达量。

1.4.9  创面相关蛋白检测  取各时间点的创面组织，液氮冻存后取出，将200 mg组织样本放入含有液氮的研钵内研成粉末，置于离心管内，加入250 µL的蛋白裂解液，     13 000 r/min离心15 min，将上清液转移至新的离心管内，13 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度。取50 μg蛋白样品，加入6 µL 5×SDS- PAGE蛋白上样缓冲液SDS Reducing Sample Buffer，充分混匀，100 ℃金属浴10 min；上样到SDS-PAGE凝胶电泳中分离蛋白, 并转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭 1.0-2.0 h；加入一抗：anti-CK18抗体稀释1∶500，Anti-VEGF抗体稀释1∶1 000，4 ℃孵育过夜，TBST清洗后加HRP标记的二抗室温孵育1 h，ECL显影、曝光。

1.5  主要观察指标  脱细胞羊膜与羊膜下层的细胞相容性，以及复合骨髓间充质干细胞后修复创面损伤的效果。

1.6  统计学分析  实验结果以x(_)±s表达，采用单因素方差分析进行统计处理，采用LSD方法进行组间比较，统计软件为SPSS 19.0。

实验采用十二烷基硫酸钠+核酸酶法处理羊膜下层进行脱细胞处理，采用TritonX-100+胰酶法处理羊膜进行脱细胞处理，预实验显示两种方法处理的脱细胞材料去细胞较完全，细胞外基质结构保留较完整，并且实验中测试显示脱细胞羊膜下层的最大拉力为(12.89±1.21) N，明显大于脱细胞羊膜的(5.89±0.23) N，但二者的拉伸强度比较差异无统计学意义，说明脱细胞羊膜下层的机械强度高于脱细胞羊膜。所以此次实验主要对比脱细胞羊膜与脱细胞羊膜下层修复皮肤缺损的效果差异。

骨髓间充质干细胞具有强大的组织再生能力与多向分化潜能，是目前创面修复与再生研究的较理想种子细胞之一^[18-22]。SAMADIKUCHAKSARAEI等^[23]将脱细胞羊膜与骨髓间充质干细胞复合物移植于皮肤缺损处，结果显示高复合物可以促进创面的修复，并且可抑制创面瘢痕的形成，具有美观的效果。因此实验选择骨髓间充质干细胞作为种子细胞，接种于两种脱细胞材料中。细胞毒性实验显示两种脱细胞材料均可促进骨髓间充质干细胞的增殖，并且脱细胞羊膜下层的促增殖作用略强于脱细胞羊膜，说明两种脱细胞材料均具有良好的细胞相容性，无细胞毒性，符合材料生物应用的要求。光学显微镜与扫描电镜显示，骨髓间充质干细胞在两种脱细胞材料表面黏附、生长良好，细胞形态与培养瓶中培养的相同，说明两种脱细胞材料具有良好的细胞相容性，为后续动物体内实验奠定了基础。

动物体内皮肤修复实验显示，实验组与对照组术后不同时间点的创面愈合率与创面愈合质量均明显优于空白组，说明人源脱细胞羊膜组织或脱细胞羊膜下层组织与骨髓间充质干细胞的复合物可促进皮肤创面的愈合，提高创面愈合质量。观察组早期(7 d)与中期(14 d)的创面愈合率均高于对照组，差异存在统计学意义，说明脱细胞羊膜下层可促进创面的愈合。同时创面病理观察显示观察组术后14 d的创面上皮化效果优于对照组，术后21 d完成上皮化进程，进一步说明脱细胞羊膜下层可促进创面的愈合。CK18、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原为创面组中织参与细胞骨架重建的基因^[24-28]，血管内皮生长因子为创面组织中参与血管形成的基因^[29-32]。创面组织中CK18、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因表达越高，说明创面组织越趋于角皮化与上皮化，愈合更快；血管内皮生长因子基因表达量越高，说明创面血管生成越明显。实验结果显示，观察组术后各时间点的CK18、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因表达水平均明显高于对照组，说明实验组的角质化与上皮化程度更高、创面愈合速率更快。观察组与对照组中的血管内皮生长因子基因表达水平均于术后7 d最高，此后逐渐下降，说明创面组织中已形成明显血管结构，并且观察组各时间点的表达水平明显高于对照组，说明观察组的血管形成更快。综上的基因表达水平检测提示，脱细胞羊膜下层可促进创面愈合相关基因的表达，提高创面愈合率。更进一步检测了创面CK18与血管内皮生长因子的蛋白水平，显示观察组各时间点的两蛋白表达均高于对照组，说明脱细胞羊膜下层可促进创面的愈合。作者推测人源脱细胞羊膜组织与脱细胞羊膜下层组织分别复合骨髓间充质干细胞导致皮肤修复结果差异的可能原因为：脱细胞羊膜下层可能进一步促进了骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等皮肤组织成分，参与皮肤的重建；脱细胞羊膜下层可能进一步促进了骨髓间充质干细胞分泌表皮生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等，这些因子在调节细胞表型和创面修复中起到了重要作用。接下来仅进行体内骨髓间充质干细胞标记跟踪实验进行验证。

实验结果显示相较于脱细胞羊膜，脱细胞羊膜下层可促进创面愈合相关基因与蛋白的表达，促进创面的修复。实验存在不足之处：未明确脱细胞羊膜下层与骨髓间充质干细胞之间的相互作用，对于脱细胞羊膜下层修复皮肤缺损的机制还有待深入的研究；仅制备了深达真皮层的皮肤创面，不能全面反映临床实际情况。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

文题释义：

脱细胞生物支架：其原理是将生物体原型组织中的实质细胞运用化学、酶解或机械方法给予去除后制成的构架，保留了以细胞间质为主的其他成分，维持了生物材料原有的机械性和可塑性，更加适合细胞黏附和增殖生长。

细胞毒性：是化学物质(药物)作用于细胞基本结构和/或生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成、降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖和/或功能的紊乱，所引发的不良反应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

人源羊膜与脐带具有同源性且均属于医疗废物，均具有较低的免疫原性与一定的韧性，研究已显示两者可作为组织工程支架材料。谢雪锋等研究显示脱细胞羊膜基质是良好的组织工程化尿道支架材料；杨继滨等的基础研究显示人脱细胞羊膜可以促进人羊膜间充质干细胞增殖及黏附，具有良好的生物相容性；梁远锋等采用3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐联合十二烷基硫酸钠脱细胞处理获得的脐带动脉细胞血管支架具有良好的生物相容性和力学性能。羊膜下层位于脐带最外层，具有一定的韧性，其作为组织工程支架的研究较少。实验将羊膜与羊膜下层进行脱细胞处理作为组织工程支架，观察二者分别复合骨髓间充质干细胞修复皮肤缺损的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程