2.1  实验动物数量分析  实验过程中动物无死亡，110只全部进入结果分析。

2.2  各组大鼠体质量变化  如图1所示，造模阶段，相对于空白对照组及假手术组，模型组大鼠的体质量增长明显较慢(P < 0.05)；在处理阶段，左旋甲状腺素组，左旋甲状腺素+维生素D3组，运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组的大鼠及对照组大鼠体质量增加速率明显快于其他无左旋甲状腺素处理的各组(P < 0.05)。

2.3  各组甲状腺功能比较  由表1可见，在造模阶段，模型组大鼠TSH较空白对照组及假手术组高(P < 0.05)，而FT3和FT4与空白对照组及假手术组相比差异无显著性意义，模型组符合亚临床甲减的诊断标准^[21]，该模型可以用于后续试验。由表2可见，在处理阶段，与无处理组相比，运动组、维生素D3组和运动+维生素D3组大鼠的血清TSH水平无明显变化；而左旋甲状腺素组，左旋甲状腺素+维生素D3组，运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组的大鼠血清中的TSH比其他无左旋甲状腺素处理组显著降低(P < 0.05)，回至正常对照组水平。

2.3  各组甲状腺功能比较  由表1可见，在造模阶段，模型组大鼠TSH较空白对照组及假手术组高(P < 0.05)，而FT3和FT4与空白对照组及假手术组相比差异无显著性意义，模型组符合亚临床甲减的诊断标准^[21]，该模型可以用于后续试验。由表2可见，在处理阶段，与无处理组相比，运动组、维生素D3组和运动+维生素D3组大鼠的血清TSH水平无明显变化；而左旋甲状腺素组，左旋甲状腺素+维生素D3组，运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组的大鼠血清中的TSH比其他无左旋甲状腺素处理组显著降低(P < 0.05)，回至正常对照组水平。

2.4  各组骨代谢指标变化  由表3可见，在处理阶段第52天，与无处理组相比，运动组、维生素D3组和运动+维生素D3组大鼠的β-CTx、TRACP-5b、BLAP、PINP和骨钙素水平无明显变化；与其他无甲状腺素处理的各组大鼠相比，左旋甲状腺素组、左旋甲状腺素+维生素D3组、运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组的大鼠的β-CTx、TRACP-5b、BLAP、PINP及骨钙素则显著升高(P < 0.05)；且以运动+左旋甲状腺素+维生素D3组中骨代谢指标的改善最为显著(P < 0.05)。左旋甲状腺素+维生素D3组及运动+左旋甲状腺素+维生素D3组大鼠中的血清钙和磷水平显著高于其他无维生素D3处理组(P < 0.05)。左旋甲状腺素+运动组大鼠的骨代谢指标要显著高于单用甲状腺素组，左旋甲状腺素+运动+维生素D3组大鼠的骨代谢指标要显著高于左旋甲状腺素+维生素D3组。左旋甲状腺素+维生素D3大鼠的骨代谢指标要显著高于单用甲状腺素组，左旋甲状腺素+运动+维生素D3组大鼠的骨代谢指标要显著高于左旋甲状腺素+运动组。

2.5  各组骨密度变化  由表4可见，与无处理组相比，运动组、维生素D3组和运动+维生素D3组大鼠的骨密度水平无明显变化；与其他无甲状腺素处理的各组大鼠相比，左旋甲状腺素组、左旋甲状腺素+维生素D3组及运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组的大鼠骨密度则显著升高(P < 0.05)，且以运动+左旋甲状腺素+维生素D3组改善最为显著(P < 0.05)。左旋甲状腺素+运动组大鼠的骨密度要显著高于单用甲状腺素组，左旋甲状腺素+运动+维生素D3组大鼠的骨密度要显著高于左旋甲状腺素+维生素D3组。左旋甲状腺素+维生素D3大鼠的骨密度要显著高于单用甲状腺素组，左旋甲状腺素+运动+维生素D3组大鼠的骨密度要显著高于左旋甲状腺素+运动组。

2.6  各组大鼠右侧股骨组织的病理形态变化  由图2可知，正常对照组大鼠股骨骨小梁排列紧密，结构完整；而无处理组、运动组、维生素D3组和运动+维生素D3组大鼠股骨骨小梁则分布稀疏，结构细长变薄，数量减少；左旋甲状腺素组、左旋甲状腺素+维生素D3组、运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组大鼠股骨股小梁则增多，形态得到改善。

2.7  各组大鼠中股骨组织中Cathepsin K蛋白表达水平  由图3可见，与正常对照组相比，无处理组、运动组、维生素D3组和运动+维生素D3组大鼠股骨组织中的Cathepsin K水平显著增加(P < 0.05)，而左旋甲状腺素组、左旋甲状腺素+维生素D3组、运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组大鼠股骨组织中的Cathepsin K水平显著低于无左旋甲状腺素处理的各组(P < 0.05)，且以运动+左旋甲状腺素+维生素D3组和运动+左旋甲状腺素组中大鼠股骨组织中下降程度最为明显(P < 0.05)。

亚临床甲减是指轻度甲状腺功能衰竭的表现，其临床表现为促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone，TSH)升高而游离的甲状腺激素T3、T4基本正常，是一种内分泌代谢性疾病^[1]，是甲状腺功能障碍的早期阶段。亚临床甲减是一种系统性疾病，可以引起机体各器官功能状态变化，包括引起骨密度降低、骨质疏松等^[2]。骨质疏松以骨量低，骨组织微结构受到破坏为基础，使得骨脆性增加，容易因外力发生骨折，尤其多见于年老人群、绝经后妇女等人群^[3]。有研究表明，成骨细胞及破骨细胞均表达TSH受体，使得TSH可以独立于甲状腺激素而直接作用于机体成骨细胞与破骨细胞，促进破骨细胞发生凋亡，并抑制成骨细胞分化过程，而呈现出低转换型骨质疏松症的特点^[4-7]，TSH作用于软骨细胞后，可通过TSH-TSHR信号抑制软骨分化进而影响骨骼发育^[8]。骨质疏松容易导致脆性骨折，即在较小的外力或者较轻微的日常活动即可发生骨折的情况，危害大，容易致残致死，在老年患者中更为明显^[9]，故对骨质疏松的预防和治疗显得尤为重要。

      目前，针对骨质疏松的治疗主要涉及规律运动、补充维生素D及钙剂、治疗原发疾病、使用抗骨质疏松药物等。其中，运动可以促进骨的合成作用，使得骨吸收减少，骨形成增多，在骨的构建与重塑过程中起到重要的反馈与调节作用；运动也可增加骨骼肌的强度，后者则通过增加载荷增强成骨细胞活性，使得骨生成增加；各种形式的适量运动均可以改善骨质疏松，包括抗体重运动、休闲运动及有氧运动等^[10]，但是目前就骨质疏松而言，仅仅靠运动进行治疗是远远不够，还需要结合治疗原发病等方式。骨质疏松患者通常伴有1，25-二羟维生素D3水平的降低，并介导钙吸收不足，促进骨骼动员更多的钙质，并骨吸收的增加及骨质疏松，而维生素D则主要是通过促进消化道对钙的吸收，增加血钙，促进骨矿化等改善骨质疏松^[11-12]。对于亚临床甲减的主要治疗方式是补充左旋甲状腺素，可以显著改善亚临床甲减的症状，但左旋甲状腺素对于亚临床甲减性骨质疏松的治疗作用却鲜有研究，黄婧^[13]提出，左旋甲状腺素部分改善实验大鼠骨代谢异常，但对于左旋甲状腺素治疗原发性疾病的同时，结合运动及维生素D3是否对亚临床甲减性骨质疏松起到更好的疗效却未见报道。亚临床甲减发病率有逐年增高的趋势，且其发病年龄并不仅限于年老患者^[14]，因骨质疏松是一种多因素疾病，此次研究旨在探索有氧运动、甲状腺素替代疗法及维生素D分别在亚临床甲减性骨质疏松治疗中所起的作用及联合治疗的必要性，为临床上预防和治疗亚临床甲减性骨质疏松提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2016年2月至11月在晋中学院生物科学与技术学院动物学实验中心完成。

1.3  材料

1.3.1  实验动物  健康6周龄SPF级Wistar雄性大鼠110只，体质量120-150 g，来源于晋中学院生物科学与技术学院动物学实验中心。所有大鼠分笼饲养，自由饮食，按照动物福利规定进行饲养^[15]。动物实验中心条件符合SPF级标准，动物房温度维持在20-23 ℃，室内湿度维持在50%-55%之间，明暗分段12 h/12 h，且大鼠均未进行过规律性跑台运动。此次实验中涉及的所有实验操作均按照动物福利规定进行。

1.3.2  实验试剂  水合氯醛、无水乙醇、甲醇、TBST、电泳液及电转液(北京中科科奥)；1%碘伏(上海研生生化)；注射用青霉素钠(山东鲁抗)；FT3、FT4及TSH检测试剂盒(研科生物)；β-Ⅰ型胶原羧基端肽(β-CTx)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)、骨型碱性磷酸酶(BALP)、Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)、骨钙素试剂盒(上海丰翔生物)；左旋甲状腺素钠片(德国merck公司)；维生素D3注射液(江苏吴中医药集团)；钙和磷测定试剂盒(南京建成生物)；苏木精-伊红染色相关试剂(北京中杉金桥公司)；PVDFIPVH00010)转印膜(密理博)；HRP辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗及ECLPlµs化学发光试剂盒、蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术)；Cathepsin K抗体(ab 188604，abcam公司)；L-T4针剂(Sigma公司)；骨组织总蛋白提取试剂盒(上海圻明生物)。

1.3.3  实验器材  DEXA骨密度仪(DPXProdigy)、放射免疫计数仪、动物跑台由晋中学院体育学院动物实验中心提供。

1.4  方法

1.4.1  分组造模干预方法  取Wistar大鼠100只，随机分为3组：①空白对照组(n=10)，每天予以模型组同等体积的生理盐水在腹股沟皮下注射；②假手术组(n=10)：钝性逐层分离结缔组织和肌肉后，不进行甲状腺全切操作，消毒缝合，每天予以模型组同等体积的生理盐水在腹股沟皮下注射；③模型组(n=80)：以甲状腺全切术+术后皮下注射L-T4法构建亚临床甲减模型^[16]。具体方法：大鼠麻醉后钝性逐层分离结缔组织和肌肉等，避免损伤重要血管和神经，暴露双侧甲状腺，并进行全切，随后消毒缝合，术后正常饲养，但应连续5 d腹腔注射青霉素5万单位预防感染。术后每3 d记录一次体质量。手术后3周，待大鼠情况稳定后，模型组每天给予9.5 ng/g L-T4腹股沟皮下注射。并于鼠尾取血测FT3、FT4及TSH，用以评价亚临床甲减大鼠模型是否造模成功。

将造模成功的80只亚临床甲减大鼠模型随机分为8组：无处理组、运动组、左旋甲状腺素组、维生素D3组、运动+左旋甲状腺素组、运动+维生素D3组、左旋甲状腺素+维生素D3组、运动+左旋甲状腺素+维生素D3组，每组10只，另设置一正常对照组10只(体质量250-260 g)。处理因素：①左旋甲状腺素钠按照5 μg/(kg•d)溶于生理盐水灌胃^[16]；②维生素D3按照3 μg/(kg•d)溶于丙二醇腹腔注射^[17]；③设计的运动方案：先进行适应性跑步3 d，跑台无坡度，运动时间由20 min/d开始按照每天递增10 min时长，直到达到60 min/d，运动强度为0.72 km/h。正式运动：负荷训练阶段跑台倾斜度5°，强度为1.08 km/h，运动时长1 h，相当于 65%-75%  VO_2 max，持续运动52 d，每周6次^[18-19]。按照上述8组分组方案进行处理，正常对照组大鼠不做任何处理。处理阶段为52 d，每3 d记录体质量，观察大鼠的活动、饮食等情况。实验结束后，取血及生理标本保存并检测各项指标。

1.4.2  血清生化指标的测定  取大鼠血液按照试剂盒说

明书测定血清中的Ca、P、β-CTx、TRACP-5b、BLAP、PINP及骨钙素水平；血清FT3、FT4、TSH按照放射免疫试剂盒说明书进行操作。

1.4.3  骨密度检测  将大鼠麻醉之后置于DEXA探头下，固定四肢，脊椎呈中立位，采用双能X射线骨密度仪进行检测，检测部位包括大鼠头骨、脊柱、上肢和下肢。

1.4.4  Western blotting实验检测Cathepsin K表达  按照骨组织总蛋白提取试剂盒提取各组大鼠右侧股骨组织的总蛋白，并利用蛋白定量试剂盒(BCA法)进行蛋白样品定量后，在SDS-PAGE凝胶中各取30 μg总蛋白进行电泳，随后经过转膜、封闭、一抗(Cathepsin K抗体，比例为1︰100)、二抗(HRP辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，比例为    1︰200)等孵育过程后，用ECL化学发光试剂盒对条带进行曝光，并保存图像。

1.4.5  苏木精-伊红染色观察骨组织病理形态变化  取大鼠右侧股骨组织制成石蜡切片，并按改良的骨组织染色方法进行苏木精-伊红染色^[20]，并于奥林巴斯倒置显微镜下观察骨组织的病理变化，然后拍照保存。

1.5  主要观察指标  各组大鼠体质量及甲状腺功能指标变化、骨代谢指标变化、骨密度变化、骨组织病理形态变化及Cathepsin K表达。

1.6  统计学分析  采用SPSS 23.0软件对实验数据进行处理，结果以x(_)±s的方式表示。两组之间统计方法采用t 检验；多组之间的比较采用单因素方差分析。P < 0.05认为差异有显著性意义，P < 0.01、P < 0.001为差异有非常显著性意义。

亚临床甲减患病率有逐年增高的趋势，其病因多种，如桥本甲状腺炎、¹³¹I放疗、1型糖尿病及系统性硬化症等。针对亚临床甲减性骨质疏松的研究也逐渐增多，有研究认为亚临床甲减性骨质疏松患者存在血钙下降、骨密度降低等情况，且尤其以老年患者发生髋部骨折风险较大^[22]。此次研究发现，亚临床甲减性大鼠的骨吸收及骨生成指标β-CTx、TRACP-5b、BLAP、PINP、骨钙素均较正常对照组大鼠显著降低，骨密度也显著低于正常对照组大鼠，且骨小梁病理形态异常，说明亚临床甲减性骨质疏松属于低转换型。

目前，对于亚临床甲减患者主要是以药物治疗为主，左旋甲状腺素则以良好的疗效在临床上得到推广^[23]。在进行为期52 d的各种处理后，实验发现相对于没有使用左旋甲状腺素的各组大鼠，使用左旋甲状腺素后的各组大鼠，在体质量、骨代谢指标、骨密度、骨小梁形态等指标上都有显著改善，说明对于亚临床甲减性骨质疏松的治疗而言，补充适量的左旋甲状腺素是最为关键的一环，骨吸收及骨生成指标显著提高，说明甲状腺素可以增加骨转换速率，这与黄婧^[13]的研究结果一致，并在其基础探究了甲状腺素对骨吸收及骨形成过程的促进作用，及对Cathepsin K表达的抑制作用，这为甲状腺素对亚临床甲减性骨质疏松的治疗提供了理论基础。

长期服用药物会增加肝脏的压力，带来不良反应，而运动包括有氧运动、无氧运动及抗阻运动等，因其可持续、低成本而逐渐受到患者及研究者的关注。适量运动可以对骨质疏松患者起到很好的治疗效果。机体在运动过程中会对骨骼产生牵拉等应力刺激，并使得骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并抑制其向脂肪细胞分化，促进成骨细胞的增殖能力，减少破骨细胞的数量及活力等，最终达到促进骨质形成的作用^[24]。CASE等^[25]提出对小鼠进行2%-3%强度的牵张运动处理后，过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ2)和甲状旁腺激素1(PTHR-1)水平得到了显著性抑制，在抑制脂肪合成的同时，骨髓间充质干细胞中的Ⅰ型胶原及骨粘连蛋白有明显升高，成骨细胞增殖能力增加。YU等^[26]在实验中观察到3%、6%强度的牵张运动可以促进成骨细胞分化，这与牵张运动激活Wnt通路显著相关。刘江等^[27]也报道了长期适度运动有助于调整骨质转换，减低骨吸收，促进骨生成，预防骨质疏松，尤其是对于绝经后妇女预防骨质疏松起到重要作用。总而言之，适量运动对于骨质疏松患者而言是一项非常有利且成本低的预防及治疗措施。而此次研究结果提示，左旋甲状腺素+运动组大鼠的骨代谢及骨密度指标要显著高于单用甲状腺素组，左旋甲状腺素+运动+维生素D3组大鼠的骨代谢及骨密度指标要显著高于左旋甲状腺素+维生素D3组，这说明运动可以起到增加疗效的作用，骨形成与骨吸收指标均有显著提高，提示运动可以使得亚临床甲减性低转换型骨质疏松得到改善，骨转换速率增加，这也符合前述研究的报道，运动可以增加成骨细胞的增殖能力等，不同的是，此次研究发现运动可以增加骨吸收指标，这提示运动在不同类型的骨质疏松中起到的作用是不同的，其具体机制仍需进一步进行探讨。

      维生素D具有抑制骨吸收、降低骨转换从而增加骨密度以预防和治疗骨质疏松的作用^[28]，尤其是对于绝经后妇女的骨质疏松症状有明显的改善作用，维生素D是一种骨代谢调节剂，能促进肠道对于钙离子的吸收，维持骨钙内环境稳  态^[29]。刘永莹等^[30-31]也提出，维生素D3可以调节体内钙平衡，促进钙离子的肠道吸收率，缓解甲状腺功能低下相关性骨质疏松。王军峰等^[32]提出高剂量的维生素D对骨质疏松患者可以起到增加骨密度、延缓骨吸收过程、减少骨量丢失、有效缓解骨质疏松等作用。维生素D在体内钙磷代谢中起到重要作用，充足的维生素D能够产生丰富的钙磷产物，介导有效的骨骼矿化^[11]。此次研究结果提示，左旋甲状腺素+维生素D3大鼠的骨代谢及骨密度指标要显著高于单用甲状腺素组，左旋甲状腺素+运动+维生素D3组大鼠的骨代谢及骨密度指标要显著高于左旋甲状腺素+运动组，这说明补充维生素D3可以起到改善骨质疏松的作用，与前述研究相同的是，此次研究也证实了维生素D3可以增加血清内钙离子的水平，后者可以通过促进骨钙化改善骨质疏松，但是同时也观察到骨吸收指标的增加，这可能是因为亚临床甲减性骨质疏松属于低转化骨质疏松，而补充甲状腺素后转化速率增加，维生素D3对于骨吸收的改变不是主要因素。

此外，作者注意到无处理组、运动组、维生素D3组和运动+维生素D3组大鼠股骨组织中的Cathepsin K水平显著高于正常对照组大鼠，但是经过左旋甲状腺素治疗后，各组大鼠的Cathepsin K则显著降低，其中以运动+左旋甲状腺素组和运动+左旋甲状腺素+维生素D3组下降最为明显。组织蛋白酶K(cathepsin K) 在破骨细胞中表达，是降解骨基质蛋白的关键蛋白酶，在骨吸收中发挥重要作用，可以在多个位点降解胶原蛋白^[33]，这提示联合疗法可以通过抑制Cathepsin K的表达而起到抑制骨吸收、维持骨量、治疗骨质疏松的作用，而运动因素在左旋甲状腺素的基础上明显抑制Cathepsin K的表达，提示运动在骨质疏松预防与治疗中的作用。

      目前关于亚临床甲减性骨质疏松的治疗研究较少，此次研究提出以补充甲状腺素为基础，联合运动与维生素D3的综合治疗可以显著改善骨质疏松的症状，这项研究为临床上对亚临床甲减性骨质疏松患者的综合治疗提供了理论基础和思路。但是对于机制的阐述仍需进一步深化，对于联合治疗是如何抑制Cathepsin K表达的机制部分仍需作详细的实验研究，另外，大样本的临床前瞻性研究也需进一步开展。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：

亚临床甲减：是指轻度甲状腺功能衰竭的表现，其临床表现为促甲状腺激素(TSH)升高而游离的甲状腺激素T3、T4基本正常，是一种内分泌代谢性疾病，是甲状腺功能障碍的早期阶段。亚临床甲减是一种系统性疾病，可以引起机体各器官功能状态变化，包括引起骨密度降低、骨质疏松等。

抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRACP)：为最近发现的骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物，测定血清中抗酒石酸酸性磷酸酶尤其是抗酒石酸酸性磷酸酶5 b的浓度，有助于了解生理条件和各种病理条件下的骨代谢状况。抗酒石酸酸性磷酸酶缺乏和过度表达的大鼠模型分别表现为骨硬化和骨质疏松。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

维生素D具有抑制骨吸收，降低骨转换，从而增加骨密度以预防和治疗骨质疏松的作用，尤其是对于绝经后妇女的骨质疏松症状有明显的改善作用，维生素D是一种骨代谢调节剂，能促进肠道对于钙离子的吸收，维持骨钙内环境稳态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程#br#