缓释抗菌微球复合型组织工程材料水凝胶的制备及性能评价

doi:10.12307/2022.635

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (21): 3298-3305.doi: 10.12307/2022.635

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缓释抗菌微球复合型组织工程材料水凝胶的制备及性能评价

乐国平，席立成

柳州市工人医院/广西医科大学第四附属医院，广西壮族自治区柳州市 545005

收稿日期:2021-03-18 接受日期:2021-05-08 出版日期:2022-07-28 发布日期:2022-01-27
通讯作者: 席立成，硕士，医师，柳州市工人医院/广西医科大学第四附属医院，广西壮族自治区柳州市 545005
作者简介:乐国平，男，1980年生，湖北省荆州市人，汉族，2009年广西医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事人工关节置换及骨与软组织感染研究。
基金资助:
广西壮族自治区卫生健康委员会自筹经费科研课题(Z20190244)，项目负责人：乐国平

Preparation and performance evaluation of composite tissue-engineered material hydrogel with sustained-release antibacterial microspheres

Le Guoping, Xi Licheng

Liuzhou Worker Hospital/Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Liuzhou 545005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2021-03-18 Accepted:2021-05-08 Online:2022-07-28 Published:2022-01-27
Contact: Xi Licheng, Master, Physician, Liuzhou Worker Hospital/Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Liuzhou 545005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Le Guoping, MD, Associate chief physician, Liuzhou Worker Hospital/Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Liuzhou 545005, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
Self-Funded Scientific Research Project of Guangxi Zhuang Autonomous Region Health Committee, No. Z20190244 (to LGP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
水凝胶：是由水溶性高分子通过化学或物理交联形成的网状结构的交联聚合物。水凝胶作为一种局部用药的药物载体能够提供高表面积体积比和较大的载药量、高保水性能和生物相容性，并且其孔隙率等物理特性可以根据需求来设计，选择水凝胶来搭载大分子药物进行可调控的释放，是解决抗生素耐药简便可行的方法。
万古霉素：选择合适的抗生素是构建骨髓炎治疗的药物缓释系统的重点考虑因素之一。在药物释放系统中，目前应用最为广泛的药物为盐酸万古霉素，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌极为敏感，是目前临床治疗革兰阳性菌的最强有效抗菌药物。

背景：氧化羟丙基甲基纤维素-透明质酸钠水凝胶体系具有良好的力学性能、生物相容性与降解性，可作为组织工程支架对受损组织起保护支撑作用，也可作为药物载体实现局部缓释作用。
目的：制备缓释抗菌微球复合型组织工程材料水凝胶，研究其理化性能、生物学性能、骨诱导性能和抗菌性能。
方法：以聚乳酸乙醇酸共聚物、壳聚糖和透明质酸钠为材料，通过乳液法制备出具有多层结构的多孔微球载体，并对酸万古霉素进行负载，制备出抗菌缓释微球；以氧化羟丙基羧甲基纤维素和胺化透明质酸钠为基质制备成可注射水凝胶，并将不同质量浓度的抗菌缓释微球(0.1，0.2，0.3 g/mL)添加到水凝胶中，制备出载抗菌缓释微球的可注射水凝胶，对其理化性能(成胶时间测定、溶胀性能、降解性能)、生物学性能(细胞毒性、细胞溶血性)及成骨性能(碱性磷酸酶活性及诱导成骨基因RUN-x2、骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白、Ⅰ型胶原蛋白表达水平)、抗菌性能进行检测及评价。
结果与结论：①3种载抗菌缓释微球水凝胶具有良好的成胶性能与较小的溶胀比；体外降解扫描电镜结果显示，水凝胶具有稳定的自身降解性能；②细胞毒性实验显示，当抗菌缓释微球添加量≤0.2 g/mL时，水凝胶无明显的细胞毒性(7 d内细胞的相对增殖率均大于80%)；溶血实验显示，3种载抗菌缓释微球水凝胶的细胞溶血率小于2%，无明显细胞溶血；③3种载抗菌缓释微球水凝胶均可提高MG-63细胞中成骨基因RUN-x2、骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白含量及碱性磷酸酶的生成；④3种水凝胶均可持续、长期地抑制金黄色葡萄球菌的生长，并且随着抗菌缓释微球添加量的增加水凝胶的抗菌能力增强；⑤结果表明，制备的可注射载抗菌微球水凝胶具有良好的缓释抗菌及成骨、骨诱导能力，同时具备较好的生物组织相容性、可降解性。
缩略语：盐酸万古霉素@聚乳酸乙醇酸共聚物-壳聚糖-透明质酸钠/氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠：vancomycin@poly(lactic-co-glycolicacid)-chitosan-sodium hyaluronate/Oxidized hydroxypropyl methylcellulose-hydrazide-modified sodium hyaluronate，VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA

https://orcid.org/0000-0001-7002-599X (乐国平)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 抗菌微球, 盐酸万古霉素, 水凝胶, 性能, 聚乳酸乙醇酸共聚物, 壳聚糖, 透明质酸钠, 骨髓炎

Abstract: BACKGROUND: Oxidized hydroxypropyl methylcellulose-sodium hyaluronate hydrogel system exerts perfect mechanical properties, biocompatibility, and degradability, can be employed as a tissue engineered scaffold to protect and support injured tissues, and can also be applied as a drug carrier to achieve a regional sustained-release effect.
OBJECTIVE: To prepare sustained-release antibacterial microsphere composite tissue-engineered material hydrogel, and investigate its physical and chemical, biological, osteoinductive, and antibacterial properties.
METHODS: Using poly(lactic-co-glycolicacid), chitosan, and sodium hyaluronate as materials, a porous microsphere carrier with a multilayer structure was prepared by the emulsion method. Vancomycin hydrochloride was loaded to prepare sustained-release antibacterial microspheres. Oxidized hydroxypropyl methylcellulose-hydrazide-modified sodium hyaluronate was utilized as the matrix to prepare an injectable hydrogel. Different mass concentrations of antibacterial sustained-release microspheres (0.1, 0.2, and 0.3 g/mL) were added to the hydrogel to prepare an injectable hydrogel containing sustained-release antibacterial microspheres. The physical and chemical properties (determination of gel-forming time, swelling performance, degradation performance), biological properties (cytotoxicity, cell hemolysis), and osteogenic properties (alkaline phosphatase activity and osteogenic genes RUN-x2, bone morphogenetic protein 2, osteocalcin, type I collagen expression levels), and antibacterial properties were tested and evaluated.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The three kinds of sustained-release antibacterial microsphere hydrogels had good gel-forming properties and a small swelling ratio. The in vitro degradation scanning electron microscope results exhibited that the hydrogels had stable self-degradation properties. (2) The cytotoxicity experiment displayed that when the added number of sustained-release antibacterial microspheres was less than or equal to 0.2 g/mL, the hydrogel did not have remarkable cytotoxicity (the relative growth rate of cells within 7 days was all greater than 80%). The hemolysis experiment demonstrated that cell hemolysis rate of three kinds of the sustained-release antibacterial microsphere hydrogel was less than 2%, without obvious cell hemolysis. (3) Three kinds of sustained-release antibacterial microsphere hydrogels could increase the osteogenic gene RUN-x2, bone morphogenetic protein 2, type I collagen, osteocalcin contents, and alkaline phosphatase production in MG-63 cells. (4) These hydrogels could suppress the growth of Staphylococcus aureus continuously and for a long time, and the antibacterial ability of the hydrogels increased with the increased amount of sustained-release antibacterial microspheres. (5) These results show that the prepared injectable antibacterial microsphere hydrogel has perfect sustained-release antibacterial, osteogenic, and osteoinductive capabilities, as well as good biohistocompatibility and degradability.

Key words: antibacterial microsphere, vancomycin hydrochloride, hydrogel, property, poly(lactic-co-glycolicacid), chitosan, sodium hyaluronate, osteomyelitis

中图分类号:

乐国平, 席立成. 缓释抗菌微球复合型组织工程材料水凝胶的制备及性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(21): 3298-3305.

Le Guoping, Xi Licheng. Preparation and performance evaluation of composite tissue-engineered material hydrogel with sustained-release antibacterial microspheres[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(21): 3298-3305.

图/表（结果） 10

2.1 缓释抗菌微球复合水凝胶的成胶时间测试可注射水凝胶的成胶时间在3-7 min最为适宜[18-19]。VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA01、VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA02、VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA03的成胶时间分别为(244.0±16.7)，(249.0±12.5)，(251.0±16.4) s，3组复合水凝胶成胶时间均满足3-7 min的要求。缓释抗菌微球的加入对水凝胶的成胶时间有轻微影响，水凝胶中所含的微球的量越多成胶时间会有所增加，但差异不大(P > 0.05)。
2.2 缓释抗菌微球复合水凝胶的溶胀性能测试 3种缓释抗菌微球复合水凝胶在较短时间内达到溶胀平衡(约120 min)，溶胀比为3.66。缓释抗菌微球含量的不同可使水凝胶的溶胀比有所变化，但对水凝胶的溶胀性能影响不大，见图1。

2.3 氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠水凝胶的降解性能电镜扫描显示，随着时间的增加，氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠水凝胶的网状结构逐渐塌陷，孔洞的数目在进一步增多，水凝胶的完整性也被破坏，这表明水凝胶处于不断降解过程中，见图2。

2.4 缓释抗菌微球复合水凝胶的抗菌能力测试 3组缓释抗菌微球复合水凝胶第7天的杀菌率均达到90%，第14天时接近99%，在实验期间内(56 d)，3组的相对CFU仍小于1%，说明3组水凝胶均有良好的抗菌性能，见图3。

2.5 缓释抗菌微球复合水凝胶的抑菌实验 3组缓释抗菌微球复合水凝胶对金黄色葡萄球菌均具有较好的抑菌性能。随着天数的增加水凝胶抑菌圈直径增大，证明缓释抗菌微球复合水凝胶具有持续、长期的抗菌能力；3组间比较显示，当微球含量较高时抑菌效果更显著(P < 0.05)，见图4，表3。

2.6 缓释抗菌微球复合水凝胶的细胞毒性随着微球的添加量增大，缓释抗菌微球复合水凝胶的细胞毒性增加，其中VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA03组在第7天时的细胞相对增殖率低于80%，根据美国细胞毒性评价分级标准，说明当微球添加量达到0.3 g/mL时，缓释抗菌微球复合水凝胶存在轻度的细胞毒性；其余两组在培养期间内细胞相对增殖率均大于80%，说明当微球添加量≤0.2 g/mL时，微球缓释抗菌微球复合水凝胶无细胞毒性，见图5。

2.7 缓释抗菌微球复合水凝胶的溶血测试 3组缓释抗菌微球复合水凝胶的溶血率均小于2%，根据ASTM-F756标准中的要求[20]，溶血率为0%-2%被判定为不溶血，因此3种缓释抗菌微球复合水凝胶具有抵抗红细胞破裂的能力，且抗菌微球的添加量对水凝胶溶血率没有明显影响(P > 0.05)，见图6。

2.8 缓释抗菌微球复合水凝胶的成骨性能检测
碱性磷酸酶活性：碱性磷酸酶是分化成骨细胞的标志物，能促进骨基质的矿化。第3，7，14天时，3组缓释抗菌微球复合水凝胶的碱性磷酸酶活性值均有一定的增加，证明3组水凝胶均具有一定促进成骨分化的作用；并且3组的碱性磷酸酶活性值在各个时间点的差别不大(P > 0.05)，见图7，说明缓释抗菌微球的添加量对水凝胶的碱性磷酸酶活力无明显影响。

成骨相关基因表达：3组缓释抗菌微球复合水凝胶培养成骨细胞中的成骨基因RUN-x2、骨形态发生蛋白2、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白mRNA表达水平均高于对照组(P < 0.05)，说明缓释抗菌微球复合水凝胶具有明确的促进成骨分化作用；并且各组含有不同微球量的水凝胶之间各基因表达比较无明显差异(P > 0.05)，说明水凝胶中所含缓释抗菌微球的量对其促成骨分化能力影响不大，见图8。

2.9 缓释抗菌微球复合水凝胶的体外释放 3种缓释抗菌微球复合水凝胶在24 h内没有明显的突释效应，缓释抗菌微球复合水凝胶所释放的盐酸万古霉素质量浓度均高于盐酸万古霉最小抗菌浓度，见图9，说明3种缓释抗菌微球复合水凝胶均具有持续的抗菌性能。

2.10 材料生物相容性由细胞毒性实验可知，缓释抗菌微球复合水凝胶具有良好的组织相容性。

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引言

骨髓炎及骨髓炎合并骨缺损的治疗是临床的一大难题，传统治疗骨髓炎或骨组织感染主要采用抗生素经静脉给药治疗，然而大剂量、长时间经静脉使用抗生素后细菌耐药性不断上升，同时患者易出现各种药物毒副反应[1-2]。此外，骨髓炎患者的局部骨组织血供并不丰富，并且“血骨”屏障的存在导致了抗生素在骨组织局部渗透性差，经静脉使用后的抗生素在骨组织局部并不能达到有效的杀菌浓度[3]。为了更好地解决这一问题，局部抗生素缓释系统作为一种新的治疗模式出现了[4]。药物缓释系统是将药物负载在特殊材料上直接作用于局部，持续缓慢释放药物的一种新的给药系统，此种模式不仅能在血循环较差的局部骨组织中形成较高的抗生素有效杀菌浓度，同时也显著减少了药物的毒副反应[5]。骨水泥链珠作为局部不可降解生物载体负载抗生素治疗骨髓炎及骨软组织感染已经有数十年[6]，但仍存在一些缺陷使得骨水泥的应用也受到较大限制：如抗生素骨水泥珠或填充块存在明显突释现象[7]；骨水泥链珠在体内不能降解[8]，并且需二次手术取出等不利因素。
随着生物材料组织工程学的发展，可降解生物材料负载抗生素的缓释系统成为近年来研究的热点[9]。与传统不可降解载体比较，可降解缓释载体具有以下优势[9]：生物降解时间可以根据局部感染情况及局部修复所需时间进行设计，并且可降解生物载体在体内可自然降解，无需二次手术；宿主组织可完全填充材料降解后所留下的腔隙，部分此类载体还具有潜在的成骨性能，这样在治疗骨组织感染的同时能促进骨缺损的修复；可降解生物载体，使得抗生素的释放更加充分彻底高效。
人工合成生物可降解聚合物目前被认为是局部针对性治疗骨髓炎最具有潜力的药物载体之一。研究表明，聚乳酸乙醇酸共聚物同时具备较好的的吸附稳定性和机械强度，而且可以延长药物释放时间，已成为理想的药物载体[10]。可以通过调节丙交酯和乙交酯的比例来控制聚乳酸乙醇酸共聚物的分解速度，从而匹配骨髓炎或骨缺损中新骨形成所需时间，进而治疗骨髓炎、修复骨缺损[11]。壳聚糖是一种同时具有较好的生物黏附性、良好的生物相容性和特殊的药理活性的生物活性聚合物，它与成骨细胞具有很好的相容性，能促进创伤愈合及组织的重建。相关研究表明在一定的pH值条件下，透明质酸钠带负电荷，壳聚糖带正电荷，两者之间能够通过静电力相互吸引，形成离子键，从而增强复合材料的拉伸应力[12]，将透明质酸钠与壳聚糖进行混合可明显改善微球的力学性能。此外，由于透明质酸钠的持水性能优异，将透明质酸钠与聚乳酸乙醇酸共聚物、壳聚糖进行混合可改善聚乳酸乙醇酸共聚物降解时产生的酸性环境，有利于保护抗生素的抗菌性能，同时减慢微球的降解速度[13]。
水凝胶是一类可以在水中溶胀但不能溶解的交联高分子。可注射水凝胶的可注射性是其优点之一，通过注射的方式使用对于机体只产生微小的创伤，避免了复杂外科手术的干预。羟丙基羧甲基纤维素具有良好的水溶性、pH值稳定、保水性、黏附性和透明度高等特性，是目前常用制备水凝胶缓释剂型的材料。胺化透明质酸和氧化羟丙基甲基纤维素两者混合后分子链之间可以形成化学键，从而形成可注射水凝胶[14-15]，氧化羟丙基甲基纤维素-透明质酸钠水凝胶体系不仅克服了透明质酸钠力学性能差的不足，而且具有良好的生物相容性，可促进受损组织愈合，可作为组织工程支架对受损组织起保护支撑作用，另一方面也可作为药物载体实现局部缓释作用[16]。
实验将盐酸万古霉素负载于聚乳酸乙醇酸共聚物-壳聚糖-透明质酸钠微球中，制备出VA@PLGA-CS-HA抗菌缓释微球，同时以氧化羟丙基甲基纤维素和胺化透明质酸为基质制备成可注射水凝胶，并将负载抗菌药物的微球添加到水凝胶当中，制备出具有可降解和抗菌性能的缓释抗菌微球复合水凝胶盐酸万古霉素@聚乳酸乙醇酸共聚物-壳聚糖-透明质酸钠/氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠[vancomycin@poly(lactic-co-glycolicacid)-chitosan-sodiumhyaluronate/oxidized hydroxypropylmethylcellulose-Hydrazide-modified
sodiumhyaluronate，VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA]，并对所制得的缓释抗菌微球复合水凝胶的理化性能、生物学性能、抗菌性能及骨诱导性能进行检测和评价，以期为可降解抗生素负载的生物材料的临床应用提供重要理论基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计可注射载抗菌微球水凝胶的制备与表征，单因素方差分析，卡方检验。
1.2 时间及地点实验于2019年6月至2020年1月在广西医科大学第四附属医院完成。
1.3 材料羟丙基羧甲基纤维素(上海麦克林生化科技有限公司)；高碘酸钠溶液、成骨诱导液(天津市富宇化学试剂厂，质量浓度为100 g/L)；壳聚糖溶液、透明质酸钠溶液、己二酸二酰肼、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(上海麦克林生化科技有限公司)；聚乳酸乙醇酸共聚物(山东药学科学院中试厂)；三聚磷酸钠溶液(广州化工)；Luria-Bertani培养液、液体LB培养基(Sigma，德国)；CCK-8试剂盒(上海碧云天)；碱性磷酸酶试剂盒(Abcam公司)；电镜(XL30-ESEM，飞利浦)；酶标仪(Magellan公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 缓释抗菌微球复合水凝胶的制备
氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠可注射水凝胶的制备：①称取适量羟丙基羧甲基纤维素溶于蒸馏水中，配成质量浓度10%的羟丙基羧甲基纤维素溶液，然后按体积比V羟丙基羧甲基纤维溶液∶V高碘酸钠溶液=5∶1加入高碘酸钠溶液，在避光下加入等体积的乙二醇进行搅拌处理，蒸馏水透析3 d，制备出氧化羟丙基羧甲基纤维素，-50 ℃冷冻干燥；②称取一定量透明质酸钠配成质量浓度2%的溶液，然后加入1∶1己二酸二酰肼，调节pH值至4.7-4.8，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，调节pH值于4.7-4.8之间，蒸馏水透析48-72 h，制备出胺化透明质酸钠，-50 ℃冷冻干燥；③称取一定量的氧化羟丙基羧甲基纤维素和胺化透明质酸钠分别溶于蒸馏水，配成质量浓度为2%的溶液后等体积混合，制备氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠水凝胶。
制备缓释抗菌微球：①按体积比1∶5将盐酸万古霉素溶液(50 g/L)与聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液均匀混合5 min，进行超声(功率100 W，5 min)，形成W1/O乳液；②将壳聚糖溶液和质量浓度为3%的聚乙烯醇溶液按体积比1∶1混合均匀，形成壳聚糖/聚乙烯醇溶液；③将壳聚糖/聚乙烯醇溶液与W1/O乳液按体积比4∶1混合，形成稳定的W1/O/W2乳液；④量取与步骤②中所用壳聚糖溶液体积相当的透明质酸钠溶液，然后用加入0.4%的聚乙烯醇溶液，配制成透明质酸钠/聚乙烯醇溶液，使该溶液的总体积为W1/O/W2乳液体积的5倍；⑤将W1/O/W2乳液与透明质酸钠/聚乙烯醇溶液按体积比1∶5混合，室温下800 r/min机械搅拌1 h，45 ℃下1 000 r/min搅拌30 min，然后加入与步骤②中所用壳聚糖溶液体积相当的质量浓度为5%的三聚磷酸钠溶液，继续搅拌1.5 h，静置过夜，8 000 r/min离心 5 min，蒸馏水洗涤分散，8 000 r/min离心后收集沉淀，冷冻干燥，制成盐酸万古霉素@聚乳酸乙醇酸共聚物-壳聚糖-透明质酸钠微球。
制备缓释抗菌微球复合水凝胶：将微球按0.1，0.2，0.3 g/mL加入氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠可注射水凝胶中混匀，制得缓释抗菌微球水凝胶VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA，对应命名为VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA01、VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA02、VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA03。121 ℃高压灭菌。
1.4.2 缓释抗菌微球复合水凝胶的成胶时间测试量取同等体积的3种缓释抗菌微球复合水凝胶，用注射器吸取混合物并注射于小玻璃瓶中，当溶液不再流动时即为凝胶，记录所需时间。
1.4.3 缓释抗菌微球复合水凝胶的溶胀性能测试干燥后的3种缓释抗菌微球复合水凝胶样品称质量，记为md，置于离心管中，加入适量缓冲溶液(pH=7.4)，然后以150 r/min摇动(37 ℃恒温)。定时取样拭干水分，测量此时质量ms，凝胶的溶胀比计算公式：Q=ms/md。每个样品以3个平行样为一组。
1.4.4 缓释抗菌微球复合水凝胶的体外降解电镜扫描将不含抗菌微球的氧化羟丙基羧甲基纤维素-胺化透明质酸钠水凝胶浸于PBS中，置于摇床120 r/min摇动(37 ℃)。7，14，21，28 d取样，干燥至恒质量，扫描电镜下观察。
1.4.5 缓释抗菌微球复合水凝胶的抗菌能力与抑菌实验
抗菌能力测试：配制生理盐水及Luria-Bertani培养液，使用生理盐水将金黄色葡萄球菌菌液(S.aureus，Procell，武汉)稀释至浓度为105 CFU/mL。分别称取50 mg 3种缓释抗菌微球复合水凝胶样品，紫外灭菌处理后放入50 mL的锥形瓶中，加入1 mL去LB培养液和0.2 mL金黄色葡萄球菌菌液，将样品和菌液置于摇床内共培养(37 ℃，120 r/min)。与于设定的时间点取100 μL的混合液，采用培养基倾注法接种平皿，24 h后计算菌落数。计算抑菌率，计算公式如下：相对CFU(%)= CFU(24 h)/CFU(0 h)×100%。
抑菌实验：挑取复苏后的金黄色葡萄球菌单菌落接种于液体LB培养基，37 ℃培养24 h，生理盐水稀释细菌浓度为1×105 CFU/mL。抑菌圈实验完全参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)，将3种缓释抗菌微球复合水凝胶样品在超净工作台灭菌，然后在固体LB培养基上取100 μL上述液，分别涂布于待测样品，恒温箱中培养。培养一定时间后观察细菌生长并对抑菌圈直径(D)进行测量、记录。每组3个平行样。

1.4.6 缓释抗菌微球复合水凝胶的细胞毒性采用CCK-8法检测缓释抗菌微球复合水凝胶对MG-63细胞(Procell，武汉)的毒性。样品浸提液的制备参照ISO10993.12-2009医疗器械生物学评价标准，将灭菌的缓释抗菌微球复合水凝胶用含有体积分数10%牛血清的MEM培养基配成10 g/L的悬液，浸提72 h，离心后吸上清液至无菌离心管中，置于4 ℃冰箱保存备用。调节MG-63细胞浓度为8.0×107 L-1，接种于96孔板，每孔100 μL，分别加入3种缓释抗菌微球复合水凝胶浸提液100 μL，同时设置阴性对照与空白对照。培养1，3，7 d的细胞毒性以CCK-8试剂盒检测，严格按照说明书进行操作。用酶标测定450 nm处的吸光度值，计算细胞相对增殖率：细胞相对增殖率(%)=(A实验组-A空白对照组/A阴性对照组)×100%。根据细胞相对增殖率值判断毒性分级，见表1。

1.4.7 qRT-PCR缓释抗菌微球复合水凝胶的溶血测试根据(ISO 10993-12:2002)方法，制备适宜浓度缓释抗菌微球复合水凝胶浸提液(100 g/L)为实验组，并设置阴性对照组及阳性对照组，取各组试样10 mL于离心管中；将各组试样放在37 ℃恒温水浴的条件下保温30 min，然后加入稀释后的抗凝兔血(广西医科大学提供)0.2 mL混合均匀后继续保温60 min，将各组试样2 500 r/min离心5 min；取上述上清液200 μL置于96孔板，随后测定上清液吸光度值(阴性对照组≤0.03，阳性对照组处于0.8±0.3)，重复3次；用酶标仪在540 nm处读出吸光度值，计算溶血率。若溶血率低于5%，则判定该材料无溶血作用。
1.4.8 缓释抗菌微球复合水凝胶的成骨性能检测将样品灭菌后的缓释抗菌微球复合水凝胶与 MG-63细胞(6×104/cm2)共培养，以单纯培养的细胞为对照，每孔加入 2 mL成骨诱导液。
碱性磷酸酶活性测试：培养第3，7，14天，收集干预后的细胞，用强裂解液充分裂解，12 000 r/min离心2 min，取上清液，按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行操作，最后于酶标仪在波长520 nm处测定吸光度值，计算出样品浓度。
成骨性能检测：培养第3，7，14天，采用Real-timePCR法检测成骨活性基因RUN-x2、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白2 mRNA的表达[17]。严格按照试剂盒操作说明书，使用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取细胞总RNA，所提RNA样品测定280 nm处的吸光度值，确定纯度并定量。取2 μg总RNA，以反转录酶催化合成cDNA，然后采用实时荧光PCR的方法定量检测RUN-x2、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨形态发生蛋白2 mRNA的表达；先95 ℃30 s预变性后，设置循环条件为95 ℃5 s，60 ℃30 s；72 ℃10 s，共40个循环，以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法分析基因的相对表达量。引物见表2。

1.4.9 缓释抗菌微球复合水凝胶的药物体外释放称取一定量的缓释抗菌微球复合水凝胶，分别放入50 mL离心管中，加入10 mL PBS(pH=7.4)，离心管水浴，分别在设定的时间点取样，1 000 r/min离心10 min，取上清液，置于无菌的离心管中，-80 ℃待测。用紫外分光光度计进行检测，计算盐酸万古霉素浓度。
1.5 主要观察指标缓释抗菌微球复合水凝胶的成胶时间、溶胀性能、体外降解、抗菌能力、细胞毒性、溶血性能、成骨性能及药物体外释放水平。
1.6 统计学分析所有数据采用SPSS 18.0 统计学软件进行分析。计量资料用x±s表示，3组及多组间计量资料的比较采用单因素方差分析，率的比较用卡方检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

人工合成可降解聚合物是目前被认为局部针对性治疗骨髓炎最有潜力的药物载体之一，已成为近期生物材料医学研究的热点[21]。该实验将载药缓释微球与可注射型水凝胶进行复合，最终制备出同时具有抗菌性能和骨诱导作用的微球复合水凝胶材料。相关研究表明，交联时间在可注射性水凝胶组织修复应用时起着关键作用[22]，时间过长，水凝胶前驱体易流失从而不利于修复过程；时间过短，水凝胶形成过快，可操作的时间就缩短不利于操作，同时可能会使水凝胶失去可注射性[22]，因此合适的交联时间使水凝胶既便于注射，又能缩短凝固时间。溶胀是水凝胶的另一个重要特征，在溶胀过程中，一方面溶剂渗入高分子材料内部会破坏分子之间作用力，分子间距离增加，体积膨胀；另一方面，由于体积膨胀会导致网络结构收缩产生弹性收缩能[23]，当这两种相反的倾向平衡时便达到溶胀平衡。合适的流变性能对水凝胶最终在骨髓组织中存在的状态同样具有十分重要的意义[24]。实验证实，缓释抗菌微球复合水凝胶具有适宜的成胶时间、较好的力学强度和较小的溶胀比，并且水凝胶中所含的缓释抗菌微球量对成胶时间及溶胀性能影响不大[25]。
材料与红细胞之间是否具有良好的相容性是评价载药微球性能的重要指标之一，植入体内水凝胶需具有良好的生物相容性[26]。实验中缓释抗菌微球复合水凝胶的主要成分羟丙基羧甲基纤维素及透明质酸钠已被广泛用于创伤修复和组织工程，其安全性已得到大量证实，但聚乳酸乙醇酸共聚物及盐酸万古霉素含量过高可对细胞产生毒性[27-29]。实验中，VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA01、VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA02水凝胶中细胞的相对增殖率均在80%以上，随微球水凝胶中微球量的增加细胞相对增殖率略有下降；VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA03水凝胶在第7天两组的相对增殖率低于80%，具有轻度细胞毒性。3种缓释抗菌微球复合水凝胶的溶血率均小于2%，说明3种缓释抗菌微球复合水凝胶具有良好抵抗红细胞破裂的能力，且微球质量浓度对细胞溶血无明显影响。
组织再生修复材料与组织替代材料最大的不同就在于其在生物体内的可降解性能。可注射微球水凝胶需要同时具有一定的生物降解性能，并且在体内的降解不能对机体组织造成局部损伤。徐斌等[30]研究局部注射水凝胶对心脏功能影响时，结果显示水凝胶注射一两周时在心肌组织中有明显存留，4周后已降解吸收，无明显残留。此次实验证实，随着时间的增加，缓释抗菌微球复合水凝胶的网状结构逐渐塌陷，孔洞的数目在进一步增多大，水凝胶的完整性也被破坏，这表明水凝胶处于不断降解过程中，但完全降解所需时间仍待进一步研究。水凝胶的缓慢降解，一方面可以使抗菌药物盐酸万古霉素缓慢释放，在局部维持较长时间的药物浓度；另一方面，由于水凝胶本身具有成骨性能，因此可以作为骨修复材料诱导局部骨细胞沿着材料表面孔隙爬行替代生长，加速骨再生，修复骨缺损。
具有良好、持续的抗菌性能是制备缓释微球水凝胶临床应用的最重要价值。抗生素的选择是构建治疗骨髓炎药物缓释系统的重点考虑因素之一。基于药物缓释系统中的抗生素选择标准及慢性骨髓炎细菌学结果，在药物释放系统中应用最广泛的药物是盐酸万古霉素[31]。与其他抗生素相比，盐酸万古霉素被吸收和渗入血管系统缓较慢，因此适合在局部应用[32]；并且在所有常用的局部抗生素中，盐酸万古霉素的细胞毒性作用最小[33]。袁宝明[34]通过体外实验证实，载万古霉素的凝胶作为一种局部药物缓释系统能够有效释放万古霉素，在体外可以持续抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长，并且凝胶没有对万古霉素的药物杀菌效果产生影响，但该研究仅检测24 h盐酸万古霉素的抑菌效果，并没有动态检测其后期疗效。此次实验采用测抑菌圈的大小和计算相对CFU两种方法来检测缓释抗菌微球复合水凝胶的抗菌性能，结果显示随着天数的增加，水凝胶抑菌圈直径最大；缓释抗菌微球复合水凝胶外释放实验进一步表明，3种缓释抗菌微球复合水凝胶所释放的盐酸万古霉素质量浓度均高于盐酸万古霉素的最小抗菌浓度，证明微球水凝胶具有持续、稳定的抗菌能力。
在临床骨髓炎演变进展中往往伴有骨皮质变薄、骨组织大量丢失，为了消除细菌微生物的同时能促进骨组织的再生，手术彻底清除病灶后除了抗菌治疗外还需修复骨缺损、加速骨再生，因此同时具备抗菌性能及成骨性能的可注射型水凝胶对治疗骨髓炎、加速骨再生具有重要意义。大量的研究与临床应用表明，壳聚糖、透明质酸钠具有很好的骨传递功能，其作为基体的生物学材料可促使骨细胞增殖[35-36]。陈明姣等[37]构建了高强度的天然高分子透明质酸水凝胶，结果证实水凝胶能显著促进骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达，并同时显著提高成骨相关蛋白(骨桥蛋白、OSX)的表达。此次实验证实，VA@PLGA-CS-HA/OHPMC-HHA水凝胶能显著促进成骨基因RUN-x2、骨形态发生蛋白2、骨钙蛋白及Ⅰ型胶原基因的表达，提高成骨细胞碱性磷酸酶活性，具有显著的诱导成骨分化的能力。骨髓炎手术清创后造成的骨缺损局部骨再生能力减弱，而局部填充具有成骨性能的组织工程材料能促进骨再生、加速骨修复。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

缓释抗菌微球复合型组织工程材料水凝胶的制备及性能评价

Preparation and performance evaluation of composite tissue-engineered material hydrogel with sustained-release antibacterial microspheres

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