2.1   实验动物数量分析   46只大鼠全部进入结果分析。
2.2   造模及大鼠一般情况   给药4周后，模型组大鼠较正常组精神状态差，使用重复测量方差分析0，1，2，3，4周小鼠的体质量、饮水量、摄食量，结果显示：小鼠体质量、饮水量、摄食量的组内、组间、交互效应均有统计学意义(P < 0.001)，即每组内小鼠体质量、饮水量、摄食量均随着时间的变化而增高；且6组间小鼠体质量、饮水量、摄食量变化趋势的差异有统计学意义(P < 0.001)，且时间和组间效应间存在交互作用(P < 0.001)，见表2。使用重复测量方差分析0，1，2，3，4周大鼠的血糖变化，结果显示0，1，2，3，4周大鼠血糖水平随着时间延长而降低(P < 0.001)，且时间和组间效应间存在交互作用(P < 0.001)，见表3。







2.3   各组大鼠血清炎症因子水平变化    见表4。

6组间白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α、高敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白水平比较差异均有显著性意义(P < 0.001)。使用LSD检验进一步两两比较发现，与正常组相比，其他5组大鼠血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、高敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白水平升高(P < 0.05)，白细胞介素18水平降低(P < 0.05)。与模型组相比，中、高剂量组及西药组大鼠血清中白细胞介素6、白细胞介素18、高敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白水平降低(P < 0.05)。与低剂量组相比，中、高剂量组及西药组大鼠血清中白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α、髓鞘碱性蛋白降低(P < 0.05)。与中剂量组相比，高剂量组和西药组大鼠血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、超敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白水平降低(P < 0.05)。
2.4   各组大鼠坐骨神经节中JNK、p-JNK蛋白及JNK mRNA表达的变化   见表5。

与正常组相比，其他5组p-JNK蛋白表达及JNK mRNA表达水平均增高(P < 0.05)；与模型组相比，中、高剂量组及西药组p-JNK蛋白及JNK mRNA表达水平均降低(P < 0.05)；与低剂量组相比，高剂量组及西药组p-JNK蛋白及JNK mRNA表达水平均降低(P < 0.05)；与中剂量组相比，西药组p-JNK蛋白及JNK mRNA表达水平均降低(P < 0.05)，见图1。



2.5   各组大鼠神经传导速度的比较   与正常组相比，其他5组大鼠的感觉神经传导速度降低(P < 0.05)；与模型组相比，中、高剂量组和西药组大鼠的感觉神经传导速度升高(P < 0.05)；与低、中剂量组相比，高剂量组和西药组大鼠的感觉神经传导速度升高(P < 0.05)，见表6。

与正常组相比，模型组、低剂量组大鼠的运动神经传导速度降低(P < 0.05)；与模型组相比，高剂量组、西药大鼠的运动神经传导速度升高(P < 0.05)。

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糖尿病作为一种复杂的慢性疾病已成为全球公共卫生问题，有研究表明全世界目前有4.2亿的人口患有糖尿病，至2040年这一数字将达到6.4亿[1]，2020年的统计结果显示美国有3 420万糖尿病患者，占人口的10.5%。中国的糖尿病数据也不容乐观，据估计中国约有糖尿病患者1.1亿[2]。糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一，糖尿病病程超过10年者糖尿病周围神经病变的发病率高达90%，严重影响患者的生活质量，是导致糖尿病患者足部溃烂、感染、坏疽甚至截肢的危险因素[3]。研究发现低水平炎症反应在糖尿病及其慢性并发症的发生发展中起重要作用[4-6]，而糖尿病周围神经病变的发生与炎性因子密切相关，糖尿病周围神经病变患者血清中白细胞介素6、肿瘤坏死因子α较无该病症2型糖尿病患者升高[7]，炎性因子升高可以导致JNK信号转导通路的异常激活，引起细胞凋亡、胰岛素抵抗、炎症反应等病理过程[8]。

温通活血乳膏为新疆医科大学附属中医医院院内制剂，多年来基于温通活血乳膏的临床及实验研究证实该方可以抑制炎性因子、降低血黏度、改善微循环，减轻或改善糖尿病周围神经损伤[9]。此次实验建立糖尿病周围神经病变大鼠模型，观察糖尿病周围神经病变大鼠血清炎性因子及坐骨神经JNK通路相关蛋白的变化，从JNK信号转导通路的角度探讨温通活血乳膏治疗糖尿病周围神经病变炎症的作用机制，旨在为临床诊疗糖尿病周围神经病变提供依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较使用LSD检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年4-8月在新疆医科大学动物实验中心进行。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   8周龄健康雄性Wistar大鼠，清洁级，体质量(200±20) g，购自湖南省实验动物研究中心，生产许可证号：SCXK(鄂)2020-0018，动物合格证号：42000600037903。在清洁级(SPP级)条件下饲养，恒温(20±2)℃、自然光线，自由饮水、自由摄食条件下适应性喂养1周。动物实验已通过新疆医科大学动物实验管理中心伦理委员会批准(IACUC202101113-01)。
1.3.2   主要试剂与药物   ①温通活血乳膏，性状：棕黄色软膏，批号：20130113。含量：每1 mL含生药1.5 g，主要由川穹、细辛、白芷、地龙等药组成，由新医科大学附属中医医院药学实验室提供。②空白乳膏，性状：白色软膏，由制成温通活血乳膏的基质(包括硬脂酸，单硬脂酸甘油酯，氮酮和羟基苯乙酯)制成，由新疆医科大学附属中医医院药学实验室提供。③试剂：白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α、超敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白酶联免疫分析试剂盒由伊莱瑞特公司提供。兔多抗JNK(46，54 kD)、兔单抗p-JNK(thr183/tyr185)(46，54 kD)由Cell signaling提供。Trizol试剂由Ambion公司提供。反转录试剂盒由VAZYME公司提供。PCR试剂盒由天一辉远提供。④弥可保[ɑ-(5，6-二甲基苯并咪唑基)-Co-甲基-钴胺酰胺]，购自卫材药业。
1.4   实验方法   
1.4.1   动物造模   根据前期实验结果建立糖尿病周围神经病变大鼠模型[10]。

糖尿病大鼠模型的建立：模型组50只大鼠喂以高糖高脂饲料4周(其中含10%蔗糖、10%猪油、5%胆固醇)诱发出胰岛素抵抗。继以小剂量链脲佐菌素30 mg/kg(将链脲佐菌素溶于0.1 mol/L、pH=4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，将链脲佐菌素配制为1%的溶液)经0.22 µm的微孔滤膜过滤除菌后，于大鼠禁食14 h腹腔注射，72 h后从尾静脉采血。用拜安捷2血糖仪测定空腹血糖，血糖≥13.8 mmol/L确定为糖尿病大鼠，纳入实验。正常组6只(喂以标准颗粒饲料)和造模组大鼠分别分笼饲养，自由进食和饮水。

糖尿病周围神经病变大鼠模型的建立：糖尿病大鼠造模成功后，模型组继续喂以高糖高脂饲料8周，正常组喂以标准颗粒饲料8周。应用Meditronie关键点-4工作站肌电图仪测定大鼠下肢坐骨神经的感觉和运动传导速度，当感觉或运动传导速度减慢超过11%，即可判定为成功的糖尿病周围神经病变鼠模型。

1.4.2   实验分组及给药   根据随机数字法，将40只糖尿病周围神经病变造模成功的大鼠分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、西药组，每组8只。另设6只Wistar大鼠为正常组，不造模不给药。

给药方法：西药组每天灌胃给予弥可保0.14 mg/kg，连续灌胃28 d。将后肢脱毛，24 h后开始涂抹给药，模型组与西药组涂抹空白乳膏2 mL，低、中、高剂量组分别涂抹0.75，1.5，3.0 g/mL的温通活血乳膏2 mL，给药时依据大鼠体质量进行，生药1 g/kg，每日早晚2次给药，连续给药28 d。用药期间所有大鼠予标准饲料喂养，自由进食和水。
1.5   主要观察指标 
1.5.1   一般情况   包括大鼠的精神状态、摄食、饮水量、体质量及日常活动情况等，在治疗前、治疗后每周尾静脉取血，用德国拜耳公司拜安捷2血糖仪测定血糖水平。
1.5.2   神经传导速度   末次给药后，麻醉后俯卧位固定大鼠：①将刺激针电极置于坐骨切迹处的坐骨神经传出部位，记录电极置于踝关节坐骨神经经过部位，刺激电极与记录电极之间 1 cm 处放置参考电极。使用波宽0.1 ms、刺激强度1.5倍阈值的单脉冲方波刺激，计算机记录从刺激神经开始到远端肌肉出现动作电位的时间，即潜伏期。测定刺激电极到记录电极之间的距离。坐骨结节到踝关节处的运动神经传导速度(m/s)=刺激电极与记录电极之间的距离/潜伏期。②将刺激电极与记录电极分别置于尾部远端及近端，记录电极距离刺激点2.0-3.0 cm，刺激量从较小逐渐增加。感觉神经传导速度(m/s)=复合动作电位传导的距离/复合动作电位出现的潜伏期。
1.5.3   炎症因子水平   末次给药后，戊巴比妥注射液腹腔注射(100 mg/kg)麻醉大鼠，腹主动脉采血8-10 mL，分离血清，采用ELISA法检测血清中白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α、高敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白的水平。按照试剂盒说明要求操作。
1.5.4   Western blot 法检测坐骨神经节中JNK、p-JNK蛋白表达   血液抽取完成后麻醉处死大鼠，取大鼠左侧坐骨神经，提取总蛋白，于聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶中进行电泳，电转移到聚偏二氟乙烯膜；加入封闭液(含5%脱脂奶粉)室温封闭2 h；封闭结束后分别加入JNK、p-NK和GAPDH一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；加入二抗(1∶50 000)，显影，用凝胶分析软件(BandScan)对条带进行扫描，分析条带中各蛋白的灰度值。
1.5.5   RT-PCR法测定JNK mRNA表达   取冰冻大鼠左侧坐骨神经组织100 mg，采用Trizol 法提取总RNA，反转录反应提取总RNA样品，调制20 μL反应体系[总RNA 5 μL，Oligo(dT)18 2 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL，5×Hiscript Buffer 4 μL，Hiscript Reverse Transcriptase 1 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，加入ddH2O配至20 μL]，轻混匀，25 ℃孵育5 min，50 ℃孵育15 min，85 ℃加热5 min，4 ℃孵育10 min，cDNA第一链合成；制备20 μL PCR反应液(SYBR Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye 20.4 μL，0.4 μL引物上游，0.4 μL引物下游，4 μL cDNA，4.8 μL H2O)，JNK及内参GAPDH 引物序列见表1，聚合酶链反应扩增条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。绘制熔解曲线，最终数据以2-ΔΔCt进行分析。

1.6   统计学分析   定量资料使用x±s进行描述，使用重复测量方差分析多次测量的定量指标(体质量、饮水量、摄食量、血糖)，使用单因素方差分析ELASA、Westen blot、RT-PCR检测结果，组间使用LSD方法进行两两比较。使用SAS JMP 10.0软件，检验水准选择双侧α=0.05。该文统计学方法已经新疆医科大学附属中医医院生物统计学专家审核。
1.7   出版规范   该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

糖尿病周围神经病变主要表现为高血糖、四肢远端对称性感觉、运动神经障碍，肌肉组织功能丧失，运动能力降低，这些临床表现会引起患者的负面效应，增加家庭负担[11]。目前大量的临床研究表明，糖尿病周围神经病变患者的运动神经传导速度和感觉神经传导速度显著降低[12-13]。针对这个临床病理变化，普遍采取神经传导速度测定和血糖检测的手段来验证糖尿病周围神经病变模型建立成功与否。大量研究表明，高脂饮食结合链脲佐菌素注射是目前普遍认可的糖尿病周围神经病变造模手段，成功率高、死亡率低[14-15]。此次实验结果显示，模型组的血糖水平显著升高，感觉神经传导速度和运动神经传导速度显著降低，在不同剂量的温通活血乳膏干预后，模型大鼠的血糖发生一定程度的改善现象，神经传导速度有所增加，这与徐利娟和冯程程等[16-17]的研究结果一致。但是在血糖控制方面，中剂量组的控制效果最佳，而在神经传导速度方面，高剂量组的药效最为显著，在临床运用可能需要根据患者的具体情况，酌情调整剂量以达到最佳的治疗效果。这些数据表明了温通活血乳膏可以降低血糖、改善神经损伤、恢复神经传导速度。

在机制研究方面，目前认为糖尿病周围神经病变的发病机制可能与代谢紊乱引起的氧化应激、线粒体功能障碍等机制有关[18-19]，而炎症机制与糖尿病周围神经病变的关系也非常密切，是糖尿病周围神经病变发病的主要机制[20]。有相关报道阐明，在糖尿病周围神经病变大鼠模型中，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达水平较正常大鼠显著升高，表明炎症反应与大鼠糖尿病周围神经病变的发生发展有着密切联系[21-22]。超敏C-反应蛋白是受炎性因子刺激调控在肝组织细胞内合成的一类蛋白质，该分子属于非特异性炎症分子，不受个体差异、药物、状态等因素影响，在炎症期会出现明显的高表达现象[23]。糖尿病周围神经病变发生过程中会出现慢性炎症反应，进而影响超敏C-反应蛋白的表达，加剧周围神经的损伤[24]。髓鞘碱性蛋白是神经髓鞘脂蛋白，在神经髓鞘起到合成功能，也被作为糖尿病周围神经病变的检测指标[25]。温通活血乳膏作为院内制剂，经过数十年的验证其疗效确切，可以明显改善糖尿病周围神经病变患者四肢疼痛、手足麻木等不适症状。此次实验结果显示，模型组中白细胞介素6、白细胞介素18、肿瘤坏死因子α、超敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白的表达水平显著升高，温通活血乳膏干预后这些指标表达量都明显降低，这表明了温通活血乳膏可以通过抑制糖尿病周围神经病变大鼠机体炎症反应来改善糖尿病周围神经病变症状。

JNK家族是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在神经轴突损伤情况下可导致JNK信号通路的活化。此次实验结果显示，模型组大鼠的JNK和p-JNK蛋白及JNK mRNA表达水平明显升高，在温通活血乳膏干预后可显著降低其表达水平。JNK信号通路的始动因素包含肿瘤坏死因子α、白细胞介素1等炎性因子。在胆囊癌组织中肿瘤坏死因子α可通过JNK通路来增强启动子的活性和基因蛋白的表达[26]，肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6和白细胞介素10等炎症因子的下调可通过抑制小胶质细胞JNK信号通路的激活来预防或延缓神经退行性疾病[27]。高糖条件下，细胞内炎性因子分泌增加，JNK信号转导通路被激活，产生级联反应，JNK激酶与c-jun的蛋白结构域相结合，迅速磷酸化，转录功能增强，可增强下游相关基因的表达，使周围神经产生一系列的应答反应，用药后减少该信号转导因子的表达量，缓解糖尿病周围神经病变的各种症状，与此次实验结果一致，提示JNK信号转导通路激活可能是糖尿病周围神经病变的发病机制之一。

中医认为气血不足、痰湿阻络、脉络瘀阻是糖尿病周围神经病变发病的病机关键，并贯穿于疾病的始终，临床辨治加活血化瘀药亦每收良效。温通活血乳膏由川芎、红花、桂枝、地龙等药物制成，具有活血化瘀、通络止痛之功效。现代药理研究表明，川芎及其提取物可直接扩张周围血管，提高血管血流量，改善微循环；红花中含有红花甙、红花黄色素等成分，具有低血黏度、扩张血管、改善微循环的作用[16-17]，基于微循环的改善，改善神经细胞缺血缺氧状态；方中桂枝主要含有桂皮醛、β-荜澄茄烯等成分，具有缓解疼痛的作用；且药物中加入促透皮吸收剂月桂氮卓酮，可以显著促进大多数亲水性和疏水性化合物的透皮吸收作用，使透皮效率增加，确保了药物的吸收。综上所述，温通活血乳膏通过皮肤入血，明显改善糖尿病周围神经病变大鼠周围神经的功能，降低糖尿病周围神经病变大鼠血清白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α、超敏C-反应蛋白、髓鞘碱性蛋白的水平，并在一定程度下调JNK、p-JNK的蛋白及JNK mRNA的表达，提示温通活血乳膏可以通过抑制JNK信号通路及炎症反应改善改善糖尿病周围神经病变周围神经的功其作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
JNK：为一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是哺乳动物体内丝裂原活化蛋白激酶超家族的一员，JNK磷酸化后可以激活JNK信号通路，在机体细胞增殖、分化、凋亡、氧化应激等过程中都具有显著的影响，可以在糖尿病周围神经病变过程中降低免疫功能，诱导炎症因子释放。
超敏C-反应蛋白：为一种敏感性高而特异性低的炎性指标，在炎性因子作用下由肝上皮细胞合成，其可刺激血管内皮因子释放，使微血管基膜增厚，继而引起供应神经组织的血流减少，周围神经神经元及髓鞘受到损伤，使神经发生病变的速度增加，在糖尿病周围神经病变中起着重要监测作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

糖尿病周围神经病变研究的关注点主要在持续的高血糖、晚期糖基化终末产物、多元醇旁路亢进、炎症因子等研究，而关于中药外用治疗糖尿病周围神经病变集中在免疫介导炎症反应的研究目前还是热点领域的“真空地带”。此次研究不局限于现代绝大多数对代谢紊乱、遗传因素、细胞因子、氧化应激等多个环节的研究，而是将重点集中在免疫介导炎症因子的表达研究之上，将炎症机制作为中药外用治疗糖尿病周围神经病变的研究方向，探索中药外用治疗糖尿病周围神经病变新的治疗靶点和作用机制，并以中药外用治疗糖尿病周围神经病变慢性、低度炎症机制中JNK在大鼠背根神经的表达为重点研究对象。该项目的研究成果将为今后该领域的研究提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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