高压氧促进骨形成加速骨折愈合

doi:10.12307/2022.833

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (26): 4136-4140.doi: 10.12307/2022.833

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高压氧促进骨形成加速骨折愈合

余雪1，李小峰2，舒克钢3，吴立蔚3，王勇麟3，吕定康3，周安远3，梁朝鑫4，杨渊5

1桂林市人民医院，广西壮族自治区桂林市 541002；2广西骨伤医院，广西壮族自治区南宁市 530016；3广西医科大学，广西壮族自治区南宁市 530021；4广西中医药大学，广西壮族自治区南宁市 530200；5广西医大开元埌东医院，广西壮族自治区南宁市 530021

收稿日期:2021-10-08 接受日期:2021-12-10 出版日期:2022-09-18 发布日期:2022-03-07
通讯作者: 杨渊，主任医师，广西医大开元埌东医院，广西壮族自治区南宁市 530021
作者简介:余雪，1968年生，1990年广西医科大学毕业，副主任医师，主要从事高压氧相关的临床与实验研究。
基金资助:
广西自然科学基金项目(2019JJA140664 )，项目负责人：杨渊；广西壮族自治区卫生和计划生育委员会计划课题(Z20180803)，项目负责人：余雪；广西壮族自治区卫生和计划生育委员会计划课题(Z20180229)，项目负责人：李小峰

Hyperbaric oxygen improves fracture healing by promoting osteoblast proliferation

Yu Xue1, Li Xiaofeng2, Shu Kegang3, Wu Liwei3, Wang Yonglin3, Lyu Dingkang3, Zhou Anyuan3, Liang Chaoxin4, Yang Yuan5

1Guilin People’s Hospital, Guilin 541002, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2Guangxi Bone Injury Hospital, Nanning 530016, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 3Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 4Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 5Guangxi Medical University Kaiyuan Langdong Hospital, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2021-10-08 Accepted:2021-12-10 Online:2022-09-18 Published:2022-03-07
Contact: Yang Yuan, Chief physician, Guangxi Medical University Kaiyuan Langdong Hospital, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Yu Xue, Associate chief physician, Guilin People’s Hospital, Guilin 541002, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2019JJA140664 (to YY); Guangxi Zhuang Autonomous Region Health and Family Planning Commission Project, No. Z20180803 (to YX); the Plan Project of the Health and Family Planning Commission of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. Z20180229 (to LXF)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
血清骨钙素：是成骨细胞合成并分泌的一种维生素K依赖性钙结合蛋白，比较稳定，不受骨吸收因素的影响。通过血清骨钙素水平可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态。
血清Ⅰ型胶原C端肽：Ⅰ型胶原作为骨骼组织中唯一的胶原成分，在骨基质中的比例达到了90%以上，在骨骼重塑过程中，Ⅰ型胶原逐渐降解成各种不同的小片段，然后入血，其中Ⅰ型胶原C端肽由于其优越的特异性以及不可再降解性被用来作为骨吸收的重要指标之一。

背景：尽管大多数骨折能够治愈，但仍有5%-10%最后发展为骨不连，临床试验证实高压氧可以通过血液循环显著提高体内动脉血氧分压，促使新陈代谢，加速骨愈合。
目的：探讨高压氧干预不同时间对家兔股骨骨折愈合的影响和相关机制。
方法：12只新西兰大白兔建立股骨骨折模型，随机分成高压氧治疗1个月组、高压氧治疗2个月组、常氧治疗1个月组、常氧治疗2个月组，每组3只。高压氧治疗组于术后第1天开始将所有动物置入高压氧动物仓中行高压氧治疗1，2个月，采用酶联免疫吸附法检测血清骨钙素、Ⅰ型胶原C端肽水平，苏木精-伊红染色观察骨折愈合情况。
结果与结论：①治疗1个月时，高压氧组血清骨钙素、Ⅰ型胶原C端肽水平与常氧组无明显差异(P > 0.05)；治疗2个月时，与常氧组比较，高压氧组血清Ⅰ型胶原C端肽水平明显减少(P < 0.001)、骨钙素水平明显上升(P < 0.01)；②治疗1个月时，高压氧组与常氧组病理损伤程度无差异，治疗2个月时，高压氧组病理损伤程度较常氧组明显减轻；③结果表明，高压氧治疗2个月可有效提高骨形成指标骨钙素水平，提示可能促进成骨细胞形成进而对骨折愈合有积极作用。

https://orcid.org/0000-0003-1295-6918 (杨渊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 高压氧, 骨愈合, 骨钙素, Ⅰ型胶原C端肽, 股骨骨折

Abstract: BACKGROUND: Most fractures can be healed, 5%-10% of which will develop into nonunion. Clinical trials have confirmed that hyperbaric oxygen can accelerate fracture healing by significantly increasing the partial pressure of arterial oxygen via the blood circulation and promoting metabolism.
OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of hyperbaric oxygen intervention for different time on the healing of femoral fractures in rabbits.
METHODS: Twelve New Zealand white rabbits were selected to make femoral fracture models and randomly divided into a hyperbaric oxygen treatment group for 1 month, a hyperbaric oxygen treatment group for 2 months, a normoxia treatment group for 1 month, and a normoxia treatment group for 2 months (3 rabbits per group). In the hyperbaric oxygen treatment groups, all animals were placed in a hyperbaric animal cabin for hyperbaric oxygen treatment on the 1st day after modeling. After 1 and 2 months of treatment, enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of serum osteocalcin and type I collagen C-terminal peptide and hematoxylin-eosin staining was used to observe fracture healing.
RESULTS AND CONCLUSION: After 1 month of treatment, expression levels of osteocalcin and type I collagen C-terminal peptide in serum showed no significant difference between the hyperbaric oxygen treatment groups and normoxia treatment groups (P > 0.05). After 2 months of treatment, the serum level of type I collagen C-terminal peptide was significantly decreased (P < 0.001) and the serum level of osteocalcin was significantly increased (P < 0.01) in the hyperbaric oxygen treatment group than the normoxia treatment group. After 1 month of treatment, there was no difference in the severity of pathological injury between the hyperbaric oxygen treatment group and normoxia treatment group. Whereas, after 2 months of treatment, pathological injuries were significantly reduced in the hyperbaric oxygen treatment group compared with the normoxia treatment group. To conclude, hyperbaric oxygen treatment for 2 months can effectively increase the expression of osteocalcin, suggesting that it may promote the formation of osteoblasts and accelerate fracture healing.

Key words: hyperbaric oxygen, bone healing, osteocalcin, type I collagen C-terminal peptide, femoral fracture

中图分类号:

余雪, 李小峰, 舒克钢, 吴立蔚, 王勇麟, 吕定康, 周安远, 梁朝鑫, 杨渊. 高压氧促进骨形成加速骨折愈合[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(26): 4136-4140.

Yu Xue, Li Xiaofeng, Shu Kegang, Wu Liwei, Wang Yonglin, Lyu Dingkang, Zhou Anyuan, Liang Chaoxin, Yang Yuan. Hyperbaric oxygen improves fracture healing by promoting osteoblast proliferation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(26): 4136-4140.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 12只新西兰大白兔建立股骨骨折模型，实验过程中无死亡。
2.2 血清骨钙素、Ⅰ型胶原C端肽水平与常氧治疗1个月组相比，高压氧治疗1个月组新西兰大白兔血清中Ⅰ型胶原C端肽和骨钙素水平无显著差异。高压氧治疗2个月组新西兰大白兔血清中Ⅰ型胶原C端肽水平为(6 214.039±445.393) ng/L，常氧治疗2个月组新西兰大白兔血清中Ⅰ型胶原C端肽水平为(7 748.266±54.000) ng/L，两组比较差异有显著性意义(P < 0.001)；高压氧治疗2个月组新西兰大白兔血清中骨钙素水平为(2.672±0.183) ng/L，常氧治疗2个月组新西兰大白兔血清中骨钙素水平为(2.217±0.089) ng/L，差异有显著性意义(P < 0.01)，说明经过2个月的高压氧治疗后，骨吸收重要标志物Ⅰ型胶原C端肽明显下降以及骨形成重要标志物骨钙素明显上升，见图1。

2.3 大体观察骨折愈合情况在治疗1个月时，高压氧组骨折段有部分愈合，愈合处部分骨组织重塑，骨折处坏死组织基本被新生组织代替，但骨皮质尚未形成，骨折处尚未形成完整的骨性连接，部分骨痂没有被吸收，骨折端与正常的长骨处相比略粗；而常氧组骨折端有大量新生的组织增生，清除增生组织表层后见尚未完全骨化周围泛白中间呈淡蓝色的新生组织，其表面粗糙，散在分布着大小不规律的小孔，且新生未骨化的组织明显膨大。在治疗2个月时，高压氧组骨折处形成坚强的骨性连接，色泽和质地与正常的骨质相同，表面光滑坚硬，其大小与周围未骨折处长骨大小相同，完全恢复正常的骨结构；而常氧组骨折处形成膨大的新生组织，新生组织为韧性的结缔组织，部分样本有少许坏死组织相连，见图2。

2.4 组织学观察骨折愈合情况在治疗1个月时，高压氧组骨折连接处有大量成骨细胞增殖，但骨小梁尚未形成，机化的血痂尚未完全吸收，可见部分炎症细胞浸润，骨皮质不连续，尚未重塑；而常氧组未予以高压氧处理，骨折连接处有明显缝隙，细胞外基质不连续，伴大量纤维结缔组织增生和炎性细胞浸润，骨皮质缺如不连续伴部分坏死组织。在治疗2个月时，高压氧组骨质形成规则的骨小梁，骨皮质连续光滑完整，完全重塑；常氧组未予以高压氧治疗，骨折处形成大量致密纤维结缔组织，结缔组织外层有大量炎症细胞浸润，结缔组织深部未见骨组织形成，见图3。

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，组间比较采用单因素方差分析及q检验。
1.2 时间及地点实验于2020年9月至2021年3月在广西医科大学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物清洁级雄性新西兰大白兔12只，10周龄，体质量2 200-2 500 g，由广西医科大学动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(桂)2016-0054。实验方案经广西医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为202111001，实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 实验试剂兔骨代谢标志物Ⅰ型胶原C端肽以及骨形成标志物骨钙素的ELISA检测试剂盒(上海酶联公司)；青链霉素混合液、胰蛋白酶、PBS、苏木精-伊红染色试剂盒(北京索莱宝)；40 g/L多聚甲醛(Biosharp公司)。
1.3.3 实验设备高压氧舱(烟台宏远氧业有限公司，产品编号：03-Y900-001，广西医科大学动物实验中心提供)；超净工作台(苏州金燕净化设备有限公司)；倒置相差显微镜(OLYMPUS)；高速离心机(Eppendorf)；全波长酶标仪(Thermo Fisher Scientific)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物造模及干预 10周龄雄性新西兰大白兔随机分为高压氧治疗1个月组、高压氧治疗2个月组以及对应时间段的常氧治疗组，每组3只，予以3%戊巴比妥(3-5 mL/只)耳缘静脉注射麻醉，麻醉满意后手术区消毒铺巾，逐层切开皮肤，沿着肌肉间隙分离肌肉，充分暴露股骨中段，固定好股骨后，用高速电钻在股骨中下1/3处钻一大小为0.2 cm×1.0 cm的空隙建立骨折模型，生理盐水反复冲洗创面，复位肌肉，逐层缝合被切开的组织与皮肤[11]。术后均予青霉素80万U肌肉注射抗感染，连续1周，常规喂养。高压氧治疗组于术后第1天开始将所有动物置入高压氧动物仓中行高压氧治疗，准备就绪后缓慢升压至0.2 MPa稳压，氧体积分数在80%左右，高压氧疗法结束后缓慢均匀减压至常压，减压过程20 min，1次/d，持续给氧60 min[12]，直至处死动物当天结束。常氧治疗组放置在正常环境下呼吸常压空气。

1.4.2 ELISA实验方法高压氧治疗1，2个月，给予3%戊巴比妥麻醉后取左侧耳缘静脉血5 mL，3 500 r/min离心20 min，取其上清后根据ELISA试剂盒说明书检测Ⅰ型胶原C端肽和骨钙素水平，先加入标准品于反应孔，然后将待测样本稀释5倍后进入反应孔，加入50 μL生物素标记的抗体，盖上膜板，轻轻振荡混匀，37 ℃温育1 h，甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3次；每孔加入80 μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min，甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干，重复此操作3次，如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加1次；每孔加入底物A、B各50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃避光温育10 min；取出酶标板，迅速加入50 μL终止液，加入终止液后应立即检测结果，在450 nm波长处测定各孔的吸光度值。
1.4.3 苏木精-伊红染色采集血液后，将新西兰大白兔麻醉处死，取双下肢股骨，用40 g/L多聚甲醛固定至少1 d，取出浸泡在固定液中的组织放置在通风橱内，用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织贴好标签后依次放入脱水盒内；将脱水盒放进吊篮里于脱水机内用梯度乙醇依次进行脱水，脱水步骤如下：体积分数为75%乙醇4 h→体积分数为85%乙醇2 h→体积分数为90%乙醇2 h→体积分数为95%乙醇1 h→无水乙醇Ⅰ 30 min→无水乙醇Ⅱ30 min→醇苯5-10 min→二甲苯Ⅰ5-10 min→二甲苯Ⅱ 5-10 min→蜡Ⅰ 1 h→蜡Ⅱ 1 h→蜡Ⅲ 1 h；将有蜡的组织利用包埋机进行包埋，首先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签，于-20 ℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；将修整好的蜡块置于石蜡切片机上进行切片，每个切片的厚度为4 μm，切片漂浮于摊片机40 ℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60 ℃烘箱内烤片；待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
载玻片染色步骤如下：将切片放入二甲苯Ⅰ20 min→二甲苯Ⅱ20 min→无水乙醇Ⅰ10 min→无水乙醇Ⅱ10 min→体积分数为95%乙醇5 min→体积分数为90%乙醇5 min→体积分数为80%乙醇5 min→体积分数为70%乙醇5 min→蒸馏水洗。切片入苏木素染3-8 min，自来水洗，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗，0.6%氨水返蓝，流水冲洗，切片入伊红染液中染色2-4 min，将切片依次放入体积分数为95%乙醇Ⅰ 5 min →体积分数为95%乙醇Ⅱ5 min→无水乙醇Ⅰ5 min →无水乙醇Ⅱ5 min →二甲苯Ⅰ5 min →二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，将切片从二甲苯中拿出来稍晾干，中性树胶封固，最后利用光学显微镜收集图像并进行分析。
1.5 主要观察指标骨折愈合情况以及血清中骨钙素、Ⅰ型胶原C端肽水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料用x±s表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析及q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经广西医科大学生物统计教研室审核。

讨论

随着现今生活节奏的加快及高速交通工具以及体育运动的普及，骨折的发病率越来越高，骨折不愈合是骨折患者常见的晚期并发症，虽然目前医疗技术的发展，对于骨折的治疗方法越来越多，但是骨折不愈合或骨不连的发病率依旧居高不下[13]。骨折不愈合是指骨折后愈合过程或修复过程迟缓，在骨折端出现硬化、髓腔封闭或“假关节”样改变的骨愈合异常，为骨折临床治疗中的常见并发症和难题[14]，严重影响了治疗效果及发病后的生活质量，因此对促进骨折愈合方法的研究越来越受到人们的关注。高压氧辅助治疗在促进骨折愈合方面的效果已经得到普遍的肯定[15-16]。
高压氧治疗主要是增加血液携带氧气的能力从而起到治疗作用，有研究表明高压氧可以调节缺氧诱导因子从而提高氧分压，增加血氧以及组织氧含量，改善局部组织的缺氧状态[17]，可以增加骨折部位血氧的弥散量和弥散半径，提高骨痂内及髓腔内的氧分压，为骨组织提供较多的氧，以利于损伤骨组织的修复；提高组织的氧溶解能力，促进成骨细胞再生，加速新骨形成及骨再生[18]，也可以通过加强巨噬细胞和单核细胞的吞噬、消化能力，有利于清除坏死组织[19]，同时可缓解骨折的炎症反应，加速磷、钙等电解质沉积，促进胶原纤维的生成，进而提高血肿机化的速度[20]。吴东等[21]研究表明高压氧可以提高人源性成骨细胞的成骨分化能力。
众所周知，Ⅰ型胶原作为骨骼组织中唯一的胶原成分，在骨基质中的比例达到了90%以上，在骨骼重塑过程中，Ⅰ型胶原逐渐降解成各种不同的小片段，然后入血，其中Ⅰ型胶原C端肽由于其优越的特异性以及不可再降解性被用来作为骨吸收的重要指标之一[22]。骨钙素是主要由非增殖期成骨细胞特异合成分泌的一种非胶质骨蛋白，主要沉积在骨组织细胞外基质中，少部分进入血循环，通过肾脏排出体外[23]，其与成骨细胞活性呈正相关，可以反映人体内骨转化与骨形成情况[24]。该研究通过检测不同高压氧治疗时间段的兔血清中骨形成标志物骨钙素、骨代谢标志物Ⅰ型胶原C端肽水平[25-26]，结果显示经过1个月的高压氧治疗后，Ⅰ型胶原C端肽以及骨钙素水平均无明显变化，说明高压氧辅助治疗后其成骨效应与骨吸收现象在短时间内体现不明显，主要是因为毛细血管生成、细胞代谢、成骨细胞增殖、骨质愈合等过程需要一定的时间[27]，这与组织学表现一致，高压氧组骨折连接处有大量成骨细胞增殖，但骨小梁尚未形成，机化的血痂尚未完全吸收，可见部分炎症细胞浸润；而常氧组骨折连接处存在明显缝隙，大量纤维结缔组织增生和炎性细胞浸润，伴部分坏死组织，说明高压氧治疗早期，促进骨形成或者抑制骨吸收的生化指标表达不显著，但是其可以促进局部炎症反应的改善，促进成纤维细胞的生长，为骨痂的形成创造条件，促进软骨组织向骨组织的转化，有利于增加骨密度，提高骨折愈合率，这与赵子春等[10]研究结果一致。
高压氧治疗2个月后骨钙素水平明显上升，明显高于常氧组，主要原因可能为高压氧治疗提高了成骨细胞活性，加速了骨折愈合，其不受骨吸收因素的影响，直接反映了新形成的成骨细胞的活动状态。组织学观察显示高压氧治疗2个月后骨质形成规则的骨小梁，骨皮质连续，重塑良好。大体表现为骨折处形成坚强的骨性连接，色泽和质地与正常的骨质相同，完全恢复正常的骨结构。Ⅰ型胶原C端肽作为骨吸收的重要指标之一，其在高压氧治疗2个月后明显下降，与骨吸收的作用呈正相关，含量越低提示说明骨吸收作用越弱，相应的骨形成作用就越强。治疗2个月后的病理切片显示常氧组骨折处形成大量致密纤维结缔组织，结缔组织外层有大量炎症细胞浸润，结缔组织深部未见骨组织形成，大体观察见骨折处则形成大量致密纤维结缔组织，伴炎症细胞浸润，结缔组织深部未见骨组织形成。说明高压氧治疗可以提高骨折愈合率，减少骨性愈合时间，增强成骨细胞活性，抑制骨吸收，这与冯宗贤等[28-29]研究结果一致，也反映了骨形成标志物骨钙素、骨代谢标志物Ⅰ型胶原C端肽在骨折愈合过程中的表现与生物学表现相一致。
综上所述，高压氧治疗在骨折愈合过程可以促进中早期骨痂形成，减轻局部炎症反应，有利于增加骨密度，提高骨折愈合率，其作用机制可能是通过促进骨形成、抑制骨吸收，进而有效促进骨折的愈合。但是实验检测的指标有限，未能更深层次探讨高压氧促进骨愈合的分子生物学机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

高压氧促进骨形成加速骨折愈合

Hyperbaric oxygen improves fracture healing by promoting osteoblast proliferation

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[1]	吴冰霜, 汪志, 唐懿, 唐晓俞, 李棋. 前交叉韧带重建：从腱骨止点到腱骨愈合的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1293-1298.
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