周期性张应力与软骨细胞基质金属蛋白酶的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.28.010

摘要/Abstract

摘要：

背景：课题组前期研究证实，在关节软骨缺损及骨性关节炎的动物模型中，软骨细胞可过度表达基质金属蛋白酶，各种异常刺激均可能打破基质金属蛋白酶与金属蛋白酶组织抑制因子间平衡，从而导致关节软骨细胞外基质退变，软骨细胞功能下降和失调。

目的：观察兔关节软骨缺损修复过程中周期性张应力对软骨细胞基质金属蛋白酶表达的影响。

方法：建立兔单侧膝关节软骨缺损模型，术后10周分离软骨细胞体外培养，非手术侧软骨细胞为正常组，术侧软骨细胞随机分为高应力组、低应力组及对照组，加载幅度为sin10%，0.1，1.0，0 Hz的周期性张应力，于24 h、48 h、1周、2周和4周后RT-PCR测定各组基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达。

结果与结论：加载周期性张应力24 h后，正常组及对照组间的基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达差异有显著性意义(P < 0.05)；加载周期性张应力1周、2周及4周后高应力组和低压力组间差异有显著性意义(P < 0.05)；同时发现，低应力组中基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达持续下降，加载周期性张应力24 h与4周之间的差异有显著性意义(P < 0.05)。可见力学载荷可影响兔关节软骨缺损修复过程中基质金属蛋白酶的表达，在细胞分子水平上，关节软骨缺损病理的发生发展与应力相互影响。

关键词: 组织构建, 软骨组织构建, 周期性张应力, 软骨细胞, 基质金属蛋白酶, 应力, 关节软骨缺损, 基质金属蛋白酶2, 基质金属蛋白酶3, 基质金属蛋白酶9, 基质金属蛋白酶13, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have confirmed that in the animal models of articular cartilage defects and osteoarthritis, the chondrocytes can overexpress the matrix metalloproteinases. Various abnormal stimuli are likely to break the balance between matrix metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase, thus leading to degeneration of extracellular matrix of articular cartilage, as well as the decline and offset of cartilage chondrocytes.

OBJECTIVE: To observe the effect of cyclic tensile strain on the expression of matrix metalloproteinases during the repairing process of rabbit articular cartilage defects.

METHODS: The animal models of articular cartilage defects were established, and chondrocytes were separated for culture at 10 weeks after operation. The chondrocytes on the non-surgical side were considered as the normal group, and the chondrocytes on the surgical side were randomly divided into high cyclic tensile strain group, low cyclic tensile strains group and control group, and the load amplitude was sin10%. Then 0.1, 1.0 and 0 Hz cyclic tensile strains were loaded respectively. The expressions of matrix metalloproteinases 2, 3, 9 and 13 in each group were detected with reverse transcription-PCR at 24, 48 hours, 1, 2 and 4 weeks after loading cyclic tensile strain.

RESULTS AND CONCLUSION: There were significant differences in the expressions of matrix metalloproteinases 2, 3, 9 and 13 at 24 hours after loading cyclic tensile strain between the normal group and the control group (P < 0.05); and there were significant differences in the expressions between the high cyclic tensile strain group and the low cyclic tensile strain group at 1, 2 and 4 weeks after loading cyclic tensile strain (P < 0.05). At the same time, the expressions of matrix metalloproteinases 2, 3, 9 and 13 in the low cyclic tensile strain group were continued to decline, and there were significant differences in the expressions after loading cyclic tensile strain for 24 hours and 4 weeks (P < 0.05). The results indicate that mechanical load can affect the expression of matrix metalloproteinases in the healing process of rabbit articular cartilage defects. In the cellular and molecular level, the incidence and development of pathological articular cartilage defect and stress should affect each other.

Key words: tissue construction, cartilage tissue construct, cyclical tensile strain, chondrocytes, matrix metalloproteinase, stress, articular cartilage defects, matrix metalloproteinase 2, matrix metalloproteinase 3, matrix metalloproteinase 9, matrix metalloproteinase 13, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年10月至2012年5月在中山大学附属第六医院实验室完成。

材料：

实验动物：6-8周龄新西兰白兔共24只，雌雄不限，体质量2.0-2.5 kg，购买于广东省医学实验动物中心。实验过程中动物处置符合动物伦理学标准。

力学加载及反转录-聚合酶链反应实验所需主要试剂和仪器：

实验方法：

兔关节软骨缺损动物造模：新西兰白兔24只，常规耳缘静脉注射戊巴比妥钠10 mg/kg麻醉后，随机切开并暴露一侧膝关节腔，于股骨内外髁之间制造全层关节软骨缺损(直径约3.5 mm，深约6 mm)达髓腔，注意防止钻孔过深，另一侧不予处理作为对照；术后实验兔予肌肉注射青霉素50×10⁴ U，不固定膝关节。术后4，6，8，12周分别取6只动物大体观察。

膝关节软骨细胞分离培养：术后10周使用空气栓塞处死实验兔，采用酶消化法分离获取膝关节软骨细胞。分别切取所有实验兔双侧膝关节表面软骨组织，切成约 1 mm³大小碎块，予D-Hank’s液冲洗，弃上清，称质量；予0.4%链霉蛋白酶12 mL/g软骨，37 ℃下CO₂培养箱中消化90 min，600 r/min离心5 min。弃上清，予0.025%Ⅱ型胶原酶12 mL/g软骨，37 ℃下CO₂培养箱中消化过夜，1 200 r/min离心10 min。弃上清，予D-Hank’s液冲洗，吸取细胞悬液，予100 μm及40 μm细胞筛网过滤至无菌培养瓶内，加入原代软骨细胞培养液37 ℃下CO₂培养箱中培养。

周期性张应力加载：膝关节缺损造模成功后，术侧软骨细胞随机分为3组：高应力组，低应力组及对照组，非术侧则为正常组，各组细胞均分别按照1×10⁵/cm² 密度接种于6孔BioFlex培养板，培养时间为60-72 h，当细胞融合达到75%-80%时，更换无血清培养液从而使细胞同步化，于12 h后加载周期性张应力：高应力组为幅度sin10%，1 Hz，低应力组为幅度sin10%，0.1 Hz，6 h/d，正常组及对照组(即0 Hz)则不予处理。

于加载周期性张应力后24 h、48 h，1周、2周和4周分装各板细胞于Eppendorf管，-20 ℃冻存以备检测。

RT-PCR测定基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达：于各时间点分别用Trizol试剂提取总RNA，并取1 μL RNA样品稀释50倍，Bio-Photometer plus艾本德核酸蛋白测定仪上测定吸光度值，同时与内参照GADPH一起扩增。各目的基因引物序列见表1；扩增条件为：95 ℃解链 1.5 min，55 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，循环40次。结束后分别检测基质金属蛋白酶2，3，9，13 mRNA的表达：取8 μL产物2%琼脂糖凝胶电泳，于紫外线下摄像。通过目的基因以及内参基因条带的积分吸光度比值来检测基因的表达水平。

主要观察指标：加载周期性张应力24 h、48 h、1周、2周和4周后RT-PCR测定各组基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达。

统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件进行分析。数据以x(_)±s形式表示，对各组检测结果的数据分别进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨是关节两端关节面上的有弹性的负重组织，其具有特殊的组织结构，并且具有特殊力学性能。正常成熟的关节软骨没有血管、淋巴管以及神经组织，主要营养来自滑液。软骨细胞在正常情况下不能进行有丝分裂，所以软骨缺乏有效的自身修复能力，其治疗比较困难且易导致明显的功能障碍。软骨由软骨细胞和基质组成，软骨细胞可分泌大分子基质如胶原纤维和蛋白多糖等，软骨细胞在体内主要通过扩散获取营养，其可以大批分离，具有较强的生命力，软骨细胞具有低耗氧量，这使其离体几天后仍能成活并进行繁殖。基质为软骨细胞提供营养和底物，同时可以使关节软骨富有弹性及一定的抗压性，对软骨细胞具有保护作用，能使软骨细胞免于损伤。软骨有两种生长方式，一种为间质生长，即软骨内生长，其能力非常有限；另一种为外加生长，通过软骨下骨或软骨膜下的细胞生长而形成，所以全层软骨损伤时可很快有纤维组织进而分化为类软骨组织。关节软骨在活动关节的表面，是复杂的生物复合材料，在负荷的传导和吸收上发挥着重要作用。正常的关节软骨根据其细胞和基质形态可分为4层(表层、移行层、中层和钙化层)，其层次变化与其力学特性相适应，其具有良好的抗压性能，富于弹性，其通过变形扩大关节的负重面来传递载荷并缓冲振荡。此外在关节面相对运动时，光滑的软骨表面能把摩擦和磨损降至最小限度，从而减少关节间的冲击，进而保护关节免受损伤^[3-5]。

随着社会的发展，各种原因导致的软骨缺损的发病率逐年上升，关节软骨因缺乏直接的血液供应、淋巴循环和神经支配，当外伤或疾病而发生缺损时通常自身修复能力有限或不能自行修复^[6-7]。关节创伤和关节疾病等均可导致关节软骨的缺损，临床上较为常见^[8]，在创伤、炎症等病因影响下，关节损伤后常常会引起关节功能障碍，导致骨关节炎的发生^[9]。软骨缺损病变过程的主要病理特征是软骨细胞凋亡及基质的破坏^[10]。有研究证实异常的应力刺激下，软骨细胞出现功能失调及下降，基质合成减少，引发关节退变^[11]。有研究证实软骨细胞和基质的结构和功能受温度、化学、pH值、生物、应力等多种因素影响^[12]。应力是软骨细胞所处的重要微环境之一，应力主要通过软骨细胞和基质内的力敏感细胞起作用^[13]。现临床上人们已将应力用于治疗骨折、关节软骨缺损、骨不连等，并取得一定疗效，说明应力可促进骨及软骨的再生^[14-15]。机械载荷对软骨结构、质量起重要调节作用，它能引起与骨生成有关的成骨、软骨以及骨细胞的反应^[16-17]，即应力可以促进骨生成相关细胞的增殖、增加生长因子的分泌以及促进细胞外基质的合成等。近年研究证明，细胞表面离子通道在细胞膜受到力学作用数秒或数分钟后可引起G蛋白活化、第二信使释放、蛋白质磷酸化、基因表达改变、细胞骨架变化、生长因子分泌、细胞和细胞外基质黏附重建等^[18-20]。在关节软骨缺损的发生和发展过程中，力学因素的作用不容忽视。有研究发现软骨胶原网中，基质分子遵循利于力学功能的原则在胶原网结构中沉积^[21]，这说明当力学信号的力学效应通过软骨细胞的某种途径进入细胞核中，再进一步调控各种相关基因表达，从而产生生物学效应，即力学信号-生物学信号-相关基因表达-生物学效应，见图3。

关节软骨缺损修复治疗是临床的重大难题之一，随着科学技术的发展，关于关节软骨缺损的修复取得了一定的进展，但尚无最佳治疗方法。目前临床上主要治疗方法包括软骨下骨钻孔、微骨折术、软骨镶嵌成形术、同种异体关节软骨移植等，上述方法均有其局限性^[22-27]。而随着软骨组织工程技术的发展，其为软骨缺损修复提供了新的思路^[28]。未来关于关节软骨缺损修复治疗的研究重点将是：①怎样通过控制软骨细胞生长微环境去调控软骨细胞的增殖分化及代谢。②采用软骨组织工程技术形成关节软骨复合物来产生具有机械应力的透明软骨组织，并提高该复合物与软骨缺损界面的黏合，达到理想的整合。由此可见探讨力学载荷在兔关节软骨缺损修复过程中的作用十分重要。基质金属蛋白酶是一类广泛存在于各结缔组织中的，在细胞外基质的生理及病理性降解中起重要作用的蛋白酶超家族。细胞外基质参与细胞的生长分化、细胞的增殖迁移和衰老、组织的发生发展等。基质金属蛋白酶过量分泌可以导致细胞外基质降解，其降解产生的片段对软骨细胞的代谢有重要影响^[29-30]。基质金属蛋白酶一般由5个功能不同的结构域组成，因其需要Ca²⁺、Zn²⁺等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，各种基质金属蛋白酶间具有一定的底物特异性，已知的基质金属蛋白酶现有26种，根据其蛋白构成以及作用底物的不同可分为5个亚型，其中基质金属蛋白酶2，3，9，13的水解底物均为纤维类胶原，并且它们是基质金属蛋白酶级联激活途径中的关键基质金属蛋白酶^[31]。力学载荷对关节软骨缺损的发生和发展有重要作用，持续被动运动经常用于限制关节炎症，但其机制并不清楚^[32]。有研究者将颞下颌关节软骨细胞置于不同作用时间的张应力时发现，白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶3，9，13 mRNA上调可被动态张应力所阻止^[33]，同时张应力也阻止了白细胞介素1β诱导的基质金属蛋白酶的蛋白质合成^[34]，高强度的周期性张应力则导致软骨基质中特殊蛋白成分的降低。软骨基质的转归受基质金属蛋白酶、金属蛋白酶组织抑制因子以及纤溶酶原激活系统如组织型纤溶酶原激活剂、尿激酶型纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活抑制剂的影响^[35-36]。有学者发现周期性张应力(10%，0.5 Hz)作用3 h时Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的合成反应形成一个起始高峰，12 h时表达降到对照水平，24 h后产生的基质金属蛋白酶1开始降解间质胶原以及其他软骨基质蛋白成分，这很可能意味着张应力导致了基质重塑及基质成分改变^[37]。基质金属蛋白酶在关节软骨缺损发生发展中的作用已被越来越多的学者接受，其是介导软骨破坏的重要因子^[38-42]。此外，有实验发现关节软骨在创伤后，基质金属蛋白酶13及组织特异性抑制剂1表达上调，共同作用促进了关节软骨退变，表明基质金属蛋白酶与组织特异性抑制剂在关节软骨缺损进展中密切相关^[43-45]。实验观察兔关节软骨缺损在修复过程中周期性张应力作用后基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达变化，其中基质金属蛋白酶13的变化尤为主要。研究表明除了基质金属蛋白酶13可以直接降解软骨基质中纤维类胶原外，其他基质金属蛋白酶亚型也需要通过基质金属蛋白酶13的作用对Ⅱ型胶原进行降解^[46]。因此，选择基质金属蛋白酶13作为软骨缺损和修复过程中的胶原酶指标，更能反映出软骨基质中纤维类胶原的代谢变化。受到力学刺激后，通过FAK/SOS/Ras等通道，软骨细胞膜表面的力感受器整合素可促进MAPKKK-MAPKK- MAPK的级联磷酸化。从中激活的p38 MAPK可进一步磷酸化作用底物，其底物再各自与特异性目标结合，从而引起细胞不同的病理或生理反应^[47]。如前所述，基质金属蛋白酶13在基质金属蛋白酶级联激活途径中极为关键^[48]，作者在前期研究中发现关节软骨缺损的动物模型中滑膜组织上的基质金属蛋白酶mRNA含量较正常滑膜明显增高，可以认为MAPK信号传导途径在此过程中作为基质金属蛋白酶上游事件起到了关键作用。实验通过在不同时间点检测各组基质金属蛋白酶2，3，9，13表达时发现，正常组及对照组间的基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达差异有显著性意义(P < 0.05)；加载周期性张应力1，2，4周后高应力组和低压力组间差异也有显著性意义(P < 0.05)，更值得一提的是，在低应力组中，基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达可随着时间推移而逐渐降低，这可能与软骨细胞中由炎症介质介导的Janus激酶通过磷酸化激活信号转导子以及转录激活子相关^[49]，从而最终使基质金属蛋白酶2，3，9，13的表达增加。此外，实验结果还表明在不同强度的应力载荷下，软骨细胞产生的生物学效应亦有差别。实验中加载周期性应力后基质金属蛋白酶2，3，9，13在高、低应力组的差异有显著性意义(P < 0.05)，表明基质金属蛋白酶2，3，9，13活化和表达随应力刺激增高而增多，而炎性因子的过度表达又可能通过促进MAPK的级联磷酸化过程来进一步激活p38 MAPK，或者通过其他不同的信号传导通路调控特定的基因表达，如上述的JAK磷酸化，最终导致软骨细胞的基质崩解，引发软骨细胞的凋亡^[50]。实验表明基质金属蛋白酶在关节软骨缺损后关节软骨的病理过程中发挥了重要作用。对基质金属蛋白酶的调控机制进行深入研究，可能有助于发现促进关节软骨缺损修复的方法，从而为临床治疗提供理论指导。众所周知，关节缺损一定时期后可出现关节的疼痛，甚至功能障碍，即形成骨性关节炎，其病理特点就是关节软骨的进行性破坏以及继发的骨改变，其发病机制涉及机械性因素，还有生物性因素等。实验证实，力学因素始终在软骨损伤等疾病的发生、发展和修复的过程中起着重要作用，其诱发的下游事件可诱导软骨细胞凋亡，从而导致软骨出现炎症、缺损等退行性变。为软骨细胞提供更合适的力学刺激可以通过抑制基质金属蛋白酶活化和表达来为关节软骨缺损提供良好的软骨细胞生长微环境，从而利于关节软骨缺损修复，进一步可延缓关节软骨的退行性变。