解整合素金属蛋白酶10与激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

doi:10.12307/2023.369

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (10): 1507-1513.doi: 10.12307/2023.369

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解整合素金属蛋白酶10与激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

樊俊1，吴陈欢2，程中华2

1长江大学，湖北省荆州市 434023；2长江大学附属黄冈市中心医院骨科II，湖北省黄冈市 438000

收稿日期:2022-04-13 接受日期:2022-06-27 出版日期:2023-04-08 发布日期:2022-09-06
通讯作者: 程中华，硕士，主任医师，长江大学附属黄冈市中心医院骨科II，湖北省黄冈市 438000
作者简介:樊俊，男，1991年生，湖北省黄冈市人，汉族，长江大学在读硕士，主要从事骨与关节损伤方向的研究。
基金资助:
湖北省自然科学基金(s2015-01-01330084)，项目负责人：程中华

Effect of a disintegrin and metalloproteases 10 on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by steroid-induced osteonecrosis of femoral head

Fan Jun1, Wu Chenhuan2, Cheng Zhonghua2

1Yangtze University, Jingzhou 434023, Hubei Province, China; 2Department of Orthopedics II, Huanggang Central Hospital Affiliated to Yangtze University, Huanggang 438000, Hubei Province, China

Received:2022-04-13 Accepted:2022-06-27 Online:2023-04-08 Published:2022-09-06
Contact: Cheng Zhonghua, Master, Chief physician, Department of Orthopedics II, Huanggang Central Hospital Affiliated to Yangtze University, Huanggang 438000, Hubei Province, China
About author:Fan Jun, Master candidate, Yangtze University, Jingzhou 434023, Hubei Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Hubei Province, No. s2015-01-01330084 (to CZH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
解整合素金属蛋白酶10：由金属蛋白酶、富含半胱氨酸、分解素和表皮生长因子样结构域组成的模块蛋白，可参与多种生物学功能，包括炎症、凋亡、细胞黏附、细胞代谢、肿瘤转移和自身免疫等。
激素性股骨头坏死：长时间或大量使用激素可导致局部骨内压力增加、血液循环紊乱，从而引起骨细胞进一步缺血、坏死和骨小梁断裂，最终导致股骨头塌陷的一类骨骼疾病。

背景：众多研究发现，激素性股骨头坏死的病理进展与骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化异常有关，其中解整合素金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteases 10，ADAM10)高度参与此过程，但具体作用机制尚不清楚。
目的：探讨ADAM10对激素性股骨头坏死患者来源骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响及其可能机制。
方法：选择23例激素性股骨头坏死患者和17例股骨颈骨折患者，于术中无菌条件下取股骨近端骨髓，采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，分别得到激素性股骨头坏死患者来源骨髓间充质干细胞(S-BMSCs)和股骨颈骨折患者来源骨髓间充质干细胞(F-BMSCs)，体外培养至第3代，采用CCK-8检测两组细胞增殖活性；茜素红染色和碱性磷酸酶染色观察两组细胞成骨分化能力；qRT-PCR和Western blot检测两组细胞中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平。采用ADAM10过表达载体慢病毒感染S-BMSCs，再联合Notch信号通路抑制剂DAPT进行处理，CCK-8检测细胞增殖活性；茜素红染色和碱性磷酸酶染色观察细胞成骨分化能力；qRT-PCR检测细胞中成骨标志物碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA表达水平；Western blot检测细胞中Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD、Hes1表达水平。
结果与结论：①S-BMSCs的增殖活性、成骨分化能力及ADAM10表达水平均显著低于F-BMSCs(均P < 0.01)；②ADAM10过表达后S-BMSCs增殖活性、成骨分化能力及碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA表达水平和Notch1、NICD、Hes1蛋白表达水平均显著升高(P < 0.05)；然而，DAPT联合干预可显著抑制ADAM10过表达对S-BMSCs增殖活性和成骨分化能力的促进作用，并抑制Notch信号通路的活化；③结果表明，ADAM10在S-BMSCs中低表达，ADAM10过表达可增强S-BMSCs的增殖活性及成骨分化能力，其作用机制可能与激活Notch信号通路有关。

https://orcid.org/0000-0001-5382-7747 (樊俊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 激素性股骨头坏死, 骨髓间充质干细胞, 解整合素金属蛋白酶10, Notch信号通路, 成骨分化

Abstract: BACKGROUND: Many studies have found that the pathological progression of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head is related to abnormal proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, in which a disintegrin and metalloproteases 10 (ADAM10) is highly involved, but the specific mechanism remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of ADAM10 on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells derived from steroid-induced osteonecrosis of the femoral head patients and its possible mechanism.
METHODS: Bone marrow was harvested from proximal femur in 23 patients with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head and 17 patients with femoral neck fracture under sterile conditions. Bone marrow mesenchymal stem cells from steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (S-BMSCs) and femoral neck fracture (F-BMSCs) were isolated by density gradient centrifugation, and cultured to the third generation in vitro. The proliferation activity of cells in the two groups was detected by CCK-8 assay. Alizarin red staining and alkaline phosphatase staining were used to observe the osteogenic differentiation ability of cells in the two groups. qRT-PCR and western blot assay were used to detect the levels of ADAM10 mRNA and protein in cells of the two groups. S-BMSCs were infected with ADAM10 overexpression lentivirus vector, and then treated with Notch signaling pathway inhibitor DAPT. The proliferation activity of these cells was detected by CCK-8 assay. Alizarin red staining and alkaline phosphatase staining were used to observe the osteogenic differentiation of cells. qRT-PCR was used to detect the expression levels of osteogenic markers alkaline phosphatase, Runt-related transcription factor 2, and osteocalcin mRNA. The expression levels of Notch signaling pathway related proteins Notch1, NICD, and Hes1 were detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The proliferation activity, osteogenic differentiation ability and the expression level of ADAM10 in S-BMSCs were significantly lower than those in F-BMSCs (P < 0.01). (2) After ADAM10 overexpression, the proliferation activity, osteogenic differentiation ability, the expression levels of alkaline phosphatase, Runt-related transcription factor 2, and osteocalcin mRNA and Notch1, NICD and Hes1 protein of S-BMSCs were significantly increased (P < 0.05). However, combined intervention with DAPT significantly inhibited the promoting effects of ADAM10 overexpression on proliferation activity and osteogenic differentiation ability of S-BMSCs, and inhibited the activation of Notch signaling pathway. (3) The results show that ADAM10 can be underexpressed in S-BMSCs, and its overexpression can enhance the proliferation and osteogenic differentiation ability of S-BMSCs, and its mechanism may be related to the activation of Notch signaling pathway.

Key words: steroid-induced osteonecrosis of femoral head, bone marrow mesenchymal stem cell, a disintegrin and metalloproteases 10, Notch signaling pathway, osteogenic differentiation

中图分类号:

樊俊, 吴陈欢, 程中华. 解整合素金属蛋白酶10与激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1507-1513.

Fan Jun, Wu Chenhuan, Cheng Zhonghua. Effect of a disintegrin and metalloproteases 10 on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by steroid-induced osteonecrosis of femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(10): 1507-1513.

图/表（结果） 9

2.1 原代BMSCs表面抗原分析流式细胞术检测结果显示，所分离细胞表面抗原CD29和CD44呈阳性，其表达率分别为(94.27±1.69)%和(93.28±1.24)%；而抗原CD34和CD45呈阴性，其表达率仅为(2.40±0.80)%和(2.05±0.67)%，见图1。

2.2 BMSCs成骨分化和增殖活性分析茜素红染色结果显示，两组均有钙化结节生成，但与F-BMSCs组比较，S-BMSCs组钙化结节数量明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；碱性磷酸酶染色及活性检测结果显示，两组均出现深黑色颗粒状或片状沉淀，但与F-BMSCs组比较，S-BMSCs组碱性磷酸酶活性明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图2。CCK-8检测结果显示，随着时间的增长，各组细胞增殖活性均处于上升阶段，但与F-BMSCs组比较，S-BMSCs 组细胞于24，48，72 h培养时间点的增殖活性均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图3。

2.3 ADAM10在BMSCs中的表达与F-BMSCs组比较，S-BMSCs组细胞中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.001)，见图4。表明，ADAM10在S-BMSCs中异常低表达，ADAM10可能参与了激素性股骨头坏死疾病的发病。

2.4 ADAM10过表达对S-BMSCs增殖活性的影响与空白对照组或Lv-NC组比较，Lv-ADAM10组S-BMSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。CCK-8检测结果显示，与空白对照组比较，Lv-ADAM10组S-BMSCs增殖活性明显增加，差异有显著性意义(P < 0.001)，DAPT组S-BMSCs增殖活性明显降低，差异有显著性意义(P < 0.001)；与Lv-ADAM10组比较，Lv-ADAM10+DAPT组S-BMSCs增殖活性明显降低，差异有显著性意义(P < 0.001)，见图6。

2.5 ADAM10过表达对S-BMSCs成骨分化能力的影响与空白对照组比较，Lv-ADAM10组S-BMSCs钙化结节数量及碱性磷酸酶活性明显增加，差异有显著性意义(均P < 0.001)，DAPT组S-BMSCs钙化结节数量及碱性磷酸酶活性均明显降低，差异有显著性意义(均P < 0.01)；与Lv-ADAM10组比较，Lv-ADAM10+DAPT组S-BMSCs钙化结节数量及碱性磷酸酶活性均明显降低，差异有显著性意义(均P < 0.001)，见图7。

qRT-PCR结果显示，与空白对照组比较，Lv-ADAM10组S-BMSCs中成骨相关标志物碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA表达水平均明显升高，差异有显著性意义(均P < 0.001)，而DAPT组S-BMSCs中碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA表达水平则明显降低，差异有显著性意义(均P < 0.001)。Lv-ADAM10组比较，Lv-ADAM10+DAPT组S-BMSCs中碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA表达水平明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图8。提示过表达ADAM10可提高S-BMSCs的成骨分化能力，而抑制Notch信号通路后，过表达ADAM10可降低S-BMSCs的成骨分化能力。

2.6 ADAM10过表达对S-BMSCs中Notch信号通路的影响与空白对照组比较，Lv-ADAM10组S-BMSCs中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均明显升高，差异有显著性意义(P < 0.001)，DAPT组S-BMSCs中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)；与Lv-ADAM10组比较，Lv-ADAM10+DAPT组S-BMSCs中Notch1、NICD和Hes1蛋白表达水平均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.001)，见图9。提示S-BMSCs中Notch信号通路处于抑制状态，而过表达ADAM10干预后S-BMSCs中Notch信号通路活化，相关蛋白呈高表达，说明ADAM10可能调控Notch信号通路，进一步证实采用Notch信号抑制剂DAPT干预后，过表达ADAM10抑制了S-BMSCs中Notch信号通路的活化，表明ADAM10是通过调控Notch信号通路干预S-BMSCs的增殖和成骨分化能力。

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引言

激素性股骨头坏死是因长期使用激素而引起的一种以股骨头塌陷为特征的骨骼疾病。据研究显示，激素性股骨头坏死的发病机制较为复杂，主要病理特征为股骨头缺血、骨小梁断裂和骨坏死，其占股骨头坏死病例的30%以上，致残率极高[1]。既往研究表明，激素性股骨头坏死的病理进展与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的功能障碍有关，主要表现为BMSCs成骨和成脂分化失衡及细胞活性降低[2-3]。众所周知，BMSCs可分化为各种类型的细胞，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。研究已证实，类固醇等激素可抑制BMSCs成骨分化，促进成脂分化[4-5]。因此，提高BMSCs增殖活性及成骨分化能力或许是激素性股骨头坏死治疗的有效策略。

Notch信号通路是一种高度保守的细胞间信号转导通路，可参与调控BMSCs增殖和成骨分化，具有骨修复的潜能[6]。作为Notch信号通路活化的关键酶，解整合素金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteases 10，ADAM10)能够水解Notch蛋白膜外段受体，激活Notch信号的传导[7]。有研究显示，ADAM10可通过介导Notch信号通路的激活促进人牙周膜干细胞的成骨分化[8]。然而，ADAM10是否可增强激素性股骨头坏死来源BMSCs的成骨分化能力目前尚不明确。基于此，该研究通过分离激素性股骨头坏死患者来源BMSCs，探讨ADAM10基因过表达对激素性股骨头坏死患者来源BMSCs增殖及成骨分化的影响及其可能作用机制，旨在为激素性股骨头坏死的治疗提供潜在靶点。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学对比观察实验。多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年3月至2022年3月在长江大学医学部完成。
1.3 材料
1.3.1 临床样本选择2019年10月至2021年3月在黄冈市中心医院骨科行髋关节置换术的23例激素性股骨头坏死患者(激素性股骨头坏死组)和同期17例行髋关节置换术的股骨颈骨折患者(股骨颈骨折组)。23例激素性股骨头坏死患者中男性12例，女性11例，平均年龄(51.3±7.5)岁；17例股骨颈骨折患者中男性8例，女性9例，平均年龄(52.4±8.1)岁。

激素性股骨头坏死组患者纳入标准：①术前影像学检查及术后病理诊断均明确诊断为股骨头坏死，诊断标准符合《成人股骨头坏死临床诊疗指南(2016)》中相关规定[9]；②术前糖皮质激素服用量≥1 800 mg或连续服用糖皮质激素≥4周[10]；③无吸烟、酗酒史，无髋部骨折病史，无严重心脑血管病、肿瘤等病史。

股骨颈骨折组患者纳入标准：①无激素使用史；②无长期使用影响骨代谢的药物史；③无髋部骨折病史及其他基础病史；④无吸烟、酗酒史。

所有患者均签署知情同意书，并获得黄冈市中心医院伦理委员会批准(伦理批准号：NO.20200111)。两组患者性别、年龄差异无显著性意义(P > 0.05)。
1.3.2 主要试剂 DMEM/F12培养基、反转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；抗体CD29-PE、CD45-PE、IgG2a-PE、CD44-FITC、CD34-FITC和IgG1-FITC购自美国Becton Dickinson公司；ADAM10过表达载体慢病毒(Lv-ADAM10)及其阴性对照空载慢病毒(Lv-NC)购自上海汉恒生物技术有限公司，慢病毒滴度为1.5×108 TU/mL；Notch信号通路抑制剂DAPT(纯度≥95 %)购自美国Biogems公司；ADAM10抗体、Notch1抗体、NICD抗体、Hes1抗体和β-actin抗体购自英国Abcam公司；二抗HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit购自美国Santa Cruz公司；茜素红染色试剂盒购自北京达科为生物有限公司；碱性磷酸酶染色试剂盒购自南京建成生物工程研究所；碱性磷酸酶活性检测试剂盒购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司；CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；
1.3.3 主要仪器 CO2培养箱(型号：CR-80)购自广州康恒仪器有限公司；全自动酶标仪(型号：HBS-1096C)购自青岛聚创嘉恒分析仪器有限公司；流式细胞仪(型号：C6)购自美国BD公司；实时荧光定量PCR仪(型号：ABI 7300)购自美国Thermo Fisher公司；全自动化学发光图像分析系统(型号：Tanon-6100)购自上海Tanon公司；荧光显微镜(DM2700M)购自德国徕卡公司。
1.4 方法
1.4.1 BMSCs培养及鉴定无菌条件下抽取患者股骨近端5 mL骨髓液，采用1.077 g/L淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，去除大部分红细胞、脂肪细胞和血小板，分离出较高纯度的BMSCs，将较高纯度的BMSCs接种于培养瓶中，结合贴壁筛选法，去除悬浮生长的造血细胞，加入0.25%胰蛋白酶溶液短时间消化，分离出纯化的BMSCs，分别得到激素性股骨头坏死患者来源BMSCs(记为S-BMSCs)和股骨颈骨折患者来源BMSCs(记为F-BMSCs)。其中F-BMSCs为正常生理条件下的BMSCs，作为对照，可评估不同病理生理条件BMSCs的增殖活性、成骨能力及ADAM10表达水平的差异，与S-BMSCs对比，了解激素性股骨头坏死发病机制。将分离得到的BMSCs置于DMEM/F12培养液中进行重悬，以1×109 L-1细胞浓度接种于培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2常规培养箱中培养，每隔3 d更换培养基，待细胞达到90%密度时进行消化传代，培养瓶加入1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，37 ℃消化，于显微镜下观察到细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，加入2 mL的完全培养基终止消化；用移液枪反复轻轻吹打细胞使其脱壁并分散，收集细胞悬液至离心管中，500×g离心3 min，弃上清，加入10 mL完全培养基制成细胞悬液，然后分装培养。

取第3代BMSCs，用0.25%胰蛋白酶溶液消化重悬制成6等份细胞悬液(1×108 L-1)，分别加入荧光标记的CD29-PE、CD44-FITC、CD45-PE和CD34-FITC抗体及同型阴性对照IgG1-FITC和IgG2a-PE抗体，于4 ℃避光孵育30 min，PBS洗涤2次，将细胞重悬于PBS中，使用流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达。

另取第3代S-BMSCs和F-BMSCs，培养于6孔板中(3×105个/孔)，24 h后分别加入2 mL人BMSCs成骨诱导培养基(1 mmol/L地塞米松+1 mol/L β-甘油磷酸钠+50 mmol/L抗坏血酸)，每隔3 d换1次成骨诱导培养基，诱导21 d后，采用茜素红染色和碱性磷酸酶染色观察各组BMSCs成骨分化能力。
1.4.2 细胞感染及分组取第3代S-BMSCs以3×105个/孔培养于6孔板中，细胞融合度为80%时，吸去培养基，加入1 mL新鲜培养基，按照感染复数(MOI)为50∶1将ADAM10过表达载体慢病毒(Lv-ADAM10)及其阴性对照空载慢病毒(Lv-NC)感染至S-BMSCs中，并分为Lv-ADAM10组和Lv-NC组，另设空白对照组，在水平方向轻轻拍打培养板，待溶液混合均匀后放回37 ℃、体积分数为5% CO2常规培养箱中培养6 h后更换2 mL新鲜培养基，继续培养48 h后，采用qRT-PCR和Western blot法检测感染后S-BMSCs中ADAM10 mRNA和蛋白表达水平。根据实验需要，将S-BMSCs分为5组：空白对照组(S-BMSCs未经任何处理)；Lv-NC组(S-BMSCs感染Lv-NC慢病毒)；Lv-ADAM10组(S-BMSCs感染Lv-ADAM10慢病毒)；DAPT组(S-BMSCs经10 μmol/L DAPT处理48 h)；Lv-ADAM10+DAPT组(S-BMSCs感染Lv-ADAM10慢病毒后再经10 μmol/L DAPT处理48 h)。

1.4.3 CCK-8检测细胞增殖活性取各组细胞，加入0.25%胰蛋白酶溶液进行常规消化，制成细胞悬液(1×107 L-1)，接种于96孔板中，每孔100 μL，同时设置调零孔(培养基对照)，每组设置3个复孔，置于37 ℃、体积分数为5% CO2的常规培养箱中培养，分别在培养24，48，72 h后行CCK-8实验，即培养结束后每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育4 h，使用酶标仪于450 nm处检测各孔吸光度值。
1.4.4 BMSCs成骨分化能力检测

茜素红染色及定量分析：取各组细胞以3×105个/孔培养于6孔板中，24 h后加入人BMSCs成骨诱导培养基2 mL，每隔3 d换1次成骨诱导培养基，诱导21 d后，经40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3 次，加入1 mL 1%茜素红染液，室温染色15 min，PBS漂洗3次，干燥，置于显微镜下观察拍照。随后，采用10%氯化十六烷基吡啶溶液于37 ℃条件下充分溶解矿化结节，酶标仪测定562 nm波长处吸光度值。

碱性磷酸酶染色及活性检测：取各组细胞以3×105个/孔培养于6孔板中，24 h后加入人BMSCs成骨诱导培养基2 mL，每隔3 d换1次成骨诱导培养基，诱导7 d后：①碱性磷酸酶染色：弃培养基，经40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3 次，滴加新鲜配置的底物应用液，加盖疏水膜，置于暗湿盒中室温孵育15 min，PBS漂洗3次，复染液复染30 s，PBS漂洗3次，干燥，置于显微镜下观察拍照；②碱性磷酸酶活性：收集细胞，采用细胞裂解液于冰上充分裂解细胞，随后4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清液，根据碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明书操作，加入显色底物对硝基苯磷酸(p-nitrophenyl phosphate，pNPP)于37 ℃下避光孵育20 min，加入反应终止液终止反应，于405 nm波长处测定吸光度值，再根据标准曲线计算碱性磷酸酶活性(U/mg)。
1.4.5 qRT-PCR检测收集各组细胞沉淀，加入Trizol试剂和氯仿，于30 ℃孵育2 min，4 ℃条件下12 000×g离心15 min进行两相分离，RNA全部进入水相中，取出水相上层并加入等体积异丙醇使RNA沉淀，再次离心，移去上清，加入体积分数为75%乙醇进行清洗，吸去乙醇，室温干燥5 min，加入无RNA酶的水溶解RNA沉淀，采用分光光度计测总RNA的吸光度值，计算总RNA浓度及纯度。根据反转录试剂盒说明书，将总RNA反转录成cDNA，然后将cDNA作为模板，β-actin作为内参，按照qRT-PCR试剂盒说明书进行PCR扩增。扩增参数如下：94 ℃ 60 s；94 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算ADAM10及成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA相对表达量。引物序列如下，ADAM10引物F：5’-CTG CCC AGC ATC TGA CCC TAA-3’，R：5’-TTG CCA TCA GAA CTG GCA CAC-3’；碱性磷酸酶引物F：5’-TGC TGG TGG AAG GTA GGG TG -3’，R：5’-CAA ATG TGA AGA CGT GGG AAT G-3’；Runt相关转录因子2引物F：5’-CTC TAC TAT GGC ACT TCG TCA GG-3’，R：5’-TCA GCG TCA ACA CCA TCA TTC-3’；骨钙素引物F：5’-TGC AGA GTC CAG CAA AGG-3’，R：5’-CCC AGC CAT TGA TAC AGG TAG-3’；β-actin引物F：5’-TTG CGT TAC ACC CTT TCT TG-3’，R：5’-ACT GCT GTC ACC TTC ACC G-3’。
1.4.6 Western blot检测取各组细胞沉淀，加入适量RIPA裂解液，置于冰上充分裂解，4 ℃条件下12 000×g离心20 min，取上清即为总蛋白溶液，然后采用Bradford法进行蛋白定量。取25 μg蛋白样品配置上样缓冲液，于沸水浴中变性20 min，上样行10% SDS-PAGE电泳，采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST溶液洗膜3次，分别加入一抗ADAM10抗体(1∶1 000)、Notch1抗体(1∶1 000)、NICD抗体(1∶1 000)、Hes1抗体(1∶1 000)和β-actin抗体(1∶1 000)，于4 ℃条件下孵育过夜。次日，TBST溶液洗膜3次，加入二抗(1∶10 000)室温孵育2 h，TBST清膜3次，滴加增强型化学发光液(ECL)，采用全自动化学发光图像分析系统进行自动显影，并以β-actin为内参，分析各目的蛋白相对表达水平。
1.5 主要观察指标 ①流式细胞仪鉴定BMSCs表面抗原；②CCK-8检测BMSCs增殖活性；③茜素红染色和碱性磷酸酶染色观察BMSCs成骨分化能力；④qRT-PCR检测BMSCs中ADAM10 mRNA及成骨标志物碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA表达水平；⑤Western blot检测BMSCs中ADAM10蛋白及Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD、Hes1表达水平。
1.6 统计学分析通过SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示。多组之间的比较采用单因素方差分析，事后组间两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过长江大学生物统计学专家审核。

讨论

随着现代医学的不断发展，激素在临床上应用日益广泛，长时间或大量使用激素可导致局部骨内压力增加、血液循环紊乱、骨缺血性坏死等病变，从而形成激素性股骨头坏死[11]。近年来，激素性股骨头坏死的发病率逐渐升高，但关于激素性股骨头坏死的确切机制尚不明确。后续众多学者研究发现，BMSCs与激素性股骨头坏死密切相关，即在长时间激素的作用下，BMSCs的成骨-成脂分化平衡受到破坏，细胞增殖和成骨分化被抑制，骨生成减少[12]。因此，提高BMSCs增殖活性及其成骨分化能力或许是治疗激素性股骨头坏死的潜在疗法。

为了探究激素性股骨头坏死患者BMSCs增殖活性及其成骨分化能力，该研究采用密度梯度离心法分离人BMSCs，通过体外培养BMSCs，发现S-BMSCs增殖活性及成骨分化能力均显著降低，与ZHANG等[13]研究结果一致。这进一步证明S-BMSCs增殖活性及成骨分化能力降低可能是激素性股骨头坏死发病机制的重要环节。同时，该研究发现，S-BMSCs中ADAM10表达水平也显著降低，表明ADAM10低表达可能与S-BMSCs的增殖和成骨分化能力降低有关。

ADAM10是一种由金属蛋白酶、富含半胱氨酸、分解素和表皮生长因子样结构域组成的模块蛋白，可参与多种生物学功能，包括炎症、凋亡、细胞黏附、细胞代谢、癌症转移和自身免疫等[14]。此外，也有研究指出，ADAM10可调节细胞增殖活性及成骨分化能力，例如，YUAN等[15]研究表示，ADAM10通过调控E-cadherin/β-catenin信号通路促进骨肉瘤细胞生长、迁移和侵袭。ARAYA等[16]研究显示，ADAM家族成员在成骨细胞和骨组织中表达，其中ADAM10在成骨细胞分化过程中基因表达水平发生显著性变化。但ADAM10对S-BMSCs的影响尚不知晓。因此，该研究为了探讨ADAM10对S-BMSCs增殖活性及其成骨分化能力的影响，通过构建ADAM10过表达载体慢病毒并成功感染S-BMSCs。进一步研究发现，ADAM10过表达可提高S-BMSCs增殖活性及成骨分化能力，同时上调成骨相关标志物碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA的表达。此外，该研究还发现ADAM10过表达可提高S-BMSCs中Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD、Hes1的表达，提示ADAM10过表达对S-BMSCs增殖活性及成骨分化能力的改善可能与Notch信号通路的活化有关。

Notch信号通路广泛存在于脊椎动物和非脊椎动物，在细胞的增殖、分化和成骨过程中起着至关重要的作用。研究显示，Notch信号通路在各种骨细胞中处于低活化状态[17]，而Notch1作为Notch受体与其邻近配体结合后，裂解Notch受体释放NICD，NICD进入细胞核后激活Hes1(下游靶基因)，调控成骨相关基因，如碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素等，从而促进骨细胞向成骨方向分化。Notch信号通路对BMSCs增殖和成骨分化的调节作用被广泛报道，激活Notch信号通路可加速BMSCs的增殖，提高成骨活性，显著促进骨愈合组织的形成[18-19]。ADAM10作为Notch信号通路的上游蛋白酶，通过蛋白水解性剪切Notch受体释放NICD，从而激活Notch信号通路达到调控成骨细胞的作用[14，20]。为了进一步探讨ADAM10介导S-BMSCs的增殖和成骨分化过程是否与Notch信号通路的激活有关，该研究采用Notch信号抑制剂DAPT进行联合干预，结果显示，DAPT可显著降低ADAM10过表达上调的Notch信号通路相关蛋白Notch1、NICD、Hes1表达水平以及成骨相关基因碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、骨钙素mRNA的表达，并显著抑制ADAM10过表达诱导的S-BMSCs增殖活性和成骨分化能力，说明ADAM10可能是通过激活Notch信号通路促进S-BMSCs增殖和成骨分化能力。

综上所述，过表达ADAM10可增强S-BMSCs的增殖活性及成骨分化能力，其作用机制可能与调控Notch信号通路有关。然而，ADAM10对S-BMSCs炎症、凋亡等行为是否也有影响尚不清楚，后续研究还需进一步探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

解整合素金属蛋白酶10与激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化

Effect of a disintegrin and metalloproteases 10 on proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells induced by steroid-induced osteonecrosis of femoral head

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