2.1   脑瘫患儿脑脊液存在外泌体   采用超速离心法从脑脊液中分离出囊泡，Western blot检测显示：外泌体标志蛋白Flotillin-1和Syntenin-1表达阳性，见图2。透射电镜观察显示囊泡直径为20-200 nm，球形或茶托形，具有连续的双层膜包被，表明在脑瘫患儿脑脊液中存在外泌体样囊泡，见图3。纳米颗粒跟踪分析结果显示，样品由直径正态分布的异质性囊泡组成，见图4，囊泡直径为(118.3±6.44) nm，浓度为(7.67±4.30)×1011 L-1。











2.2   脑瘫患儿脑脊液外泌体蛋白图谱生成   使用无标记质谱分析外泌体中的蛋白，生成脑瘫患儿脑脊液外泌体蛋白图谱。混合型和痉挛型样本各3个重复中共鉴定出551个蛋白质，其中427个蛋白被鉴定出至少有2个唯一的肽段，这些蛋白中有大量外泌体特异表达的蛋白，见表1。与Vesiclepedia和ExoCarta protein Databases中的数据进行比较[19-20]，发现Vesiclepedia TOP100和ExoCarta TOP100中分别鉴定出48个和47个蛋白，见图5A，B，这些数据表明外泌体的分离和蛋白质分析是可靠的。与已发表的其他脑脊液外泌体的蛋白质组数据进行比较[21-22]，此研究鉴定的蛋白质中有148个(36%)或73个(17.8%)与其他数据组相同，见图5C。这3组数据集中相同的蛋白质有49种，且这些蛋白大多为外泌体特异表达蛋白。

随后使用FunRich进行GO注释，见图6A-C，对于细胞成分，蛋白数据集显示主要富集于外泌体、细胞外和细胞外区域等；在分子功能方面，蛋白主要富集于补体活性和细胞外基质结构成分等；在生物过程中，蛋白主要富集于免疫应答、细胞生长和维持以及蛋白质代谢。在所有FunRich外泌体蛋白质数据库的背景下，该研究的数据集富集到脑脊液蛋白质组中，见图6D。蛋白结构域预测显示，有54.3%的外泌体蛋白含有信号肽，见图6E，说明这些蛋白大部分是胞外分泌蛋白，这一结果与外泌体来源蛋白的特性相符。



2.3   脑脊液来源外泌体蛋白与脑瘫疾病密切相关    为了研究外泌体蛋白是否与脑瘫有关，来自哪些脑部区域，利用Allen Brain Atlas的发育基因表达数据库(3-11岁)进行进一步分析，结果发现这些外泌体蛋白主要富集于额叶新皮质、前额叶皮质、背外侧前额叶皮质、初级运动皮质(M1区，4区)等部位，见图7。为了研究得到的外泌体蛋白数据是否与已知脑瘫研究有关，用文本挖掘的方法对已发表的脑瘫相关文献进行检索，CTD库和DISEASES数据库检索结果显示有19个相关蛋白，见图8，一些蛋白与神经发育、运动或认知能力有关。







2.4   两种常见脑瘫类型差异蛋白分析   该实验检测了两种最常见的脑瘫类型-痉挛性脑瘫、混合性脑瘫的脑脊液外泌体蛋白质组。通过分析得到了它们的主要差异蛋白，见图9。差异蛋白主要富集在二硫键、信号肽、糖蛋白等和外泌体分泌及识别等通路上。

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脑性瘫痪(以下简称脑瘫)是儿童行动受限和姿势障碍最常见的原因，约每500名新生儿中就有1名脑瘫患者[1]，全球约有1 700万人患脑瘫。脑瘫儿童可能在行动、感觉和交流等方面存在困难。在传统意义上，脑瘫不是一种疾病，而是一组临床综合症状，又分为痉挛性脑瘫、徐动型脑瘫、混合脑瘫等类型[2]，见图1。脑瘫发生可能与早产、出生时缺氧、先天畸形、子宫内感染、胎儿生长受限、多胎妊娠、胎盘异常、基因突变有关[3-6]。特异性诊断和早期干预患儿可以提高运动和认知的可塑性，预防继发性并发症，并提高看护者的幸福感[7]。但到目前为止，仍然缺乏有效的、可预测的分子指标来分类和诊断脑瘫，儿童脑瘫相关的研究资料仍然匮乏，阻碍了临床和基础研究的进一步发展。

外泌体是由大多数类型细胞分泌到血液、尿液、脑脊液、唾液和羊水等体液中的20-150 nm的囊泡[8]。外泌体在细胞与细胞间的沟通中发挥着重要作用，越来越多的证据表明，外泌体内容物如蛋白、microRNAs、脂类等与人类疾病的发生、发展密切相关。外泌体内容物可以作为疾病诊断、治疗和预测结局的重要生物标志物[9-10]。脑脊液来源外泌体包含神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞等分泌的蛋白，它们涉及神经系统的发育和多种生理病理过程[11]。脑瘫患儿具有非进行性脑损伤和功能障碍的特征，然而很少有研究报道这一人群中脑脊液来源外泌体的特征。

基于质谱的蛋白质组学技术是识别和量化差异表达蛋白的先进方法。在不同疾病中，脑脊液来源外泌体所包含的RNA和蛋白质谱有较大差异[12]，这些差异与疾病进程密切相关[13]。该研究目的是分离培养儿童脑瘫患者脑脊液来源外泌体，使用无标记定量质谱蛋白质组学方法分析其外泌体的蛋白质组表达谱特征，为儿童脑瘫群体的分型、诊断和预后评估等提供分子生物学依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   蛋白质组学鉴定。
1.2   时间及地点   2019年10月至2021年12月在东直门医院国家重点实验室完成。
1.3   对象   共7例脑瘫患者，均为来北京中医药大学东直门医院进行选择性脊神经后根切断术的患者，年龄(7.42±2.94)岁，男5例、女2例，痉挛型脑瘫患者4例、混合型脑瘫患者3例。

诊断标准：必备条件：①中枢性运动障碍持续存在；②运动和姿势发育异常；③反射发育异常；④肌张力及肌力异常。参考条件：①引起脑瘫的病因学依据；②头颅影像学佐证(MRI、CT、B超等)。

纳入标准：①符合脑瘫诊断标准；②自愿参加此次研究，签署知情同意书( > 7岁的患者和监护人同时签署，3-6岁的患者由监护人签署)；③年龄3-14岁。

排除标准：①患有其他神经系统疾病；②正在使用可能影响研究结果的药物或治疗方式；③有免疫缺陷、凝血障碍等疾病。

该研究获得北京中医药大学附属东直门医院伦理委员会批准(dzmeco-ky-2019-91)。
1.4   实验方法   
1.4.1   采集脑瘫患儿脑脊液   4例痉挛性脑瘫患儿、3例混合性脑瘫患儿在进行选择性脊神经后根切断术时，打开硬膜显露神经根时，脑脊液会在压力下自行流出，此时无菌注射器收集流出的脑脊液3 mL，置于4 ℃，3 000×g离心15 min，将上清液转移至新的冻存管中，-80 ℃分装冻存。
1.4.2   外泌体分离   室温解冻的脑脊液标本，在4 ℃、10 000×g下离心30 min以清除细胞碎片，然后使用超速离心法在4 ℃、140 000×g下离心70 min，所用设备为Beckman Coulter公司的XPN100大型超速离心机；超速离心后，小心去掉上清，PBS重悬沉淀，涡流混合均匀，再次在4 ℃，140 000×g下离心70 min，沉淀即为外泌体。为了进行无标记质谱分析，每组共收集相同类型脑瘫患者脑脊液样本提取外泌体，用于质谱检测分析。
1.4.3   透射电镜观察   获取外泌体后，用透射电子显微镜观察其形态。PBS重悬外泌体，用40 g/L多聚甲醛和等体积1%戊二醛将外泌体悬液固定15 min，然后将外泌体悬液涂抹在400目碳涂层铜网格(Ted Pella Inc, Redding, CA, USA)上，在室温下干燥10 min；放入pH值为7.0的草酸铀酰溶液中染色10 min；再放入pH值为4.0的甲基纤维素-醋酸铀酰溶液(9份2%的甲基纤维素和1份4%的醋酸铀酰)中染色10 min；染色完成后，样品在室温下干燥10 min，用JEM-1400 Plus透射电子显微镜(JEOL Ltd, Tokyo, Japan)观察。
1.4.4   蛋白质印迹分析   取外泌体悬液100 μL加入等体积裂解液，冰上裂解10 min，裂解完成后转移到EP管中，4 ℃、10 000×g离心10 min；将上清转移到新EP管中，用外泌体定量试剂盒检测蛋白浓度，取50 μg蛋白与5X上样缓冲液混匀，95 ℃煮5 min；样品通过80 V-6%浓缩胶，120 V-10%分离胶SDS-PAGE电泳，电泳时间共1.5 h；电泳后，通过0.25 A横流半干转膜1 h，蛋白质被转移到PVDF膜上(Immobilon-P，Millipore，USA)，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，加入Syntenin-1(cat. No. ab133267；Abcam，Cambridge，UK)和Flotillin-1(cat. No. ab41927，Abcam，Cambridge，UK)一抗4 ℃孵育过夜，TBST清洗膜3次，每次10 min，之后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金桥公司)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，随后用化学发光试剂ECL显色，并在X射线胶片上曝光20 s。将已曝光胶片在显影液和定影液(保定乐凯照相化学有限公司)中漂洗至图像清晰，最后在清水中冲洗，晾干，用扫描仪扫描图像。此次研究主要为验证提取的沉淀是否为外泌体蛋白，故未做定量分析。
1.4.5   纳米粒子跟踪分析   外泌体在PBS中稀释，使用纳米颗粒跟踪分析仪(ZetaView，Particle Matrix，Meersbusch，Germany)确定外泌体的粒径、分布。该系统通过跟踪单粒子的布朗运动[14]，确定单粒子的流体动力半径，即可获得外泌体的大小和分布。
1.4.6   液相色谱串联质谱   每个样品取50 μg外泌体蛋白，置于EP管中，加入终浓度为10 mmol/L二硫苏糖醇，37 ℃处理1 h，然后冷却至室温，加入终浓度为30 mmol/L碘乙酰胺，室温放置3 min；用50 mmol/L的三乙基碳酸铵重悬，样品中加入胰酶(胰酶∶蛋白=1∶25)37 ℃恒温过夜；然后加入1%甲酸终止酶切，之后用C18层析柱脱盐，回收后的样品经过冻干，于-80 ℃保存。冻干样品用20 μL 2%甲醇、0.1%甲酸复溶；12 000 r/min离心10 min，吸取上清上样，上样体积10 μL，采取夹心法上样。液相色谱-质谱联用检测系统由纳米高效液相色谱仪(HPLC)(Thermo Scientific EASY-nLC 1000系统)与Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher)和纳米电喷雾离子源(Thermo Fisher)组成。液相色谱柱采用120 min线性梯度填充。产生的质谱原始文件采用MaxQuant软件处理。
1.4.7   蛋白质鉴定   使用MaxQuant搜索数据库进行蛋白质鉴定，在人类蛋白数据库中检索(Uniport，Homo sapiens)，检索允许的最大碎片质量公差为± 20 ppm。半胱氨酸的氨基甲基化被设定为固定修饰，而蛋氨酸的氧化、蛋白质N端乙酰化被设定为可变修饰，允许2次酶切遗漏错误发现率(false discovery rate，FDR)为1%。
1.5   主要观察指标   ①脑脊液中是否能分离出外泌体；②Western blot鉴定外泌体标志性蛋白；③质谱检测分析外泌体蛋白组学特征；④富集分析蛋白质功能。
1.6   统计学分析   使用FunRich(3.1.3)进行GO(Gene ontology)富集分析[15]，并预测蛋白来源和蛋白结构域。通过比对CTD(Comparative Toxicogenomics Database)数据库[16]，预测脑脊液外泌体蛋白与脑瘫疾病的关系。文献文本挖掘(textmining)在DISEASES数据库中完成[17]。外泌体的脑组织来源预测分析通过Allen Brain Altals 数据库的R包ABAEnrichmen实现[18]。用R包VennDiagram and eulerr分析生成韦恩图，用ggplot2和ggrepel生成蛋白差异表达火山图。文章统计学方法已经通过北京中医药大学生物统计学专家审核。

研究发现脑瘫儿童脑脊液中存在外泌体，与成年人脑脊液的研究结果类似[23]。透射电镜观察结果显示样品中有球形囊泡，囊泡膜连续，大小和形状各异。Western blot结果显示，Syntenin-1(SDCBP)表达阳性，该蛋白在外泌体释放中发挥作用[11，21，24]；Flotillin-1(FLOT1)表达呈阳性，这是一种高度保守的脂筏标记蛋白[25]。纳米颗粒跟踪分析是一种应用广泛的基于布朗运动原理的精确测定液体中小泡大小分布和浓度的技术[26]。与使用激光束来可视化囊泡的传统显微镜相比，纳米颗粒跟踪分析使用激光散射视频显微镜来跟踪单个囊泡并确定其直径[14]。脑瘫患者脑脊液的外泌体浓度范围为3.6×1011 L-1-53×1011 L-1，这与已发表的一项研究结果一致[13]，即健康和创伤后脑损伤患者脑脊液的外泌体浓度范围为13.09×1011 L-1-33.57×1011 L-1。

脑脊液外泌体蛋白生物标志物研究的困难是临床样本较难获取。作者曾尝试通过超速离心分离了单个患者脑脊液的外泌体，但无法收集到足够的蛋白进行LC-MS/MS分析。因此通过同组脑脊液样本的混样分离外泌体，虽然此次研究还没有单个患者的蛋白质组学数据，但作为早期的探索性研究还是提供了很多的研究证据。该研究结果提示主要的污染蛋白是免疫球蛋白，这是超速离心方法本身难以避免的[27]。该研究样本中富含外泌体标记物，包括浮舰蛋白、膜联蛋白、四次穿膜蛋白、热休克蛋白、ESCRT相关蛋白和液泡蛋白分拣相关蛋白。与已发表的脑脊液蛋白质组数据集相比，该研究的蛋白质数据集与其他脑脊液研究的数据集相似性不高，仅有17%或36%，其原因可能与患者年龄、临床样本差异、分离方法及外泌体异质性有关，这也说明有必要对于不同病理样本进行更深入的研究。

GO富集分析的结果与这些发现一致。对于细胞成分，样本主要涉及外泌体囊泡；在分子功能方面，富集于细胞外基质成分，这也与外泌体的特点相关；生物过程表明外泌体参与了免疫应答、细胞生长以及蛋白质代谢等过程。

脑瘫症状与脑组织异常发育密切相关。该研究的脑脊液样本来自于儿童，与成年人不同的是儿童大脑自身在发育变化，因此在研究蛋白质组时采用了相应的儿童相关的脑区数据库进行富集，即Allen Brain Atlas 3-11岁发育基因表达数据库。外泌体蛋白主要富集到额叶新皮质、前额叶皮质、背外侧前额叶皮质、初级运动皮质(M1区，4区)等脑部区域。有研究表明，前额叶皮质在运动技能刺激的计划和执行中起主导作用，脑瘫儿童的前额叶皮质会过度激活兴奋，与双手协调和运动等行为异常相关[28-29]。此外，脑瘫儿童的初级运动皮质细胞结构发育紊乱，导致无法保持直立姿势[30]；运动皮质的损伤对运动及可塑性的发展产生不利影响[31]；同时运动皮质异常激活也是监测脑瘫患儿运动异常[32]、治疗的重要指标[33]。外泌体蛋白富集到这些脑部区域，可能与这些大脑区域的异常兴奋有关，过度活跃的脑区可能引起更多外泌体的释放。

结合已发表的脑瘫研究，作者发现一些关键蛋白也存在脑脊液外泌体中。ApoE是一种中枢神经系统脂蛋白，它的某些等位基因可能与脑瘫形成有关，并可能与这些患者的某些临床表现有关[34-35]，基质金属蛋白酶9可能参与脑瘫的神经自我损伤[36]。此外，还有研究表明LAMC1可能与脑瘫儿童神经系统发育相关[37]。

脑瘫患者的特点是明显的神经发育障碍，上述数据提示外泌体可能参与了脑瘫的病理过程，并且脑脊液来源外泌体可能包含反映神经发育疾病程度的生物标记物。目前的研究大多样本量较少，需要进一步从大样本研究中确认这些外泌体蛋白在脑瘫发病机制中的潜在作用。

当前，报道儿童脑瘫患者脑脊液外泌体和外泌体蛋白质组学的研究极少。该研究表明脑脊液中确有外泌体存在，蛋白质组学和Western blot也提示它们含有外泌体标志蛋白。通过蛋白质组学和后续生物信息学分析，发现这些外泌体蛋白可能来源不同的脑区，其中一些蛋白(或基因)在已发表的脑瘫研究中被提及，可能与脑瘫的发生和发展相关，可能参与了某些重要的生理病理过程，有成为脑瘫早期诊断或治疗新靶点的潜在可能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
脑瘫：脑瘫全称为脑性瘫痪，指出生前至出生后早期，脑发育未成熟阶段受到永久、非进行性损伤，形成以运动障碍和姿势异常为主的综合征。
外泌体：是指包含了复杂 RNA 和蛋白质的小膜泡(30-150 nm)，现今，其特指直径在40-100 nm的盘状囊泡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

近年来外泌体在神经系统中的作用越来越受到重视，其中脑脊液外泌体相关的研究多集中在阿尔茨海默病，截止目前，未检索到专门对痉挛型脑瘫患者脑脊液外泌体的研究。该研究通过超速离心法研究方法获得脑瘫患者脑脊液外泌体，并进行了蛋白质组学鉴定，初步了解脑瘫患者外泌体的组成特点，为更深入全面的研究提供了可靠依据。目前鉴定方法需要较多的样本量，但随着新方法和更先进设备的出现，将来少量脑脊液即可鉴定脑脊液外泌体。下一步将在此基础上开展动物和临床研究，希望早日全面揭示脑脊液外泌体在脑瘫中的作用机制。

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