淫羊藿苷促进成骨细胞增殖分化的非核效应信号通路

doi:10.12307/2023.495

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (20): 3129-3135.doi: 10.12307/2023.495

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淫羊藿苷促进成骨细胞增殖分化的非核效应信号通路

梅杰1，2，何强1，3，孙欣1，尹宏1，钱卫庆1

1南京中医药大学附属南京中医院，江苏省南京市 210029；2山东省警官总医院，山东省济南市 250002；3山东中医药大学，山东省济南市 250355

收稿日期:2022-07-14 接受日期:2022-08-19 出版日期:2023-07-18 发布日期:2022-11-19
通讯作者: 钱卫庆，博士，硕士生导师，主任医师，南京中医药大学附属南京中医院，江苏省南京市 210029
作者简介:梅杰，女，1995年生，2021年南京中医药大学毕业，硕士，医师，主要从事中医药防治骨质疏松症方面的研究。何强，男，1993年生，在读博士，主要从事中医药防治骨质疏松症方面的研究。
基金资助:
南京市医学科技发展课题(YKK17148)，项目负责人：尹宏、钱卫庆

Icariin promotes osteoblast proliferation and differentiation through a non-nuclear signaling pathway

Mei Jie1, 2, He Qiang1, 3, Sun Xin1, Yin Hong1, Qian Weiqing1

1Nanjing Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; 2Shandong Police General Hospital, Jinan 250002, Shandong Province, China; 3Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China

Received:2022-07-14 Accepted:2022-08-19 Online:2023-07-18 Published:2022-11-19
Contact: Qian Weiqing, MD, Master’s supervisor, Chief physician, Nanjing Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
About author:Mei Jie, Master, Physician, Nanjing Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; Shandong Police General Hospital, Jinan 250002, Shandong Province, China He Qiang, MD candidate, Nanjing Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China; Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, Shandong Province, China
Supported by:
Nanjing Medical Science and Technology Development Project, No. YKK17148 (to YH and QWQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

淫羊藿苷：是中国传统补肾中药淫羊藿的主要活性成分，淫羊藿苷可以通过促进骨形成、抑制骨吸收，减少骨质的丢失，具有确切的防治骨质疏松作用。
非核效应：通常将直接调节基因转录的“基因组机制”称为“转录机制”或“核效应机制”，而不直接调节基因转录的“非基因组机制”则被称为“非转录机制”或“非核效应机制”。

背景：雌激素缺乏可抑制成骨细胞增殖、分化。传统补肾中药淫羊藿作为一种植物雌激素，其有效成分淫羊藿苷能够产生雌激素的部分效应。
目的：通过磷酸化蛋白组学技术探究淫羊藿苷非核效应促进成骨细胞增殖、分化过程中可能涉及的信号通路，以及信号通路中磷酸化蛋白级联调控的可能机制。
方法：通过新生SD大鼠获取原代成骨细胞并培养、鉴定，CCK-8法检测淫羊藿苷对成骨细胞活性的影响，合成并鉴定淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物。将原代成骨细胞传至第3代培养24 h后，分为6组：牛血清白蛋白干预组、PBS干预组、淫羊藿苷干预组、淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、雌激素受体拮抗剂ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、MAPK/ERK1/2通路抑制剂PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组，分别在作用0，5，15，25 min时收集各组细胞，进行蛋白提取、酶解、肽段标记和磷酸化肽段富集，利用液相色谱-质谱联用(LC/MS/MS)技术进行磷酸化蛋白组学分析。
结果与结论：①10 μg/L淫羊藿苷可显著促进成骨细胞的增殖、分化；②淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物能够不透膜而诱导成骨细胞内ERK的磷酸化，证实了非核效应；③磷酸化蛋白组学结果显示：与淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组相比较，淫羊藿苷干预组、牛血清白蛋白干预组、PBS干预组、ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组差异表达蛋白分别为971个(上调499个，下调472个)、974个(上调509个，下调465个)、836个(上调377个，下调459个)、231个(上调126个，下调105个)、150个(上调65个，下调85个)。其中，在加入抑制剂的ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组表达蛋白下调(Fc值< 0.8)的分别有65个、62个，大多参与mRNA的加工及稳定性调节、RNA剪接、蛋白质磷酸化、有丝分裂等重要生物学过程。通过KEGG分析，多集中在MAPK、蛋白质泛素化、mTOR、PI3K/Akt等信号通路；④结果证实了淫羊藿苷通过非核效应促进成骨细胞增殖、分化，与MAPK、蛋白质泛素化、mTOR、PI3K/Akt等信号通路相关。

https://orcid.org/0000-0003-1640-1776(何强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 淫羊藿苷, 成骨细胞, 增殖, 分化, 非核效应, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: Estrogen deficiency can inhibit osteoclast proliferation and differentiation. Epimedium is a phytoestrogen that acts as a traditional kidney tonic herb, and its active ingredient, icariin, can produce some effects of estrogen.
OBJECTIVE: To investigate the possible signaling pathways involved in the non-nuclear effects of icariin in promoting osteoblast proliferation and differentiation, as well as the possible mechanisms of phosphorylated protein cascade regulation in the signaling pathway by phosphorylated proteomics techniques.
METHODS: Primary osteoblasts were obtained from newborn Sprague-Dawley rats, cultured, and identified. The effect of icariin on osteoblast activity was measured by cell counting kit-8 method. The primary osteoblasts were passed to the third generation. After 24 hours, passaged cells were then divided into six groups: bovine serum albumin intervention group, PBS intervention group, icariin intervention group, icariin-bovine serum albumin coupling intervention group, ICI182780+icariin-bovine serum albumin coupling intervention group, and PD98059+icariin-bovine serum albumin coupling intervention group. The cells of each group were collected at 0, 5, 15 and 25 minutes and used for protein extraction, enzymatic digestion, peptide labeling and phosphorylated peptide enrichment. Phosphoproteomic analysis was performed using liquid chromatography-mass spectrometry technology
RESULTS AND CONCLUSION: 10 μg/L Icariin significantly promoted the proliferation and differentiation of osteoblasts. Icariin-bovine serum albumin coupling was able to induce phosphorylation of ERK in osteoblasts without membrane permeation, confirming the non-nuclear effect. Compared with the icariin-bovine serum albumin coupling intervention group, there were 971 differentially expressed proteins (499 up-regulated and 472 down-regulated) in the icariin intervention group, 974 (509 up-regulated and 465 down-regulated) in the bovine serum albumin intervention group, 836 (377 up-regulated and 459 down-regulated) in the PBS intervention group, 231 (126 up-regulated and 105 down-regulated) in the ICI182780+icariin-bovine serum albumin coupling intervention group, and 150 (65 up-regulated and 85 down-regulated ) in the PD98059+icariin-bovine serum albumin coupling intervention group. Among them, 65 and 62 significantly expressed proteins were down-regulated (Fc value < 0.8) in the ICI182780+icariin-bovine serum albumin coupling intervention group and PD98059+icariin-bovine serum albumin coupling intervention group, respectively, most of which were involved in important biological processes, such as mRNA processing and stability regulation, RNA splicing, protein phosphorylation, and mitosis, as well as in signaling pathways analyzed by KEGG library, such as MAPK, protein ubiquitination, mTOR, and PI3K/Akt pathways. To conclude, icariin promotes osteoblast proliferation and differentiation through non-nuclear effects in relation to MAPK, protein ubiquitination, mTOR, and PI3K/Akt signaling pathways.

Key words: icariin, osteoblast, proliferation, differentiation, non-nuclear effect, signaling pathway

中图分类号:

梅杰, 何强, 孙欣, 尹宏, 钱卫庆. 淫羊藿苷促进成骨细胞增殖分化的非核效应信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3129-3135.

Mei Jie, He Qiang, Sun Xin, Yin Hong, Qian Weiqing. Icariin promotes osteoblast proliferation and differentiation through a non-nuclear signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(20): 3129-3135.

图/表（结果） 6

2.1 成骨细胞培养及鉴定结果购买24 h内新生大鼠取其颅骨，通过酶消化法获取原代成骨细胞。显微镜下观察：培养2 d时，可见少量成骨细胞；培养约7 d时，可见成骨细胞数目增多并向四周伸展，形态呈多边形且可见卵圆形胞核；培养约15 d时，成骨细胞显著增多且如瓦片状重叠状生长，细胞于培养皿中心密集生长且具体形态难以看清。培养7 d时，碱性磷酸酶染色显示培养皿中所有细胞胞浆中出现褐色颗粒，褐色颗粒所在部位即为胞浆中碱性磷酸酶活性部位。见图1。

2.2 淫羊藿苷药物质量浓度筛选 CCK-8法检测结果可见：干预24，48，72 h 3个时间点，10，20 μg/L淫羊藿苷干预后成骨细胞的活性较对照组增多(P < 0.05)；在96 h时，各组成骨细胞活性无差异(P > 0.05)。各组不同质量浓度淫羊藿苷干预48 h后进行茜素红S染色，结果显示颗粒样结节区表现阳性反应，中央表现为深褐色，四周表现为橘红色，其中10 μg/L淫羊藿苷干预组颜色更为明显。见图2。

2.3 淫羊藿苷与牛血清白蛋白偶合、提纯及鉴定为了获取淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物，采用层析柱技术，见图3A，分别用编号为1-12的试管从色谱底部收集2 mL液体。在200-350 nm的波长范围内测定紫外可见光吸光度值，见表1。4号管中的样品显示出最高的紫外可见光吸光度值，尤其是在300-310 nm处，见图3B。由于在305 nm处观察到淫羊藿苷-牛血清白蛋白的强荧光发射峰，作者认为淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物主要集中在4号试管中，将其用于后续实验。用BCA法测定淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物蛋白标准曲线的紫外吸光度，见图3C，计算出淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物的质量浓度为60.5 μg/mL。

2.4 基于TMT标记定量磷酸化蛋白组分析在可信位点基础上，计算各组间的差异，用来评估各组间的表达水平变化倍数。差异筛选条件：Fold change=1.2倍，与淫羊藿苷-牛血清白蛋白相比较，淫羊藿苷组、牛血清白蛋白组、PBS组、ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白组及PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白组差异表达蛋白分别为971个(上调499个，下调472个)、974个(上调509个，下调465个)、836个(上调377个，下调459个)、231个(上调126个，下调105个)、150个(上调65个，下调85个)。其中，ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白组及PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白组表达下调蛋白中Fc值< 0.8的分别有65个、62个，大多参与mRNA的加工及稳定性调节、RNA剪接、蛋白质磷酸化、有丝分裂等重要生物学过程，见图4。

对鉴定到的磷酸化位点对应的蛋白，基于GO数据库(http://www.geneontology.org/)提取各注释信息，挖掘蛋白功能。选取GO富集分析Top30(筛选3种分类中对应蛋白数目大于1的GO条目，按照每个条目对应的-log10P值由大到小排序的各10条)，见图5A，图中X坐标为GO条目名称，Y坐标为对应条目的蛋白数量和其百分比。这些蛋白主要在7种生物学过程中发挥作用，包括mRNA加工、RNA剪接、核小体组装、翻译起始、翻译的正负调控、mRNA稳定性调节、细胞对热量的反应等；8种细胞组分被包含其中，包括细胞核、核仁、肌动蛋白细胞骨架、催化步骤2剪接体、一种含boxC/DsnoRNP的核糖核蛋白复合物、伴侣复合体、含蛋白质复合物、黏附连接等；与14类分子功能紧密相关，包括RNA结合、mRNA结合、激酶结合、核小体DNA结合、组蛋白甲基转移酶结合、dATP结合、ATP结合、蛋白质结构域特异性结合、肌动蛋白丝结合、组蛋白结合、相同蛋白质结合、染色质结合、支架蛋白结合、GTP酶结合。
KEGG是系统分析蛋白质在细胞中代谢途径的主要公共数据库。利用KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)对蛋白进行Pathway分析(结合KEGG注释结果)，并用超几何分布检验的方法计算每个Pathway条目中蛋白富集的显著性并用P值来表示。KEGG富集分析Top20(按照每个条目对应的-log10P值由大到小排序)气泡图见图5B，图中X轴Enrichment Score为富集分值，Y轴为top20的pathway通路信息。气泡越大的条目包含的差异位点对应蛋白数目越多，气泡颜色由红-绿-蓝-紫变化，其富集P值越小，显著程度越大。结果显示：淫羊藿苷-牛血清白蛋白组和牛血清白蛋白组中差异蛋白多集中在RNA转运、剪切体等信号通路，且差异程度较大。淫羊藿苷-牛血清白蛋白组和PBS组中差异蛋白多集中在RNA转运、剪切体等信号通路，且差异程度较大。ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白组和淫羊藿苷-牛血清白蛋白组中差异蛋白多集中在自噬、mTOR等信号通路，且差异程度较大。淫羊藿苷-牛血清白蛋白组和淫羊藿苷组中差异蛋白多集中在RNA转运、剪切体、紧密连接等信号通路，且差异程度较大。PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白组和淫羊藿苷-牛血清白蛋白组中差异蛋白多集中在间隙连接、癌症蛋白聚糖等信号通路，其中差异程度较大的是间隙连接信号通路。淫羊藿苷-牛血清白蛋白组和淫羊藿苷组中差异蛋白多集中在RNA转运、黏附斑等信号通路，且差异程度较大。

参考文献

[1] 王昌军,尹宏.肌肉组织和脂肪组织对绝经后女性骨密度及骨强度的影响及作用机制[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(10):1502-1508.
[2] REID IR, BILLINGTON EO. Drug therapy for osteoporosis in older adults. Lancet. 2022;399(10329):1080-1092.
[3] 刘畅畅,尹宏,段光宇,等.老年女性髋部骨折与DXA骨强度参数的相关性研究[J].中国骨质疏松杂志,2018,24(1):83-86,90.
[4] 杨柳,尹宏.连接蛋白43介导机械应力刺激下骨重建的研究进展[J].广东医学,2015,36(19):3075-3077.
[5] FISCHER V, HAFFNER-LUNTZER M. Interaction between bone and immune cells: Implications for postmenopausal osteoporosis. Semin Cell Dev Biol. 2022;123:14-21.
[6] 杨柳,尹宏.淫羊藿对破骨细胞骨吸收功能及机制研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2015,17(7):117-120.
[7] LIU LL, LIU GW, LIU H, et al. Iron accumulation deteriorated bone loss in estrogen-deficient rats. J Orthop Surg Res. 2021;16(1):525.
[8] KIM HJ, LEE J, LEE GR, et al. Flunarizine inhibits osteoclastogenesis by regulating calcium signaling and promotes osteogenesis. J Cell Physiol. 2021;236(12):8239-8252.
[9] 熊梦欣,向楠,薛瑶珺,等.基于“肾痰”认识骨-脂代谢异常失衡在绝经后骨质疏松症发病中的作用[J].中国骨质疏松杂志,2022, 28(3):455-459.
[10] 谢兴文,钟建春,李鼎鹏,等.薯蓣皂苷防治原发性骨质疏松的研究进展[J].基础医学与临床,2022,42(6):960-963.
[11] 王勇,黄永松,李冬春,等.补肾健骨汤对去卵巢大鼠股骨颈骨小梁微血管和骨密度的影响[J].湖南中医药大学学报,2016,36(5):14-17.
[12] 孙海涛,丁仁,尹宏,等.淫羊藿对体外培养成骨细胞影响的研究进展[J].医学综述,2010,16(24):3696-3699.
[13] 钱卫庆,尹宏,孙海涛.不同浓度淫羊藿苷对大鼠成骨细胞增殖、分化的影响[J].中国医药导报,2011,8(36):23-25.
[14] 姚年伟,何强,刘易昕,等.不同浓度淫羊藿苷对胎鼠成骨细胞炎性反应的保护作用研究[J].海南医学院学报,2020,26(23):1775-1779.
[15] 钱卫庆.淫羊藿苷促成骨细胞增殖中非核效应及机制研究[D].苏州:苏州大学,2016.
[16] 何强,钱卫庆,姚年伟,等.地黄梓醇对新生大鼠炎性成骨细胞的保护作用[J].中国组织工程研究,2020,24(29):4626-4631.
[17] BOUTET E, LIEBERHERR D, TOGNOLLI M, et al. UniProtKB/Swiss-Prot, the Manually Annotated Section of the UniProt KnowledgeBase: How to Use the Entry View. Methods Mol Biol. 2016;1374:23-54.
[18] 邹世恩,张绍芬.雌激素对成骨细胞和破骨细胞凋亡的调节机制[J].现代妇产科进展,2006,15(7):547-548,551.
[19] JI L, LI X, HE S, et al. Regulation of osteoclast-mediated bone resorption by microRNA. Cell Mol Life Sci. 2022;79(6):287.
[20] 任明诗,丁羽,李子涵,等.成骨细胞与破骨细胞相互调节作用的研究进展[J].中国药理学通报,2022,38(6):822-827.
[21] ZHANG Y, YANG M, ZHANG S, et al. BHLHE40 promotes osteoclastogenesis and abnormal bone resorption via c-Fos/NFATc1. Cell Biosci. 2022;12(1):70.
[22] REN R, GUO J, CHEN Y, et al. The role of Ca2+ /Calcineurin/NFAT signalling pathway in osteoblastogenesis. Cell Prolif. 2021;54(11): e13122.
[23] 刘易昕,何强,张大鹏,等.大鼠骨质疏松模型的建立及其骨髓间充质干细胞内差异lncRNA初步分析[J].南京医科大学学报(自然科学版),2022,42(1):30-34,46.
[24] BATTAGLIONI S, BENJAMIN D, WÄLCHLI M, et al. mTOR substrate phosphorylation in growth control. Cell. 2022; 185(11):1814-1836.
[25] ZHANG B, SHAO L, WANG J, et al. Phosphorylation of ATG18a by BAK1 suppresses autophagy and attenuates plant resistance against necrotrophic pathogens. Autophagy. 2021;17(9):2093-2110.
[26] 唐星冉,周惠芳,冯华,等.基于MAPKs信号通路探讨补肾助孕方改善BN大鼠黄体功能的作用机制[J].中国实验方剂学杂志, 2022,28(12):78-85.
[27] 徐小梦,康迪,朱新宇,等.基于IRAK4/ERK/p38信号通路雷公藤红素对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的影响[J].中国实验血液学杂志,2022,30(1):175-182.
[28] Kumar R, Theiss AL, Venuprasad K. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 2021; 42(11): 1037-1050.
[29] WANG X, QIU T, WU Y, et al. Arginine methyltransferase PRMT5 methylates and stabilizes KLF5 via decreasing its phosphorylation and ubiquitination to promote basal-like breast cancer. Cell Death Differ. 2021;28(10):2931-2945.
[30] ZHU G, HERLYN M, YANG X. TRIM15 and CYLD regulate ERK activation via lysine-63-linked polyubiquitination. Nat Cell Biol. 2021;23(9):978-991.
[31] 王爱飞,吴加东,徐又佳.铁蓄积通过mTOR信号通路影响小鼠骨形成与血管生成偶联的实验研究[J].中华内分泌代谢杂志,2022, 38(1):68-79.
[32] 林乔,周钢,黎靖毅,等.低强度脉冲超声通过PIEZO1/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进成骨细胞增殖的研究[J].中国骨质疏松杂志, 2021,27(12):1800-1803,1826.
[33] LI C, YANG P, LIU B, et al. Prednisolone induces osteocytes apoptosis by promoting Notum expression and inhibiting PI3K/AKT/GSK3β/β-catenin pathway. J Mol Histol. 2021;52(5):1081-1095.
[34] FISCHER S, NASYROV E, BROSIEN M, et al. Self-extracellular RNA promotes pro-inflammatory response of astrocytes to exogenous and endogenous danger signals. J Neuroinflammation. 2021;18(1):252.
[35] 姜涛,凌翠敏,陈庆真,等.淫羊藿苷通过提高自噬促进成骨细胞分化防治骨质疏松[J].中国组织工程研究,2021,25(17):2643-2649.
[36] 明磊国,陈克明,葛宝丰,等.淫羊藿苷与染料木黄酮对体外培养成骨细胞增殖及矿化成熟影响的对比研究[J].中国中药杂志,2011,36(16):2240-2245.

引言

骨质疏松症是一种进行性骨骼疾病，其特征是骨密度和质量下降、骨微观结构破坏及骨脆性增加[1-2]。对于女性来说，由雌激素缺乏引起的绝经后骨质疏松症是最常见的类型，大约50%的女性在绝经后至少发生过一次骨折[3]。绝经后雌激素水平下降可以导致骨形成和骨吸收之间的平衡改变，主要由于雌激素可直接对骨细胞产生影响[4-5]。雌激素可促进间充质干细胞成骨分化和成骨细胞的成熟，从而促进骨形成；此外，雌激素抑制破骨细胞的形成并诱导破骨细胞凋亡，从而限制骨吸收[6]。当女性体内雌激素不足时，这些骨合成代谢和抗破骨细胞作用降低，导致持续的骨质破坏[7]。目前，临床治疗药物通常用于恢复骨强度，例如骨硬化蛋白单克隆抗体、双膦酸盐类和选择性雌激素受体调节剂等，但这些药物存在着价格高、不良反应等不足[8]。中医药在中国应用千年，现代药理学研究进一步证实了中医药治疗骨质疏松症的有效性和安全性[9-11]。
淫羊藿苷是传统补肾中药淫羊藿的主要活性成分。作者前期研究已证实：①淫羊藿苷可以透膜促成骨细胞增殖、分化[12-13]；②淫羊藿苷能通过非核效应途径对成骨细胞产生促增殖作用，可能与ERK信号通路有关[14-15]。作者前期研究已经证实了淫羊藿苷促成骨细胞增殖的非核效应，且膜雌激素受体及ERK信号通路在此过程中发挥着重要作用。但该非核效应是仅仅受单一信号通路的介导还是多种信号通路的共同作用结果？整个信号通路中涉及哪些重要靶蛋白？前期研究并未做出深入探讨。为了深入了解淫羊藿苷促成骨细胞增殖、分化的作用机制，故进行此次研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外原代细胞实验，组间比较采用单因素方差分析和t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年6月至2021年5月在南京中医药大学附属南京中医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 15只新生SD大鼠(24 h以内)购于南京医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(苏)2016-0006，操作者已取得江苏省实验动物证。实验方案经南京中医药大学附属南京中医院伦理委员会批准，批准号为A2019-08-002。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 仪器与试剂倒置生物显微镜(奥林巴斯CX41)；全波长酶标仪(EPOCH)；Q Exactive质谱仪(Thermo Fisher)；Easy-nLC 1200液相系统(Thermo Fisher)；高pH分离液相色谱仪(Agilent)；超声破碎仪(宁波新芝，SCIENTZ-II D)；凝胶成像仪(天能，Tanon 1600)；台式冷冻离心机(上海卢湘仪，TGL-16A)；淫羊藿苷(大连美伦，批号J0520A5)；CCK-8(南京恒博，批号:#46255)；Ⅱ型胶原蛋白酶(南京恒博，批号EZ4567A109)；0.25%胰蛋白酶(南京恒博，批号2120917)；MAPK/ERK1/2通路抑制剂PD98059(上海百奥泰，批号HY12028)；雌激素受体拮抗剂ICI182780 (大连美伦，批号HY13636)；TMT10标记试剂盒(Thermo Scientific，批号90111LCS)；iTRAQ标记试剂盒(ABSCIEX，批号4381663)；SDS裂解液(碧云天，批号P0013G)；BCA试剂盒(Thermo
Scientific，批号23227)。
1.4 方法
1.4.1 成骨细胞培养、鉴定(详见课题组前期实验) [13-16] 将新生SD大鼠浸泡于乙醇中致死后取颅骨，0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型胶原蛋白酶联合的二次酶消化法对新生SD大鼠成骨细胞进行原代提取、培养、传代。选择第3代成骨细胞通过观察形态、碱性磷酸酶染色法鉴定。
1.4.2 淫羊藿苷药物浓度筛选(详见课题组前期实验) [13-15] 将对数生长期第3代成骨细胞以5×107 L-1细胞浓度接种至6孔培养板，每孔3 mL，分别给予0，10，20 μg/L淫羊藿苷干预24，48，72，96 h后，CCK-8法检测细胞活性，细胞存活率=(实验孔吸光度值-空白孔吸光度值)/(对照孔吸光度值-空白孔吸光度值)，筛选淫羊藿苷药物质量浓度。不同质量浓度淫羊藿苷干预48 h后成骨细胞进行茜素红S染色。
1.4.3 淫羊藿苷与牛血清白蛋白偶合、提纯及鉴定(详见课题组前期基础) [15] 将100 μL 5×105 mol/L 牛血清白蛋白溶液、100 μL 5×105 mol/L淫羊藿苷溶液、1 mL 0.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH=7.40)和800 μL 0.5 mol/L NaCl溶液加去离子水定容至4 mL。将混合溶液分别置于17 ℃，27 ℃，37 ℃水浴各10 min。在96孔板上取4个孔，第1个孔为空白对照，第2个孔加入200 μL 1.25×106 mol/L淫羊藿苷溶液，第3个孔加入200 μL 1.25×106 mol/L牛血清白蛋白溶液，第4个孔加入上一步所得200 μL淫羊藿苷与牛血清白蛋白混合溶液。将96孔板放置于酶标仪上以200-500 nm波长(步长为10 nm)进行光谱扫描，测吸光度值。对于每个实验溶液，制备一式3份，取其平均值绘制吸光度曲线，以确定是否形成淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物。用Sephadex G-25色谱柱(中国盛兴生物技术有限公司)对淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物进行纯化，最后用BCA法测定(参考BCA说明书进行)。
1.4.4 分组及处理[14，16] 在原代成骨细胞传代24 h后，将培养的细胞分为6组：牛血清白蛋白(BSA)干预组、PBS干预组、淫羊藿苷(ICA)干预组、淫羊藿苷-牛血清白蛋白(ICA-BSA)
偶合物干预组、ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组、PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组。各组淫羊藿苷和牛血清白蛋白的质量浓度均为10 μg/L，在抑制剂干预的组别中，加入淫羊藿苷和淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物之前1 h分别加入终浓度为50 μmol/L的PD98059以及终浓度为1 μmol/L的ICI182780预处理1 h。
1.4.5 基于TMT标记定量磷酸化蛋白组学分析 TMT标记检测6组细胞的蛋白质组变化。实验由上海华盈生物医学科技有限公司(上海，中国)按照之前的研究进行。蛋白质样品从细胞中分离出来，用胰蛋白酶消化成蛋白水解肽。然后用200 μL 100 mmol/L四乙基溴化铵试剂标记蛋白水解肽，100 µL磷酸化肽富集液loading buffer(含2%三氟乙酰基和60%乙腈的谷氨酸饱和溶液)溶解样品，液相色谱质谱联合进行鉴定和定量。差异磷酸化位点对应蛋白进行GO(function)/KEGG(pathway)富集分析，方法如下[17]：6组细胞蛋白作为背景列表，差异磷酸化位点对应蛋白作为从背景列表中筛选出来的候选列表，利用超几何分布检验计算功能集在蛋白列表中是否显著富集的P值，再对P值经Benjamini & Hochberg 多重检验纠正后得到错误发现率(FDR)，再通过R语言等进行分析构图。
1.5 主要观察指标 ①成骨细胞培养及鉴定结果；②不同质量浓度淫羊藿苷对成骨细胞增殖的影响；③淫羊藿苷与牛血清白蛋白偶联、提纯及鉴定结果；④通过TMT标记定量磷酸化蛋白组学技术分析各组细胞蛋白质组变化。
1.6 统计学分析实验数据导入MaxQuant进行搜库，肽段鉴定的假阳性率控制在1%以下。其余采用GraphPad Prism5.0统计软件进行实验数据的分析处理，数据以x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析和t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过南京中医药大学附属南京中医院大数据中心统计学组专家审核。

讨论

骨质疏松症的特征是骨量低和髓腔扩张，即使是轻微的撞击也会导致手腕、脊椎和髋部骨折。雌激素等激素的缺乏(其中1个因素)是50岁以上绝经后妇女骨质疏松的主要诱因，因为据报道，雌激素可以减少破骨细胞的形成并促进破骨细胞的凋亡[18]。骨内稳态同时受到成骨细胞和破骨细胞的调节[19-20]。破骨细胞介导的骨吸收过程导致骨破坏后，来自间充质干细胞的成骨细胞覆盖骨外表面，释放有机基质、酶、生长因子和激素，形成新的成熟骨[21]。在成骨细胞的重组和矿化过程中，各种细胞机制负责骨合成，包括骨形态发生蛋白2信号通路、Notch信号通路、Wnt信号通路和转化生长因子β信号通路[22-23]。因此，通过调控雌激素来促进成骨细胞增殖、分化很可能成为骨丢失的治疗靶点。
作者前期研究证实：10 ng/mL淫羊藿苷能快速促进SD大鼠成骨细胞的增殖和分化，并证实了非核效应的存在，且膜雌激素受体及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路在此过程中发挥着重要作用。植物雌激素是从植物中提取的具有类似雌激素结构同时具有雌激素样作用的一系列化合物。近年来研究显示以淫羊藿苷为代表的异黄酮类植物雌激素与雌激素在结构上具有相似性，是其能够产生雌激素效应的关键所在。
此次，作者研究淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶联物对成骨细胞增殖、分化的影响，并设置干预抑制剂ICI182780及PD98059组，通过TMT标记定量磷酸化蛋白组分析进一步研究淫羊藿苷对成骨细胞非核效应中磷酸化调控的机制。结果显示：ICI182780+淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组和淫羊藿苷-牛血清白蛋白偶合物干预组差异表达蛋白为231个(上调126个，下调105个)，其中下调(Fc值< 0.8)的有65个，这些蛋白多参与mRNA的加工及稳定性调节、RNA剪接、蛋白质磷酸化、有丝分裂等重要生物学过程，其中差异较大的血浆胆固醇酯转移蛋白(cholesteryl ester transfer protein，C0JPT7)、波形蛋白(vimentin，VIME)被鉴定到有多个位点的磷酸化发生变化，C0JPT7、VIME在细胞的增殖过程中发挥着重要的作用[19-20]；PD98059+淫羊藿苷-牛血清白蛋白组和淫羊藿苷-牛血清白蛋白组的差异表达蛋白为150个(上调65个，下调85个)，其中下调(Fc值< 0.8)的有62个，这些蛋白多参与mRNA的加工、细胞内的信号转导、蛋白质的磷酸化等重要生物过程，其中差异较大的C0JPT7、载脂蛋白A1L1M0、抗细胞凋亡基因D4A8D5被鉴定到有多个位点的磷酸化发生变化，A1L1M0蛋白参与mRNA的加工、丝氨酸及苏氨酸的磷酸化等重要生理过程，且可促进成骨细胞的分化[24]；D4A8D5对RNA聚合酶Ⅰ、Ⅲ指导的基因转录、细胞增殖、迁移和侵袭起着正调控作用[25]。
在此次研究中，与淫羊藿苷-牛血清白蛋白组相比，在加入ICI182780和PD98059后，其下调的磷酸化蛋白通过KEGG库分析，多集中在MAPK、蛋白质泛素化、mTOR、PI3K/Akt等信号通路。MAPK信号通路有4种主要的分支路线[26]：ERK、JNK、p38/MAPK和ERK5，其中ERK主要调节细胞的生长、分化[27]；蛋白质泛素化途径是细胞内极其重要的一个翻译后修饰途径，在细胞的各种生理活动中发挥作用。细胞内最典型的泛素化修饰主要包括单泛素化、K48链泛素化、K63链泛素化[28]。单泛素化、K63链泛素化则在多种生理过程中发挥作用，包括DNA修复、胞吞作用、蛋白间的相互作用、蛋白转运等[29-30]；mTOR信号通路主要调节细胞的增殖与分化，有调节生长因子、氧化等细胞传感器的作用[31]；PI3K/Akt信号通路与干细胞的自我更新和多向分化潜能有着密切关系，在骨骼系统它调控着成骨细胞和破骨细胞的增殖、分化及凋亡，并且与多条信号之间存在着相互联系[32-33]。
近年来，越来越多的研究显示，雌激素可以在几分钟内激活细胞信号转导途径，在细胞内产生一系列快速反应，这些生物效应包括第二信使的产生、离子通道状态的变化以及蛋白激酶变化等，这种快速生物学效应有别于之前的“核效应”，后来被称为“非核效应”或“快速反应”[34]。在此之前的研究证明，淫羊藿苷的非核效应与MAPK信号通路有着紧密的联系。经过此次研究分析得知，这种效应可能不仅只由MAPK信号通路所介导，还与蛋白质泛素化、mTOR、PI3K/Akt等信号通路有着重要的关系。
淫羊藿苷可促进成骨细胞的增殖、分化已被实验所证实[35-36]，大量报道淫羊藿及其有效成分能促进成骨细胞、骨髓间充质干细胞的增殖与分化，同时发现相关信号通路在其促增殖分化过程中发挥重要调控作用，但具体作用机制目前仍不明确。因此，深入探讨淫羊藿及其有效成分的多通路分子生物学机制，对指导淫羊藿在骨质疏松临床治疗上的应用具有重要意义。为了进一步阐明淫羊藿促进神经再生的多靶点和多环节的生物学机制，提高淫羊藿防治骨质疏松症的潜在应用价值，今后会继续完善相关信号通路的研究，揭示各大通路间的复杂关系，为淫羊藿应用于骨质疏松症治疗提供可靠科学依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

淫羊藿苷促进成骨细胞增殖分化的非核效应信号通路

Icariin promotes osteoblast proliferation and differentiation through a non-nuclear signaling pathway

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[1]	贺茜, 万瑀, 唐玉婷, 杨安宁, 吴凯, 焦运, 白志刚, 姜怡邓, 沈江涌. 铁死亡诱导剂抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-.
[2]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[3]	杨芷姗, 唐正龙. Hippo信号通路中的核心因子YAP/TAZ参与骨形成的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1264-1271.
[4]	龙桂月, 李冬冬, 廖红兵. 磷酸钙骨水泥/聚乳酸羟基乙酸降解产物促进小鼠单核细胞破骨向分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1193-1198.
[5]	赵璐, 赵逸菲, 高达, 刘艳芳, 付婷婷, 徐江雁. Zeste基因抑制子基因12在糖尿病肾脏病模型大鼠肾组织中的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1179-1186.
[6]	柳晓琳, 穆新月, 马子雨, 刘树泰, 王文龙, 韩晓谦, 董志恒. 水凝胶复合载辛伐他汀蛋白微球对成骨细胞增殖分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(7): 998-1003.
[7]	刘文涛, 冯兴超, 杨毅, 白生宾. M2型巨噬细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 840-845.
[8]	龙燕鸣, 谢梦生, 黄加洁, 薛文利, 荣慧, 李晓捷. 酪蛋白激酶2相互作用蛋白1调控骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 878-882.
[9]	李欣悦, 李熙恒, 毛天娇, 唐亮, 李江. 三维培养人牙周膜干细胞的形态、活性及成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 846-852.
[10]	袁维, 刘静东, 徐广辉, 康健, 李富平, 王英杰, 支中正, 李冠武. 人血管周围干细胞成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的调控[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 866-871.
[11]	乔鲁卉, 马子雨, 郭浩宇, 侯玉东. 葛根素与淫羊藿苷对小鼠前成骨细胞生物学性能影响的比较[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 872-877.
[12]	郝柳芳, 段红梅, 王子珏, 郝飞, 郝鹏, 赵文, 高钰丹, 杨朝阳, 李晓光. 转基因小鼠脊髓损伤后室管膜细胞的时空动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 883-889.
[13]	袁博, 谢利德, 付秀美. 许旺细胞源性外泌体促进损伤周围神经的修复与再生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 935-940.
[14]	王金玲, 黄夏荣, 屈萌艰, 黄福锦, 尹林伟, 钟培瑞, 刘静, 孙光华, 廖阳, 周君. 运动训练老年骨质疏松大鼠骨量及骨微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 676-682.
[15]	伍宇婕, 晚晓芳, 魏绵兴, 彭世元, 徐晓梅. 正畸牙移动模型小鼠压力侧牙周膜细胞自噬与Hippo-Yes相关蛋白通路的关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 683-689.