持续负载压力对髓核细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2762

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (26): 4125-4128.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2762

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持续负载压力对髓核细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响

尹逊路^1，2，朱立国^1，3，冯敏山^1，3，于杰^1，2，展嘉文^1，2，梁龙^1，2，韩涛^1，2

¹中国中医科学院望京医院，北京市 100102；²中国中医科学院，北京市 100102；³中医正骨技术北京市重点实验室，北京市 100102

收稿日期:2019-08-08 修回日期:2019-08-10 接受日期:2019-10-29 出版日期:2020-09-18 发布日期:2020-08-31
通讯作者: 朱立国，博士，主任医师，中国中医科学院望京医院，北京市 100102；中医正骨技术北京市重点实验室，北京市 100102 冯敏山，博士，主任医师，中国中医科学院望京医院，北京市 100102；中医正骨技术北京市重点实验室，北京市 100102
作者简介:尹逊路，男，1988年生，2016年中国中医科学院望京医院毕业，博士，主治医师，主要从事脊柱及相关疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81804120)；国家自然科学基金(81774330)；国家中医药管理局专项课题(JDZX2015274)

Effect of continuous loading pressure on apoptosis and Wnt/beta-catenin signaling pathway in nucleus pulposus cells

Yin Xunlu^{1, 2}, Zhu Liguo^{1, 3}, Feng Minshan^{1, 3}, Yu Jie^{1, 2}, Zhan Jiawen^{1, 2}, Liang Long^{1, 2}, Han Tao^{1, 2}

¹Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China; ²China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China; ³Beijing Key Laboratory of Bone-Setting Technology of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102, China

Received:2019-08-08 Revised:2019-08-10 Accepted:2019-10-29 Online:2020-09-18 Published:2020-08-31
Contact: Zhu Liguo, MD, Chief physician, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China; Beijing Key Laboratory of Bone-Setting Technology of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102, China Feng Minshan, MD, Chief physician, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China; Beijing Key Laboratory of Bone-Setting Technology of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102, China
About author:Yin Xunlu, MD, Attending physician, Wangjing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China; China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81804120 and 81774330; the Special Project of State Administration of Traditional Chinese Medicine, No. JDZX2015274

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞凋亡：是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用；它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。髓核细胞的过度凋亡是导致椎间盘退变的重要因素。

Wnt信号传导途径：是由配体蛋白质Wnt和膜蛋白受体结合激发的一组多下游通道的信号转导途径，通过细胞表面受体胞内段的活化过程将细胞外信号传递到细胞内。Wnt家族分泌蛋白、Frizzled家族跨膜受体蛋白Dishevelled(Dsh)、糖原合成激酶3(GSK3)、APC、Axin、β-连环蛋白及TCF/LEF家族转录调节因子等构成了经典通路，即Wnt/β-catenin信号通路。

背景：课题组前期研究发现，持续负载压力可通过减少髓核细胞数量、降低髓核组织中细胞外基质的表达诱导椎间盘退变，但其作用机制尚不明确。

目的：探讨持续负载压力对髓核细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响。

方法：采用体外兔脊柱运动节段加载模型，将脊柱运动节段分为空白对照组、压力组和观察组，压力组给予3 kg持续负载压力，观察组给予3 kg持续负载压力及Wnt通路激活剂SB216763(20 μmol/L)，空白对照组不做任何处理；干预3 d后，采用苏木精-伊红染色观察髓核组织病理变化，Western blot法检测髓核组织中Caspase-3及GSK-3β蛋白表达量。

结果与结论：①与空白对照组相比，压力组Caspase-3、GSK-3β蛋白表达量显著增高(P < 0.05)；与压力组相比，观察组Caspase-3与GSK-3β蛋白表达量显著下降(P < 0.05)；②病理组织学显示，压力组髓核细胞数量减少，细胞形态改变；观察组髓核细胞数量相对较多，细胞形态相对规整；③结果表明，持续负载压力可通过介导Wnt/β-catenin信号通路调控Caspase-3、GSK-3β的表达，促进髓核细胞凋亡。

ORCID: 0000-0002-3388-4215(尹逊路)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 髓核细胞, 细胞凋亡, 持续负载压力, Wnt/β-catenin信号通路, 脊柱运动节段

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that continuous loading pressure can induce intervertebral disc

degeneration by reducing the number of nucleus pulposus cells and reducing the expression of extracellular matrix in the nucleus pulposus. However, its mechanism of action is unclear.

OBJECTIVE: To study the effect of continuous loading pressure on apoptosis and Wnt/β-catenin signaling pathway in nucleus pulposus cells.

METHODS: The in vitro models of rabbit spinal motion segment under loading pressure were established and divided into control group (no treatment), pressure group (3 kg continuous loading pressure) and observation group (3 kg continuous loading pressure + 20 μmol/L SB216763). After 3 days of intervention, the pathological changes of nucleus pulposus cells were detected by hematoxylin-eosin staining, and the expression of caspase-3 and GSK-3β protein in nucleus pulposus tissue was detected by western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the expression of Caspase-3 and GSK-3β protein increased significantly under the continuous load pressure (P < 0.05). Compared with the pressure group, the expression of Caspase-3 and GSK-3β protein decreased significantly in the observation group (P < 0.05). Pathological examination showed that the number of nucleus pulposus cells in the pressure group was reduced accompanied by morphological changes of the cells. In the observation group, the number of nucleus pulposus cells was relatively large and the cell morphology was relatively regular. In conclusion, continuous loading pressure can regulate Caspase-3 and GSK-3βexpression via Wnt/beta-catenin signaling pathway, and promote the apoptosis of nucleus pulposus cells.

Key words: nucleus pulposus cells, apoptosis, continuous loading pressure, Wnt/β-catenin signaling pathway, spinal motion segment

中图分类号:

尹逊路, 朱立国, 冯敏山, 于杰, 展嘉文, 梁龙, 韩涛.

持续负载压力对髓核细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号通路的影响 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4125-4128.

Yin Xunlu, Zhu Liguo, Feng Minshan, Yu Jie, Zhan Jiawen, Liang Long, Han Tao. Effect of continuous loading pressure on apoptosis and Wnt/beta-catenin signaling pathway in nucleus pulposus cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(26): 4125-4128.

图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计兔脊柱运动节段压力退变模型构建，随机对照实验。

1.2 时间及地点实验于2017年5月至2018年7月在中国中医科学院望京医院骨伤科研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 12周龄普通级新西兰大白兔3只，雌性1只，雄性2只，体质量2.5-3.0 kg，由北京市昌扬西山养殖场提供，动物合格证编号：SCXX(京)2016-0007。

1.3.2 实验试剂和仪器 DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；兔多克隆抗Caspase-3抗体(美国Abcam公司)；兔单克隆抗GSK-3β抗体(美国Abcam公司)；GAPDH单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(美国KPL公司)；Wnt通路激活剂(SB216763，美国Abcam公司)。CO₂细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；切片机(德国徕卡仪器有限公司)；电泳仪(北京六一仪器厂)；凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 兔脊柱运动节段获取腹腔注射7%水合氯醛 (5 mL/kg)全身麻醉后，耳缘静脉给予肝素钠(0.5 mL/kg)，5 min后空气栓塞处死；俯卧位固定，备皮，碘酒常规消毒；取腰部正中线纵向切口，依次切开筋膜、肌肉组织，取出腰段及下胸段脊柱，剔除附着的肌肉、韧带(前纵韧带、后纵韧带、黄韧带、棘间韧带)等软组织及椎弓等骨组织，仅保留椎体和椎间盘，PBS冲洗3次；对取出的脊柱节段定位，自软骨终板与椎体结合处做钝性分离，依次截取出完整的L_1/2、L_3/4、L_5/6脊柱运动节段；进一步清理脊柱运动节段表面，PBS、HBSS交替冲洗3次，置于含DMEM培养液的6孔板中保存备用。

1.4.2 兔脊柱运动节段加载模型构建在超净台内，采用带有顶丝的模块固定上述脊柱运动节段的上下椎体，置于培养皿中，并将其固定于装置的下平台处，于加载板处搁置3 kg砝码；脊柱运动节段离体加载和培养装置组装完毕后，在出液管处加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，使其液面与上位模块的下平面相平，夹住出液管，体外兔脊柱运动节段压力退变模型即构建成功，见图1。

1.4.3 实验分组及培养将上述兔脊柱运动节段加载模型随机分为空白对照组(n=3)、压力组(n=3)、观察组(n=3)，将其置于37 ℃、体积分数为5%CO₂培养箱中常规培养。压力组给予3 kg持续负载压力，观察组给予3 kg持续负载压力及Wnt通路激活剂SB216763(20 μmol/L)，空白对照组不做任何处理。每天换液1次，持续3 d。

1.4.4 病理学检测从兔脊柱运动节段加载模型中取出完整的椎间盘组织，采用40 g/L多聚甲醛固定7 d及10%EDTA脱钙3周后将其进行石蜡包埋，沿横断位切割椎间盘组织(厚度为4 μm)，常规苏木精-伊红染色，观察髓核组织及髓核细胞形态学变化。

1.4.5 Western blot方法检测Caspase-3、GSK-3β蛋白的表达在髓核组织样品中加入适量RIPA裂解液进行匀浆，冰上裂解30 min，提取总蛋白，BCA法测定蛋白样品浓度；将30 μg蛋白样品加到10% SDS-PAGE分离胶孔中电泳；凝胶转膜后于5%脱脂牛奶中封闭1 h，加入一抗(兔多克隆抗Caspase-3抗体、兔单克隆抗GSK-3β抗体、GAPDH单克隆抗体) 4 ℃反应过夜，洗膜后放入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗工作液中，室温孵育1 h；洗膜后曝光，采用UVP凝胶成像分析系统采集图像，ImageJ软件分析灰度值。

1.5 主要观察指标 ①椎间盘髓核组织病理变化；②髓核组织中Caspase-3、GSK-3β的表达。

1.6 统计学分析所有数据均以x(_)±s表示，采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。2组数据比较采用独立样本t检验；3组比较采用方差分析，方差齐时采用LSD分析法，方差不齐时采用Dunnett T3法；P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

椎间盘具有维持脊柱稳定性、减小缓冲力、均匀分配力等生物学特性^[14-17]。正常条件下，椎间盘遵循Wolff定律，即适当范围的力学刺激可提高细胞活性，降低应激反应，但异常力学刺激可抑制细胞活性、促进细胞凋亡^[14]。研究证实，长期异常应力刺激可通过影响椎间盘内营养供给、降低髓核细胞活性、减少细胞外基质分泌量、促进炎性因子释放等途径，加速髓核细胞的衰老、凋亡，导致椎间盘生理功能下降、形态结构改变，最终引发各类腰部疾病^[18-20]，但其具体发生机制仍不明确。

Wnt信号通路作为机体广泛存在、极度保守的传导通路，在人体发育过程中扮演了重要的角色。该通路参与调控细胞的增殖、迁移、分化、凋亡等生理病理环节，对机体的新陈代谢、生殖等生命活动也起着重要的调节作用^[21-22]。研究发现，经典Wnt/β-catenin信号通路是一条与力学因素相关的通路^[23]；在应力作用下，GSK-3β促进β-catenin的磷酸化，从而将β-catenin转变为无活性的、易于降解的P-β-catenin，导致胞浆内β-catenin水平降低，从而不能实现对核内Caspase等转录因子的调控；此外，GSK-3β活性上调可以进一步激活细胞凋亡相关蛋白激酶BAX、c-jun、Caspases家族等。Caspases家族属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，参与细胞凋亡的信号转导，作为特异的死亡信号转导分子，被认为是细胞死亡的执行者；Caspase-3是Caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶，通过特异性地裂解一套底物使细胞发生生化及形态学改变，最终导致细胞凋亡。该研究结果显示，相比于空白对照组，持续负载压力作用下Caspase-3与GSK-3β蛋白表达量显著增高；病理组织检查显示，压力组中髓核细胞数量减少，细胞形态改变，提示持续负载压力可通过促进Caspase-3、GSK-3β的表达诱导椎间盘细胞凋亡，促进椎间盘退变。

β-catenin/TCF为Wnt信号通路主要作用环节，该通路被激活后，可通过抑制GSK-3β对β-catenin的磷酸化过程，使β-catenin在胞质和细胞核内大量聚集，在核内形成β-catenin/TCF复合物，促进相关靶基因的表达^[24-26]。SB216763为Wnt/β-catenin信号通路常用的有效激活剂，其可通过下调GSK-3β表达^[27]，从而降低β-catenin磷酸化和细胞凋亡。该研究结果表明，相比于压力组，观察组Caspase-3与GSK-3β蛋白表达量显著下降；病理组织检查显示，观察组髓核细胞数量相对较多，细胞形态相对规整，提示持续负载压力可通过介导Wnt/β-catenin信号通路上调Caspase-3、GSK-3β的表达，促进细胞凋亡，影响椎间盘退行性变进程。

综上所述，持续负载压力可通过介导Wnt/β-catenin信号通路调控Caspase-3、GSK-3β的表达，促进髓核细胞凋亡。该研究为力学因素诱导椎间盘退行性变提供了一定的理论基础，但人体椎间盘退行性变的发生、发展是一个缓慢、多因素、长期共同作用的病理学结果，力学因素对椎间盘的作用是动态变化的，而该研究所采用动物模型为持续负载压力诱导的离体兔脊柱运动节段模型，未能实现周期性加载/卸载力学负荷，未来可进一步改良该模型，探讨动态负荷对椎间盘退行性变的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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