2.1  原代培养牙髓干细胞的形态学观察  在酶消化分离培养第3天左右可见原代牙髓干细胞贴壁生长，呈长梭形；在第10天左右较大的若干个细胞克隆样生长(图2)。待细胞生长呈90%融合状态，0.25%胰蛋白酶消化后进行细胞传代。

2.2  体外牙周韧带组织工程复合物情况  在细胞培养皿中牙髓干细胞形态多为梭形，长满皿底时分泌较少细胞外基质(图3A)；牙髓干细胞接种到聚羟基乙酸支架上培养到1周，倒置相差显微镜下可观察到大多数牙髓干细胞黏附在聚羟基乙酸纤维并沿着纤维排列方向生长，分泌大量的细胞外基质，形成体外组织工程复合物(图3B-D)。

2.3  动物一般情况  纳入实验的6只成年健康比格犬无死亡或发生感染，均进入结果分析。术后12周伤口愈合良好，对照组牙龈位置较低，无明显水肿、坏死、化脓等炎症反应。

2.4  牙周缺损部位组织学观察结果

苏木精-伊红染色：实验组牙周缺损处可见较多的新骨生成，离根面缺损远端处见β-磷酸三钙吸收后形成的新生骨结构与正常骨组织结构仍存在差别，上方纤维结缔组织较厚；对照组缺损处只有少量新骨形成，牙龈与根面并没有结合形成长结合上皮结构，见图4。

AZAN染色：实验组牙周缺损处可见致密的新骨生成、牙周膜再生及较薄的牙骨质层形成，新生牙周膜与正常牙周膜组织接近，新生牙槽骨靠近缺损近中多为密质骨，新骨上方纤维结缔组织层较厚，可见部分牙龈塌陷向下与新骨接触，牙龈内可见炎症浸润细胞；对照组缺损处只有少量新骨形成，几乎没有新生牙周膜，上方为牙龈结缔组织，牙龈与根面并没有结合形成长结合上皮结构，见图5。

2.5  组织学测量定量分析情况  实验组结合上皮长度、新生牙骨质、新生牙周膜、新生骨高度、新生骨面积均多于对照组(P < 0.05)，见表1。

牙周治疗的最终目标是使受损的牙周组织再生，但目前多数的结果是牙周组织的修复，很难形成正常的牙周组织结构^[1-3]。临床上牙周治疗的结果主要关注于牙槽骨高度的恢复，但是真正的牙周组织再生涉及到牙周支持组织的特殊界面(根面牙骨质-牙周韧带-牙槽骨)^[4-6]，修复与重建新生牙周组织的结构和功能，而临床上这种界面结构的形成往往缺乏足够的组织学证据的支持，因此动物实验提供给研究者充分的组织学证据来研究不同牙周再生的治疗技术效果。当前研究多集中通过牙周组织工程技术来实现牙周的再生，主要是将体外培养的种子细胞接种于生物相容性好的支架材料中，从而体外构建出具有生物活性的牙周组织工程化复合物，而后回植于体内，有望实现牙周组织的再生和功能重建^[7]。

牙周组织工程技术主要是针对具有增殖分化能力的种子细胞、合适的支架材料和细胞生长调节因子3大要素进行研究。间充质干细胞具有自我更新和一定的多向分化潜能，是处于全能细胞和成熟分化细胞之间的成体干细胞。2000年GRONTHOS等^[8]首先分离了人牙髓干细胞，其具有自我更新、多向分化能力，可以向骨组织、脂肪组织、神经组织等分化，因此牙源性间充质干细胞是牙周组织工程常用的种子细胞。其次，生物支架的结构和组成也同样具有重要意义，它决定了与宿主组织之间的生物相容性，并刺激组织的再生。有部分学者报道了应用牙髓干细胞细胞膜片、牙髓干细胞联合Bio-oss人工骨粉等可以促进牙周组织缺损修复的研究^[9-13]，但至今仍未在重度牙周缺损方面取得理想的结果，需要不断地探索更理想的牙周再生方法。课题组前期制备了人牙髓干细胞复合线性排列的聚羟基乙酸，发现在力学刺激下可有效构建组织工程化肌腱韧带样组 织^[14]。回顾以往他人的研究，未见报道将肌腱/韧带组织工程复合物植入到牙周组织缺损处验证牙周再生效果的研究，因此假设移植肌腱/韧带组织工程复合物可以促进牙周组织缺损。为了进一步探讨该方法构建的肌腱/韧带组织工程化复合物能否促进牙周组织缺损的修复，实验通过将犬牙髓干细胞接种于线性聚羟基乙酸纤维支架上进行体外培养，并加以力学刺激，诱导形成组织工程化肌腱/韧带样组织，再移植于犬的一壁牙周缺损，评估其对牙周组织缺损的修复再生疗效。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  于2016年1至9月在南京军区福州总医院动物实验中心完成。

1.3  材料  

1.3.1  实验动物  1岁龄健康雄性Beagle犬6只，体质量10-12 kg，由青岛博隆实验动物有限公司提供，动物合格证号：SYXK(闽)2013-0005，动物实验批准号：IACUC- 2016-30，在南京军区福州总医院动物实验中心饲养。动物实验获得南京军区福州总医院实验动物福利与伦理委员会批准。

1.3.2  主要试剂和材料  聚羟基乙酸(上海聚睿生物有限公司，中国)；β-磷酸三钙(上海贝奥路生物材料有限公司)；α-MEM培养基、低糖DMEM培养基、胎牛血清(Hyclone，美国)；戊巴比妥钠、0.25%胰酶、Ⅰ型胶原酶、Dispase酶(Sigma，美国)；头孢唑林钠(华北制药，中国)；正畸钢丝扩弓器(自制)。

1.3.3  主要仪器  CO₂培养箱(Heraeus，德国)；酶标仪(Bio-Rad，美国)；便携式牙科涡轮机(上海品瑞，中国)；荧光倒置相差显微镜(Olympus，日本)；Hfsafe-1200型生物安全柜(力申科学仪器有限公司，中国)；离心机(Eppendorf，德国)。

1.4  实验方法

1.4.1  犬牙髓干细胞的原代分离、培养  取6只比格犬，在全身麻醉下拔除每只犬下颌第一、二、四前磨牙及第二切牙，送至细胞培养室进行原代细胞培养。采用课题组之前使用的稀释克隆法进行Beagle犬原代牙髓干细胞的分离培养^[14]：将拔除后的牙齿立即放入含有200 U/mL青霉素、200 U/mL链霉素的预冷α-MEM培养液中，碘伏擦拭消毒牙齿表面，无菌条件下预冷的PBS反复冲洗牙齿，去除表面污渍；无菌条件下取出牙髓组织，将牙髓组织剪成1 mm×  1 mm×1 mm大小；3 g/LⅠ型胶原酶和4 g/L中性蛋白酶联合消化，37 ℃孵育1 h，每隔15 min混匀1次，离心后去除上清，用1 mL含体积分数10%血清、10 U/mL青霉素及  100 U/mL链霉素的α-MEM培养液重悬，通过200目孔筛获取单细胞悬液，调节细胞密度约1 000/cm²，加适量的上述α-MEM培养液进行培养。24 h后去除旧培养液，PBS冲洗3次，换培养液后镜下观察细胞；培养至10 d后更换一半的培养液；之后每隔两三天换液1次，待细胞长满培养瓶80%-90%时进行传代；流式细胞仪检测鉴定为干细胞。选择第3-5代细胞用于后续实验。

1.4.2  构建牙周韧带组织工程复合物  参照课题组前期实验方法^[14]：收集消化离心后的犬牙髓干细胞，加入少量培养液吹打成约2×10¹⁰ L^-1的细胞悬液；吸净聚羟基乙酸支架材料中的培养液，滴加0.5 mL的细胞悬液，使其均匀分布于聚羟基乙酸支架表面，培养箱中预培养4 h，加液，初期沿着聚羟基乙酸纤维线性排列的方向加力1 N，至聚羟基乙酸纤维处于紧绷而不至断裂。以后每2 d换液1次。后续组织工程产物培养过程无施加力学处理。培养2周后用于后续实验。

1.4.3  犬牙周缺损的修复  比格犬下颌第二、四前磨牙拔牙创愈合8周后，于双侧第一磨牙近中和第三前磨牙近、远中侧制备一壁牙周缺损(深5 mm×宽5 mm)，去除根面残留的牙骨质和牙周膜，缺损的底部最低点作根面标记点(图1)。随机分为2组：实验组取出培养2周后的犬自体牙髓干细胞移植于聚羟基乙酸支架的组织工程复合物，剪取约长5 mm×宽2 mm大小的复合物，放置紧挨于一侧缺损的根面，靠近缺损骨壁多余的空间由β-磷酸三钙混合自体骨进行填充；另一侧骨缺损不做任何填充处理，作为对照组，间断缝合。术后每天给予犬肌注头孢唑啉钠注射液(20 mg/kg，1次/d，连续7 d)，并使用0.2%氯己定溶液清理伤口周围，术后观察。

1.5  主要观察指标  移植后12周处死比格犬，40 g/L多聚甲醛进行组织固定犬下颌骨标本，将离体的下颌骨进行牙科X射线拍摄，观察术后愈合情况。标本经常规脱钙处理、包埋切片后分别进行苏木精-伊红和AZAN组织学染色，显微镜下进行观察和测量，记录组织学牙周再生相关指标。

牙周再生指标：①结合上皮长度：龈沟上皮根尖端底至结合上皮根尖端底的距离；②新生牙骨质：切迹处至根面新形成的牙骨质顶点间长度；③新生牙周膜：根面切迹处以上新形成的牙周膜沿着根面的长度；④新生骨高度：新生牙槽骨冠方顶点至根方切迹底之间的距离；⑤新骨面积：根方切记底以上新骨面积。

1.6  统计学分析  实验数据使用SPSS 19.0统计软件分析，对两组之间的牙周再生相关数据进行分析，所有数据用x(_)±s表示，单因素方差分析检验两组样本之间的牙周再生相关指标情况，P < 0.05认为差异有显著性意义。

牙周病的治疗目标包括阻止牙周疾病的发展，并且使受破坏的牙周组织恢复到原先的牙周组织结构，即牙槽骨和牙骨质的新生及最重要的是牙周膜功能附着结构形成。对于较大范围破坏的牙周组织，目前临床上的技术并不能获得满意的再生疗效^[15-16]。一直以来许多研究通过牙周组织工程技术来修复牙周缺损，而体外构建组织工程化牙周韧带结构成为牙周组织工程的研究重要内容。因此实验采用牙髓干细胞复合聚羟基乙酸并接受力学刺激下形成组织工程化韧带，体内植入牙周缺损处黏附于牙根表面^[17-21]，以期重建牙周纤维和硬组织界面的牙周组织结构。

在动物实验牙周缺损模型中，KIM等^[22]证实了牙周缺损骨壁数量是影响牙周再生疗效的关键因素，一壁牙周缺损的新生骨高度及牙骨质均明显少于三壁牙周缺损。实验选用犬一壁牙周缺损作为牙周缺损实验模型，组织学观察到牙周缺损的空间崩塌、软组织塌陷到牙周缺损区域，新骨生成、新生牙周膜或牙骨质几乎平齐于缺损切迹，牙周再生指标中新生牙骨质、新生骨高度均比KIM等^[22]的实验结果要小，但是由于实验中制备的一壁牙周缺损大于KIM等^[22]实验中的牙周缺损(5 mm×5 mm>4 mm×4 mm)，故牙周再生的效果受到了一定程度影响。因此实验使用的一壁牙周缺损模型能够较好地体现出各种牙周再生治疗技术的效果，可作为评估牙周再生相对可靠的动物模型。

种子细胞是牙周组织工程研究的重要因素之一。间充质干细胞具有自我更新和一定的分化潜能，是处于全能细胞和成熟分化细胞之间的成体干细胞。在牙源性间充质干细胞应用于牙周再生的动物实验中，牙髓干细胞是牙周组织工程中重要的种子细胞^[23-27]。CAO等^[9]利用腺病毒转染肝细胞生长因子基因HGF到人牙髓干细胞中得到HGF-人牙髓干细胞，将其用于小型猪的牙周缺损模型中，显示人牙髓干细胞和HGF-人牙髓干细胞细胞膜片可显著提升牙周组织再生。HU等^[10]将人牙髓干细胞移植到猪牙周炎模型中用于牙周再生，发现使用牙髓干细胞注射或细胞膜片移植可以获得明显的牙周骨再生和软组织愈合。KHORSAND等^[11]将犬牙髓干细胞联合人工骨粉bio-oss植入到三壁牙周缺损中得到了显著的牙周再生疗效。这些研究结果表明作为牙周组织修复的种子细胞，牙髓干细胞具有良好的增殖能力、多向分化能力，而且有着在组织修复再生中免疫调节的作用^[28-29]，能够使得牙髓干细胞移植到牙周骨缺损处促进牙周再生过程中不产生免疫反应。因此实验选用牙髓干细胞作为牙周组织工程的种子细胞。

作为牙周组织工程支架材料，聚羟基乙酸支架材料具有生物相容性良好、生物可降解性、无细胞毒性等特点，其降解产物为乳酸和羟基乙酸单体等，最终产物为CO₂和H₂O^[30]。课题组CHEN等^[14]的研究发现，将人牙髓干细胞接种于聚羟基乙酸支架利用正畸扩弓器加载力学刺激，发现牙髓干细胞的肌腱/韧带相关基因(EYA2、SCX、TNC、TNMD)表达增强，并形成体外组织工程化肌腱。而且牙周韧带被认为是一种特殊的纤维韧带组织，连接牙骨质和牙槽骨两种硬组织，并可随牙齿的移动而发生吸收重建。实验将牙髓干细胞接种到聚羟基乙酸支架体外力学刺激下培养后植入到犬牙周缺损模型中，检测这种组织工程学方法构建的仿生牙周韧带植入犬牙周骨缺损促进牙周再生的能力。结果显示实验组新生牙周膜及新生骨等指标高于对照组，说明聚羟基乙酸-人牙髓干细胞组织工程化牙周韧带后能够促进牙周膜、牙骨质和牙槽骨的再生。体外构建的聚羟基乙酸-牙髓干细胞支架通过细胞自身分泌的细胞外基质形成内源性支架，使得细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的交互作用和信息传递更充分，这可能有助于移植体内后更快地形成牙周组织。实验中组织学观察也发现聚羟基乙酸纤维已完全降解。有研究显示植入接种牙髓干细胞或牙周韧带干细胞的聚羟基乙酸后，牙髓干细胞和牙周韧带干细胞促进了牙周组织的再生，推测牙髓干细胞或牙周韧带干细胞在体内微环境下增殖生长和分化向成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞，继而形成牙骨质、牙周膜和牙槽骨，并且机体受损后的应激反应招募和激活体内干细胞到缺损区域修复牙周缺损，进一步参与牙周再生。更重要的是牙髓干细胞或牙周韧带干细胞作为牙源性间充质干细胞具有免疫调节特性^[31-32]，通过一系列免疫抑制因子或细胞因子的作用，具调节微环境炎症和组织体内平衡能  力^[32]，这对于牙周再生过程可能起着关键作用。但实验中牙髓干细胞未能使用细胞标记来进一步证实这种干细胞在不同愈合阶段参与牙周再生的机制。李敏等^[33]将牙周韧带细胞接种到聚羟基乙酸支架用于修复犬的根分叉缺损模型，观察到新生的牙槽骨与牙周膜相连接且有薄层牙骨质沉积，证明牙周韧带细胞-聚羟基乙酸复合体能够促进牙周组织再生。因此可以看出在合适的支架材料(如聚羟基乙酸)条件下，两种常见的牙源性种子细胞牙髓干细胞和牙周韧带细胞均具有促进牙周再生的潜能。

尽管实验中观察到牙周组织获得部分再生，但新生的组织还没有达到理想状态，主要原因在于目前研究对细胞移植促进牙周再生的具体机制仍未清楚，需要广大学者进一步深入研究。另外，实验采用急性牙周缺损模型来评价牙周再生治疗效果，因干扰因素较少，能够较为充分地证实实验因素的修复再生效果，但急性牙周缺损模型不能代表慢性牙周炎复杂的环境条件，与临床牙周病变还是有一定程度的差别，这一点也需要注意。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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文题释义：

牙髓干细胞：是牙髓组织中高度增殖、具有自我更新能力和多向分化潜能的一类成体干细胞，来源丰富、获取方便、不涉及伦理问题，在牙齿、骨和神经的修复、再生及组织工程相关研究中具有重要作用。

牙周组织缺损：包括牙周韧带、牙骨质和牙槽骨的破坏，牙周组织缺损或丧失常见于牙周病和牙周创伤。牙周组织缺损最理想的愈合是达到牙槽骨、牙骨质和牙周膜的完全功能性再生，从而获得牙周新附着。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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(1) 如何针对牙周韧带的特点，设计出仿生纤维支架模仿牙周韧带的排列和结构， 以期在体内移植后获得牙周组织附着结构，是牙周缺损获得组织再生的关键；

(2) 实验通过将牙髓干细胞黏附在线性排列的聚羟基乙酸纤维上，并加以力学刺激，以组织工程技术获得携带牙髓干细胞的组织工程化牙周膜，自体植入到一壁牙周组织缺损后形成黏附牙根表面的牙周膜结构，促进牙周组织再生和重建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程