慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损

doi:10.12307/2023.247

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (10): 1528-1533.doi: 10.12307/2023.247

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慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损

谢梦生1，2，龙燕鸣1，2，李晓捷1，2

1广西医科大学口腔医学院，广西壮族自治区南宁市 530021；2广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2022-01-04 接受日期:2022-04-18 出版日期:2023-04-08 发布日期:2022-09-07
通讯作者: 李晓捷，主任医师，硕士生导师，广西医科大学口腔医学院，广西壮族自治区南宁市 530021；广西口腔颌面修复与重建研究自治区级重点实验室，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:谢梦生，男，1992年生，四川省成都市人，汉族，2019年广西医科大学毕业，硕士，医师，主要从事口腔修复方面研究。
基金资助:
广西自然科学基金面上项目(2019GXNSFAA245085)，项目负责人：李晓捷

Lentiviral down-regulation of casein kinase 2-interacting protein-1 expression in bone marrow mesenchymal stem cells to repair alveolar bone defects in osteoporosis rats

Xie Mengsheng1, 2, Long Yanming1, 2, Li Xiaojie1, 2

1College of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-01-04 Accepted:2022-04-18 Online:2023-04-08 Published:2022-09-07
Contact: Li Xiaojie, Chief physician, Master’s supervisor, College of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Xie Mengsheng, Master, Physician, College of Stomatology, Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; Guangxi Key Laboratory of Oral and Maxillofacial Rehabilitation and Reconstruction, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
General Project of Guangxi Natural Science Foundation, No. 2019GXNSFAA245085 (to LXJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨质疏松症：是一类全身系统性的骨病，由多种原因引起，以全身骨组织量下降、骨结构破坏为特点。
酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1，CKIP-1)：CKIP-1 cDNA编码全长409个氨基酸，分子质量约为46 kD。CKIP-1在细胞分化、凋亡、癌变及转录等细胞行为中，通过与其他蛋白的相互作用发挥重要作用，近来发现CKIP-1与骨形成呈负相关关系。

背景：在口腔牙槽骨修复治疗过程中，患者的全身状况尤其是骨质疏松症等系统性疾病往往会影响治疗效果，近来发现酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1，CKIP-1)具有负调控成骨的作用，因此有希望作为新的靶点用于治疗骨质疏松。
目的：探究CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的修复作用。
方法：①从1周龄SD乳鼠股骨及胫骨骨髓中分离培养出骨髓间充质干细胞，慢病毒转染降低骨髓间充质干细胞中的CKIP-1水平；②通过维甲酸[70 mg/(kg•d)]灌胃21 d的方式建立骨质疏松SD大鼠模型，将CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体、空载体转染的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体、明胶海绵分别植入骨质疏松大鼠模型牙槽骨缺损内，正常组将明胶海绵植入正常大鼠牙槽骨缺损内。术后正常喂养30 d后，取上颌牙槽骨进行苏木精-伊红染色并通过Lane-Sandhu组织学评分和新生骨百分比评估骨缺损愈合情况，通过qRT-PCR技术和免疫组化染色检测各组术区牙槽骨中CKIP-1、碱性磷酸酶、骨钙素的mRNA相对表达量及阳性表达情况。
结果与结论：①与空载体转染相比，CKIP-1下调后的骨髓间充质干细胞中CKIP-1的mRNA相对表达量减少(P < 0.05)；②与植入空载体转染的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体组、明胶海绵组相比，植入CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体组Lane-Sandhu组织学评分和新生骨百分比显著升高(P < 0.05)，与正常组相近；碱性磷酸酶、骨钙素表达显著升高(P < 0.05)；③结果说明，局部移植CKIP-1下调的骨髓间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损具有明显的修复作用。

https://orcid.org/0000-0002-9064-0882 (李晓捷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨质疏松症, CKIP-1, 骨髓间充质干细胞, 组织工程, 慢病毒转染, 骨缺损, 大鼠

Abstract: BACKGROUND: Osteoporosis is a frequently encountered and urgent problem in the clinical repair and treatment of alveolar bone and often affects the treatment effect. Casein kinase 2-interacting protein-1 (CKIP-1) has recently been found to have a negative regulation of osteogenesis, so it is promising as a new target for the treatment of osteoporosis.
OBJECTIVE: To explore the repair effect of bone marrow mesenchymal stem cells modified with CKIP-1 on alveolar bone defects in osteoporosis rats.
METHODS: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured from 1-week-old SD rats. Lentiviral transfection reduced the expression of CKIP-1 in bone marrow mesenchymal stem cells. (2) The model of osteoporosis rats was established by intragastric administration of retinoic acid (70 mg/kg per day) for 21 days. The complex of bone marrow mesenchymal stem cells modified with CKIP-1 and gelatin sponge, the complex of bone marrow mesenchymal stem cells transfected with empty vector and gelatin sponge, and the gelatin sponge were implanted into the alveolar bone defect of the osteoporosis rat model, separately. Gelatin sponge was implanted into bilateral alveolar bone defects of normal rat model of the normal group. After 30 days of normal feeding, the maxillary alveolar bone was taken for sectioning and staining, and the healing of bone defect was calculated by the Lane-Sandhu histological score and the percentage of new bone. The relative mRNA expression and positive expression of CKIP-1, alkaline phosphatase and osteocalcin in the alveolar bone of each group were detected by qRT-PCR and immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Compared with empty vector transfection, the relative expression of CKIP-1 mRNA in bone marrow mesenchymal stem cells modified with CKIP-1 decreased (P < 0.05). (2) Compared with the bone marrow mesenchymal stem cells transfected with the empty vector and gelatin sponge complex group and the gelatin sponge group, the Lane-Sandhu histological score and the percentage of new bone significantly increased in the bone marrow mesenchymal stem cells modified with CKIP-1 and gelatin sponge complex group (P < 0.05), which were similar to the normal group; the expression levels of alkaline phosphatase and osteocalcin were significantly increased (P < 0.05). (3) The results indicated that local transplantation of CKIP-1 transfected modified bone marrow mesenchymal stem cells had better repair effect on alveolar bone defects in osteoporosis rats.

Key words: osteoporosis, CKIP-1, bone marrow mesenchymal stem cell, tissue engineering, lentiviral transfection, bone defect, rat

中图分类号:

谢梦生, 龙燕鸣, 李晓捷. 慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(10): 1528-1533.

Xie Mengsheng, Long Yanming, Li Xiaojie. Lentiviral down-regulation of casein kinase 2-interacting protein-1 expression in bone marrow mesenchymal stem cells to repair alveolar bone defects in osteoporosis rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(10): 1528-1533.

图/表（结果） 6

2.1 骨髓间充质干细胞形态和鉴定结果如图1所示，吉姆萨染色后的骨髓间充质干细胞的胞核深染，居中。细胞贴壁铺成单层，细胞形态大致呈短梭形，有粗大突起伸出，细胞多数聚集成集落。成骨诱导3周后，可观察到结节状钙化结构，用茜素红染色后，显微镜下可观察到红色的钙化结节，见图2A。成脂诱导28 d后进行油红O染色，显微镜下可观察到脂肪滴位置呈明显红染，见图2B。流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞均阳性表达CD90，CD44，且阳性表达率在85%以上，阴性表达CD34，表达率不足1%，见图3。

2.2 骨质疏松大鼠模型验证结果维甲酸灌胃结束后，两组大鼠均无死亡。与对照组相比，骨质疏松组骨小梁较薄，骨髓腔较宽，骨小梁之间分离度较大，见图4。骨质疏松组骨密度均值为(0.402±0.043) g/cm2，对照组骨密度均值为(0.459±0.070) g/cm2，骨质疏松组骨密度是对照组的87.6%(P < 0.05)。

2.3 各组组织学观察结果术后1个月，上颌骨术区组织苏木精-伊红染色显示：OP组骨缺损充满纤维结缔组织，仅可见少部分新生骨质，并且与周边骨组织交界明显；OP+BMSCs组骨缺损内可见明显的新生骨生成，与周围骨组织无明显骨连接；OP+BMSCs/CKIP-1组骨缺损区内可见大量新生骨组织，并能发现部分新生血管，与周围骨组织有骨与类骨连接的形式存在；正常组骨缺损区域内新生骨量较多，活跃的成骨细胞和新生血管多见，与周围骨组织已经存在部分骨性连接，见图5A-D。

Lane-Sandhu组织学评分统计结果显示：OP组组织学评分明显低于OP+BMSCs组、OP+BMSCs/CKIP-1组和正常组，差异有显著性意义(P < 0.01)；OP+BMSCs组组织学评分低于OP+BMSCs/CKIP-1组，差异有显著性意义(P < 0.05)；OP+BMSCs/CKIP-1组组织学评分与正常组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5E。

新生骨百分比统计结果显示：OP组新生骨面积百分比最小，与OP+BMSCs组、OP+BMSCs/CKIP-1组和正常组相比差异均有显著性意义(P < 0.01)；OP+BMSCs组新生骨面积百分比低于OP+BMSCs/CKIP-1组，差异有显著性意义(P < 0.05)；而OP+BMSCs/CKIP-1组的新生骨面积百分比与正常组相比差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5F。

2.4 体内实验证实沉默CKIP-1促进骨质疏松大鼠骨缺损愈合免疫组化结果显示，OP+BMSCs/CKIP-1组碱性磷酸酶和骨钙素蛋白表达高于OP组(P < 0.01)和OP+BMSCs组(P < 0.05)，而与OP组和OP+BMSCs组相比，OP+BMSCs/CKIP-1组CKIP-1蛋白表达显著降低(P < 0.01)，见图6A-D。RT-PCR结果显示，OP+BMSCs/CKIP-1组碱性磷酸酶和骨钙素 mRNA的相对表达水平高于OP组(P < 0.01)和OP+BMSCs组(P < 0.05)，见图6E，F。OP+BMSCs/CKIP-1组CKIP-1 mRNA的相对表达低于OP组(P < 0.05)和OP+BMSCs组(P < 0.05)，见图6G。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，两组间连续变量采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2017年7月至2019年3月在广西医科大学附属口腔医院科研实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性10周龄SD大鼠44只，体质量275-300 g，由广西医科大学动物中心提供，动物饲养室温度为15-28 ℃、湿度为45%-55%，自然光照，自由进食。根据实验时间取1只1周龄SD乳鼠用于骨髓间充质干细胞分离培养。实验中对动物的处置符合广西医科大学实验动物伦理委员会的要求，许可证号：SCXK桂2014-0002。
1.3.2 实验材料及试剂维甲酸粉剂(陕西森弗生物技术有限公司)；CKIP-1兔多克隆抗体(Abcam，英国)；兔抗鼠碱性磷酸酶、骨钙素多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；靶向干扰CKIP-1基因的慢病毒、空载基因慢病毒(苏州吉玛基因)；实时荧光定量PCR检测试剂盒(TAKARA公司，中国大连)；TRIzol裂解液、反转录试剂盒(TAKARA公司，中国大连)；CKIP-1兔多克隆抗体(Abcam，英国)；免疫组化二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗鼠碱性磷酸酶、骨钙素多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；Prodigy骨密度仪(通用电气医疗系统，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养及转染

(1)原代培养及鉴定：1周龄SD乳鼠1只，2%戊巴比妥腹腔注射处死，分离其股骨及胫骨，在超净操作台上使用组织剪剪去股骨和胫骨的干骺端，暴露骨髓腔，用5 mL注射器吸取DMEM/F12培养液不断反复冲洗骨髓腔，直至看到骨髓腔溶液颜色由红色渐变为白色即可停止冲洗，之后采用贴壁培养筛选法培养出骨髓间充质干细胞的原代细胞，观察细胞生长及融合情况，在培养皿底部融合至85%以上时，进行传代培养。取生长良好的第3代细胞进行吉姆萨染色观察细胞形态，成骨、成脂分化后分别进行茜素红染色和油红O染色，流式鉴定免疫表型CD90，CD34，CD44。

(2)慢病毒转染：取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，PBS反复清洗3遍，消化收集细胞，加入适量的10%培养液重悬细胞，进行细胞计数，以1×104个/孔细胞数接种于96孔板，每孔加入100 μL培养液；按照病毒转染说明书，种板24 h后，配置5个病毒梯度：MOI=25，30，35，40，45，更换含5 mg/L Polybrene的新鲜培养液，加入适量病毒悬液，病毒转染后放入细胞培养箱中培养，12 h后于显微镜下观察细胞状态，24 h后全量更换新鲜培养基，继续培养72 h，荧光显微镜下观察病毒转染情况，转染效率最高的MOI=40。

将细胞以每孔1×105个的密度接种于6孔板，24 h以后弃培养液，待细胞贴壁30%-50%，将预先配好的病毒感染液(含40 μL病毒上清液、0.96 mL新鲜培养液、1 μL Polybrene)加入到目的细胞培养孔中，对照组加入空载病毒；感染24 h后将病毒混合液弃掉，换成含1 mg/L嘌呤霉素的培养液；待细胞长满后，收集各孔细胞备用。
1.4.2 骨髓间充质干细胞在明胶海绵上的种植无菌条件下，将明胶海绵剪裁至2 mm×2 mm×2 mm大小，放置在48孔板内，将慢病毒转染后的骨髓间充质干细胞进行消化，离心收集后，以每孔约1×105个细胞的数量接种于明胶海绵上，在37 ℃体积分数为5%CO2培养箱中培养3 d，留待下一步实验使用。
1.4.3 骨质疏松模型的建立及验证将44只SD大鼠随机分为骨质疏松组33只和正常组11只，骨质疏松组用维甲酸按照70 mg/(kg•d)的剂量连续灌胃21 d，正常组则给予等量(4 mL/kg)双蒸水连续灌胃21 d作为对照。21 d灌胃结束，各随机选取10只大鼠麻醉下通过骨密度仪和计算机软件系统测量每只大鼠的骨密度并进行统计分析。
1.4.4 牙槽骨缺损模型的建立骨质疏松建模完成后，2%戊巴比妥按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，对上颌牙槽骨术区消毒，切开翻瓣并且暴露大鼠上颌牙槽骨，于大鼠上颌双侧第一磨牙远中牙槽骨位置利用牙科裂钻各造一直径2 mm、深2 mm大小的圆柱形缺损，术后所有大鼠分为4组，见表1。各组明胶海绵妥善放置完成后，缝合牙龈。术后连续3 d每天注射10万U青霉素。术后1个月，麻醉后处死所有大鼠，分离得到上颌骨手术区牙槽骨标本，每组随机选择10份标本立即置于液氮中，30 min后转移至-80 ℃冰箱冻存；另外每组剩下的12份标本置于40 g/L多聚甲醛固定保存24 h，脱钙处理一两个月。
1.4.5 组织切片染色常规脱钙，脱水，石蜡包埋，组织切片，苏木精-伊红染色。用Lane-Sandhu组织学评分记录观察结果，评分标准见表2。总分值越高，骨缺损组织修复越好。

每份石蜡标本选取3张不同层次的切片，将切片置于4倍显微镜物镜下，将图像采集入计算机IDA-2000高清晰度数码显微图像分析系统中，计算新生骨面积占视野面积的百分比作为新生骨面积百分比。

将切片放入抗原修复液中，用高压锅加热煮沸8 min进行抗原修复，然后自然冷却至室温，将切片放入湿盒中，按照免疫组化试剂盒说明顺序添加CKIP-1、碱性磷酸酶、骨钙素一抗、二抗试剂进行免疫组化染色，每份标本显微镜下选取不同视野拍照5张，利用IPP软件测量骨缺损区域的积分吸光度值，计算平均值。
1.4.6 实时荧光定量PCR 按照Trizonl试剂盒操作说明进行骨组织RNA提取，将颌骨标本从-80 ℃冰箱取出，快速置于研钵中，小心倒入适量液氮，将上颌骨标本研磨成粉，加入1 mL裂解液放置3-5 min；然后转移到2 mL EP管中，加入200 μL氯仿混匀，冰上孵育5 min；离心，将上清转移到新的EP管中，加入1 mL异丙醇，冰上静置10 min；离心，试管底部可见RNA白色沉淀；倒掉上清，然后向EP管中加入利用ddH2O新鲜配置的1 mL体积分数为75%乙醇，溶解沉淀；离心弃去上清液，待沉淀干燥后，加入ddH2O溶解沉淀，最后用核酸浓度测定仪检测各组样品RNA的浓度。根据TaKaRa反转录试剂盒的具体步骤将样本的RNA反转录合成cDNA，以β-actin为内参按操作说明进行PCR扩增，检测CKIP-1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA水平，引物序列见表3。

1.5 主要观察指标 ①大鼠骨髓间充质干细胞的形态及成骨、成脂分化能力；②苏木精-伊红染色观察骨质疏松大鼠骨缺损新生骨修复情况；③qRT-PCR以及免疫组化染色观察各组大鼠骨缺损区CKIP-1、碱性磷酸酶、骨钙素的表达。
1.6 统计学分析对所测数据使用SPSS 20.0统计软件分析，数据以x±s表示，两组间连续变量采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广西医科大学生物统计学专家审核。

讨论

全身系统性疾病如骨质疏松症，对颌骨有着重要的影响。骨质疏松症患者由于成骨作用不足，在颌骨外伤或者拔牙术后的情况下，患者骨缺损愈合缓慢，难以进行下一步的治疗。解决骨质疏松患者骨缺损愈合缓慢的重点在于如何提高其成骨能力，或者减弱破骨效果。传统的骨缺损修复手术方式主要包括自体骨移植或者同种异体骨移植，但是这些方法都有缺点和不足，例如供骨区可能会发生相关并发症或者异体骨移植导致的免疫反应。近年来，随着组织工程学的兴起发展，干细胞移植修复骨缺损已成为一种新的修复选择。

CKIP-1的cDNA编码全长为490个氨基酸，以往研究发现CKIP-1不仅在细胞分化、癌变和凋亡等细胞行为中与相关蛋白作用[15-19]，并能激活增强Smurf1因子的活性，引发BMPR、Runx2等蛋白质的降解，从而达到负调控骨形成的效果。LIU等[14]虽然已经验证糖皮质激素造模的骨质疏松大鼠体内CKIP-1基因表达相比正常大鼠有明显增高，但是还未有文献报道其他造模方法的骨质疏松大鼠模型是否也会有CKIP-1基因的表达差异，以及通过下调骨髓间充质干细胞内CKIP-1表达是否在动物体内能局部增强骨组织的修复。在该研究中，通过组织学检测分析发现，CKIP-1下调后的骨髓间充质干细胞具有更加优良的成骨效果，并且已经能使骨质疏松大鼠骨量达到正常大鼠的愈合程度，其能有效修复骨质疏松骨缺损。以往体内外实验均发现骨质疏松动物的骨髓间充质干细胞中CKIP-1的表达相对正常动物有所升高[11]，而该研究通过PCR检测和免疫组化检测发现CKIP-1下调后的骨髓间充质干细胞局部植入能够降低骨质疏松大鼠局部骨组织缺损处CKIP-1的表达，借此影响局部骨生成的能力。另外，碱性磷酸酶属于成骨蛋白分化早期广泛发现表达的因子，是骨髓间充质干细胞早期成骨分化的重要指标[20-21]；而骨钙素又称骨γ-羧谷氨酸包含蛋白，该蛋白主要表达于骨矿化高峰期，其功能是保持骨的正常转化速率，在骨折患者体内往往表达升高，属于骨生成晚期常见的特异表达蛋白[22]。通过PCR及免疫组化检测CKIP-1、碱性磷酸酶和骨钙素的表达并统计分析，结果表明CKIP-1表达下调后的骨髓间充质干细胞或许在骨形成早期和发育晚期都发挥了骨缺损修复作用，促进了成骨分化、骨的生成和骨的成熟，综合作用下促进了骨缺损的愈合，具体的成骨信号通路有待进一步验证和补充。

综上所述，该研究通过骨密度检查验证了维甲酸诱导出骨质疏松大鼠模型，下调CKIP-1基因表达的骨髓间充质干细胞对骨质疏松骨缺损修复具有明显促进作用，CKIP-1作为骨形成的负调控影响因子，可为临床骨质疏松骨缺损治疗提供新思路。近期研究表明，体外下调间充质干细胞CKIP-1表达，对Wnt信号通路、BMP信号通路等骨形成相关通路均有促进作用[20]，但是CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞在骨质疏松动物体内具体通过影响哪些关键通路因子来达到成骨效果尚未完全明确，并且骨质疏松作为全身性疾病，影响因素众多。该实验使用的维甲酸是维生素A衍生物，能激活机体内破骨细胞，最终骨吸收快于骨形成，从而导致骨质疏松症，虽然已有许多学者进行相关研究[23-30]，但是对于CKIP-1发挥负调控作用与全身因素例如体内雌激素分泌的关系，该模型无法有效表达出来，仍有待进一步的分析研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损

Lentiviral down-regulation of casein kinase 2-interacting protein-1 expression in bone marrow mesenchymal stem cells to repair alveolar bone defects in osteoporosis rats

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