Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎

doi:10.12307/2021.006

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (25): 3970-3975.doi: 10.12307/2021.006

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Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎

张立书1，2，刘安琪1，2，何小宁2，金岩2，李蓓2，金钫1

1军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔疾病临床医学研究中心，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032；2解放军第四军医大学组织工程中心，陕西省西安市 710032

收稿日期:2020-05-29 修回日期:2020-06-02 接受日期:2020-07-16 出版日期:2021-09-08 发布日期:2021-03-24
通讯作者: 金钫，博士，主任医师，教授，军事口腔医学国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，陕西省口腔疾病临床医学研究中心，解放军第四军医大学口腔医院正畸科，陕西省西安市 710032
作者简介:张立书，男，1990年生，山东省济南市人，汉族，2014年解放军第四军医大学毕业，医师，主要从事干细胞治疗与组织工程再生相关机制的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81870796)，项目负责人：金钫；国家自然科学基金(81620108007)，项目负责人：金岩

Alpl gene affects the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on ulcerative colitis

Zhang Lishu1, 2, Liu Anqi1, 2, He Xiaoning2, Jin Yan2, Li Bei2, Jin Fang1

1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; 2Center for Tissue Engineering, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China

Received:2020-05-29 Revised:2020-06-02 Accepted:2020-07-16 Online:2021-09-08 Published:2021-03-24
Contact: Jin Fang, MD, Chief physician, Professor, State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
About author:Zhang Lishu, Physician, State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi Clinical Research Center for Oral Diseases, Department of Orthodontics, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China; Center for Tissue Engineering, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81870796 (to JF); the National Natural Science Foundation of China, No. 81620108007 (to JY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Alpl基因：是参与编码一组非组织特异性碱性磷酸酶的基因，在骨质形成、牙齿发育和肝肾代谢中均发挥重要作用。在人类中，这种基因的突变与碱性磷酸酶表达过低相关，从而导致低碱磷酯酶症，表现为不同程度的骨骼发育缺陷。敲除Alpl基因的纯合子小鼠具有胚胎致死性，因此该实验选用Alpl杂合子(Alpl+/-)小鼠。
溃疡性结肠炎：是一种近年来发病率迅速增长的炎症性肠病，目前其发病具体机制尚不清楚，普遍认为是由机体免疫因素、肠道菌群和外界刺激共同作用导致的，临床主要表现为体质量减轻、腹泻和便血等，病理主要表现为结肠大量炎细胞浸润、溃疡形成以及黏膜结构消失等。

背景：骨髓间充质干细胞移植治疗溃疡性结肠炎已取得显著疗效，但是其具体作用机制尚未完全阐明。
目的：观察并探讨Alpl基因对骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎的影响。
方法：①饲养并繁殖Alpl+/-小鼠与野生型小鼠，进行基因型鉴定；②体外培养Alpl+/-小鼠和野生型小鼠的骨髓间充质干细胞，观察细胞生长情况，成骨分化实验和流式细胞仪检测细胞表面标记物进行干细胞鉴定；③将24只C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型对照组、野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗组、Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞治疗组，后3组给予3%葡聚糖硫酸钠水溶液饲喂7 d诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，2个治疗组小鼠在喂葡聚糖硫酸钠溶液第3天和第5天时分别尾静脉注射野生型小鼠或Alpl+/-小鼠来源的骨髓间充质干细胞，第10天处死取结肠组织；④记录每日体质量变化并计算疾病活动指数，比较结肠长度，苏木精-伊红染色观察比较结肠黏膜的组织学变化。
结果与结论：①基因型鉴定结果示杂合子为双条带，与美国杰克逊实验室提供的预测结果一致，提示成功繁育Alpl+/-小鼠；②两组细胞均能形成红棕色的成骨结节，且均表达间充质干细胞表面标记物CD146和CD73，但相较于野生型来源骨髓间充质干细胞，Alpl+/-小鼠来源骨髓间充质干细胞形态多样，缺乏边界清晰的长梭形细胞；③与模型对照组小鼠相比，2个治疗组小鼠肠炎症状和病理变化均减轻，但野生型小鼠骨髓间充质干细胞组的治疗效果明显优于Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞组；④结果提示，骨髓间充质干细胞移植能够治疗葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎，且Alpl基因半敲除抑制骨髓间充质干细胞对溃疡性结肠炎的治疗效果。
https://orcid.org/0000-0001-5011-7045(张立书)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 溃疡性结肠炎, 基因敲除, 碱性磷酸酶, 治疗, 小鼠

Abstract: BACKGROUND: Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells in the treatment of ulcerative colitis has achieved remarkable results, but the specific mechanism remains elusive.
OBJECTIVE: To observe and explore the role of Alpl gene in bone marrow mesenchymal stem cells on the treatment of ulcerative colitis.
METHODS: (1) Alpl+/- mice and wild-type mice were raised and bred for genotyping. (2) Bone marrow mesenchymal stem cells Alpl+/- mice and wild-type mice were cultured in vitro, and cell growth was observed. Osteoblasts induction and flow cytometry assay were performed for stem cell characterization by detecting cell surface markers. (3) Twenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into normal group, model control group, wild-type mouse bone marrow mesenchymal stem cell treatment group, and Alpl+/- mouse bone marrow mesenchymal stem cell treatment group. The latter three groups were fed with 3% dextran sulfate sodium solution for 7 days to induce ulcerative colitis in mice. Bone marrow mesenchymal stem cells from wild-type mice and Alpl+/- mice were injected via tail vein on day 3 and day 5 after administration of dextran sulfate sodium solution. On day 10, the colon tissue was collected. (4) Daily body weight changes were recorded and disease activity index was calculated. Colon length was compared. Hematoxylin-eosin staining was used to observe and compare the histological changes of colonic mucosa.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The genotype identification showed that the heterozygotes were double bands, which was consistent with the prediction results provided by The Jackson Laboratory, indicating the Alpl+/- mice were successfully obtained. (2) Both groups of cells could form reddish brown osteogenic nodules, and both expressed classical mesenchymal stem cells markers CD146 and CD73. However, compared with wild-type bone marrow mesenchymal stem cells, Alpl+/- mouse bone marrow mesenchymal stem cells had various morphology and lack of long spindle cells with clear boundary. (3) Compared with the model control group, the enteritis symptoms and pathological changes of the two treatment groups were reduced, but the treatment effect of wild-type mouse bone marrow mesenchymal stem cell group was significantly better than that of Alpl+/- mouse bone marrow mesenchymal stem cell group. (4) The results suggest that bone marrow mesenchymal stem cell transplantation can treat ulcerative colitis induced by dextran sulfate sodium, and Alpl gene mutation inhibits the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on ulcerative colitis.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, ulcerative colitis, gene knockout, alkaline phosphatase, treatment, mice

中图分类号:

张立书, 刘安琪, 何小宁, 金岩, 李蓓, 金钫. Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3970-3975.

Zhang Lishu, Liu Anqi, He Xiaoning, Jin Yan, Li Bei, Jin Fang. Alpl gene affects the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on ulcerative colitis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(25): 3970-3975.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析实验选用24只C57BL/6小鼠，实验过程无脱失，全部进入结果分析。
2.2 基因鉴定结果 Alpl+/-小鼠的体型与野生型小鼠相比无明显差别，见图2A。剪取小鼠趾端组织进行基因鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示：野生型小鼠为1条位于167 bp的条带，Alpl+/-小鼠为双条带，其中1条位于167 bp，另1条位于400 bp，基因型鉴定结果与美国杰克逊实验室提供的预测结果一致，提示成功繁育Alpl+/-小鼠，见图2B。

2.3 两组骨髓间充质干细胞的培养和鉴定结果野生型小鼠来源骨髓间充质干细胞呈长梭形，生长状态良好，Alpl+/-小鼠来源骨髓间充质干细胞与野生型相比生长缓慢，细胞较小且形态各异，边缘清晰透亮的长梭形细胞较少，见图3。

野生型小鼠和Alpl+/-小鼠来源骨髓间充质干细胞在成骨诱导14 d后均有成骨结节形成，茜素红染色表现为红棕色的钙化结节，提示实验获得的细胞具有成骨分化潜能，见图4。
野生型小鼠和Alpl+/-小鼠来源骨髓间充质干细胞均阳性表达间充质干细胞的标记物CD146和CD73，且基本不表达造血祖细胞的标记物CD34，见图5，提示实验培养细胞为骨髓间充质干细胞，可用于后续研究。

2.4 各组小鼠体质量和疾病活动指数变化在使用葡聚糖硫酸钠喂养小鼠建立急性结肠炎模型后，与正常组相比，其他3组造模小鼠体质量均发生不同程度下降，见图6A。在第3天分别使用野生型小鼠骨髓间充质干细胞或Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞尾静脉注射治疗后，相较于模型对照组，野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗组小鼠体质量下降有所缓解(P=0.003 3)，Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞治疗组小鼠体质量下降虽有所缓解(P=0.002 8)，但不如野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗组明显(P < 0.000 1)。相较于模型对照组，野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗组的疾病活动指数明显下降(P < 0.000 1)，Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞治疗组略有下降(P=0.008 1)，但不如野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗组疗效明显(P=0.000 1)，见图6B。

2.5 结肠大体观察各组小鼠于造模第10天取结肠组织，可见骨髓间充质干细胞治疗后结肠长度均增加(P < 0.000 1，
P=0.036 1)，但与野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗组相比，Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞治疗组的结肠长度较短
(P=0.000 6)，提示Alpl半敲除抑制骨髓间充质干细胞对溃疡性结肠炎的疗效，见图7。

2.6 各组结肠的苏木精-伊红染色结果与正常组相比，模型对照组和Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞治疗组有明显的急性期炎症表现，包括黏膜溃疡糜烂，大量炎性细胞浸润以及黏膜腺体结构紊乱。野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗后可见黏膜结构与正常组相近，腺体结构基本正常，仍可见少量炎性细胞浸润，见图8。以上结果表明尾静脉注射干细胞能够治疗葡聚糖硫酸钠诱导的急性结肠炎，骨髓间充质干细胞中的Alpl基因缺乏后，骨髓间充质干细胞对急性结肠炎的疗效明显降低，表明Alpl基因在骨髓间充质干细胞治疗急性结肠炎中发挥了重要作用。

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引言

骨髓间充质干细胞具有调节免疫和促进组织再生的特性，是组织工程的理想种子细胞[1]。近年来研究发现间充质干细胞移植能够治疗多种免疫相关疾病且在临床试验中取得明显疗效[2]，如炎症性肠病[3-4]、系统性红斑狼疮[5-6]、类风湿性关节炎等[7-8]，但外源性骨髓间充质干细胞治疗免疫相关疾病的具体机制仍不明确。溃疡性结肠炎是一种心理和免疫等多因素共同导致的疾病[9]，其发病率逐年升高，如何有效治疗溃疡性结肠炎成为近年来的研究热点。目前，多种动物模型被用于探讨肠炎的治疗效果，其中葡聚糖硫酸钠饲喂诱导的小鼠结肠炎模型是应用最为广泛的动物模型之一，有着造模简便、成本低、成功率高，以及症状和病理学表现与人类溃疡性结肠炎相似等诸多优点[10-11]，临床表现主要有腹泻、血便和体质量减轻等，病理学表现主要有结肠充血、糜烂、溃疡、腺体结构紊乱和炎性细胞大量浸润等[12]。间充质干细胞移植治疗炎症性肠病取得了较好的临床效果[4，13]，但其具体机制仍不清楚。
碱性磷酸酶是在全身广泛分布的一组同工酶，在骨质形成和肝肾代谢中发挥重要作用[14]，其编码基因Alpl突变会导致不同程度的低碱磷酯酶症，轻症表现为牙齿发育异常和骨质疏松，重症者表现为发育畸形，甚至围产期死亡[15-16]。课题组前期研究发现Alpl半敲除小鼠(Alpl+/-)来源的骨髓间充质干细胞与野生型小鼠来源的骨髓间充质干细胞相比，增殖和多向分化能力明显下降[17]，但是否影响其治疗免疫相关疾病的能力尚不清楚。该研究分别应用野生型小鼠和Alpl+/-小鼠来源的骨髓间充质干细胞治疗葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎，观察治疗效果，通过失功能实验探讨Alpl基因在骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎中的作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 2017年12月至2019年9月在解放军第四军医大学实验动物中心及解放军第四军医大学口腔医学院组织工程中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物雌性Alpl敲除小鼠B6.129S7-Alpltm1Sor/J
(C57BL/6J遗传背景)(编号：002741)购于美国杰克逊实验室，于解放军第四军医大学动物实验中心SPF级环境中饲养并繁殖，由于纯合子具有围产期致死性，故而该研究所用小鼠均为杂合子，简写为Alpl+/-。取4-6周龄的Alpl+/-小鼠及野生型小鼠各20只，用于分离培养小鼠骨髓间充质干细胞。
24只SPF级10周龄C57BL/6雌鼠购于解放军第四军医大学动物实验中心，体质量(20.63±0.48) g，所有实验动物每日接受标准12 h明暗循环，正常饮食及饮水，用于设计实验动物模型。动物实验经解放军第四军医大学动物伦理委员会批准(批准号：SYXK2012-0023)。
1.3.2 实验主要仪器及试剂 CO2恒温培养箱(Thermo Forma，
美国)；倒置相差显微镜及照相系统(Olympus，日本)；流式细胞仪(BECKMAN COULTER，美国)；高速离心机(Eppendorf，德国)；YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)；酶联免疫检测仪(BIO-TEK，美国)；CFX96实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)。
葡聚糖硫酸钠(MP Biomedicals，抗小鼠CD146抗体、抗小鼠CD73抗体、抗小鼠CD34抗体(eBioscience，美国)；苏木精-伊红染液(Leica，德国)；α-MEM培养液(Gibco，美国)；胎牛血清(杭州四季青)；40 g/L多聚甲醛(赛驰生物，中国)；2.5 g/L胰蛋白酶(Sigma，美国)；成骨诱导液(赛业生物，中国)；茜素红(Sigma，美国)。
1.4 实验方法
1.4.1 Alpl杂合子敲除小鼠的基因型鉴定为最大限度减轻对实验动物伤害，给小鼠编号时需剪取小鼠前爪或者后爪的
3 mm左右趾端，将其放入1.5 mL的EP管中；加入裂解液提取组织DNA；加入鉴定引物进行PCR；琼脂糖凝胶电泳法测定DNA条带。引物序列见表1。

用于基因分型的引物包括突变型(Mutant)、野生型(Wild-type)和通用型(common) 3条：oIMR0137 –5ʹ-CCG TGC ATC TGC CAG TTT GAG GGG A-3ʹ – 突变型；oIMR0138 – 5ʹ-CTG GCA CAA AAG AGT TGG TAA GGC AG-3ʹ – 野生型；oIMR0139– 5ʹ-GAT CGG AAC GTC AAT TAA CGT CAA T-3ʹ – 通用型。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的分离培养 ①将4-6周龄的野生型小鼠及Alpl+/-小鼠用颈椎离断法处死，浸泡于体积分数为75%乙醇中消毒5-10 min；②超净台中分离小鼠肱骨、股骨与胫骨，置于含预冷的PBS的培养皿中，分离肌肉并剔除附着的软组织至表面干净；③将已刮干净的长骨剪去两端，置于含α-MEM培养液的培养皿中，用1 mL注射器冲洗出骨髓腔内骨髓，直至长骨骨干变至半透明时弃去长骨，此过程尽量用注射器吸入成块骨髓，并吹打细碎，全程冰上操作；④收集含细胞的培养液于离心管中，吹打均匀，4 ℃，400×g离心5 min，弃上清，加入含胎牛血清和双抗的α-MEM培养液重悬；⑤接种于10 cm培养皿中，37 ℃细胞孵育箱内孵育；⑥24 h更换一半的培养液，72 h全量换液，之后每3 d换液，待细胞融合至80%时传代，显微镜下观察细胞形态并拍照。
1.4.3 成骨诱导实验将原代野生型小鼠及Alpl+/-小鼠来源的骨髓间充质干细胞接种于6孔板中；待细胞融合至80%时弃去培养液，更换成骨诱导液，隔日换液；诱导14 d后弃去诱导液，蒸馏水小心洗净诱导液，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min；蒸馏水洗净多聚甲醛后，加入1%茜素红染液，室温染色30 min；最后，蒸馏水洗净多余的茜素红染液，显微镜下拍照。
1.4.4 流式鉴定常规消化第1代细胞，200目筛网过筛后PBS重悬至细胞浓度为1×109 L-1，每管200 μL细胞悬液，按1∶100的比例分别加入抗小鼠CD146抗体、抗小鼠CD73抗体、抗小鼠CD34抗体后混匀，室温孵育1 h，PBS洗2遍后使用流式细胞仪检测。
1.4.5 动物实验分组及造模将24只C57BL/6小鼠随机分为4组，每组6只，分别为正常组、模型对照组、野生型小鼠骨髓间充质干细胞治疗组、Alpl+/-小鼠骨髓间充质干细胞治疗组。正常组作为空白对照，给予蒸馏水正常饲喂。小鼠溃疡性结肠炎模型造模方法，见图1：将葡聚糖硫酸钠加入无菌蒸馏水中配成3%的葡聚糖硫酸钠溶液，用其替代小鼠的饮用水，共计饲喂7 d，造模第8天换无菌蒸馏水继续饲喂3 d。每日固定时间点记录每只小鼠的体质量、大便性状分数以及血便分数。

正常组小鼠喂蒸馏水第3天和第5天，其余3组小鼠喂葡聚糖硫酸钠溶液第3天和第5天时，2个治疗组小鼠分别尾静脉注射野生型小鼠或Alpl+/-小鼠来源的骨髓间充质干细胞，每只小鼠每次注射含1×106个骨髓间充质干细胞的PBS溶液100 μL；正常组小鼠和模型对照组小鼠注射PBS溶液100 μL。
1.4.6 体质量和疾病活动指数的评估每日观察记录各组小鼠的体质量、临床表现、大便性状、粪隐血情况，并计算疾病活动指数。评分标准：疾病活动指数=1/3(体质量下降分数+大便性状分数+血便分数)。各组均于造模后第10天处死，取结肠组织并拍照，40 g/L多聚甲醛4 ℃固定。评价标准见表2。

1.4.7 苏木精-伊红染色样本经石蜡包埋后，切成厚度为
4 μm，常规脱蜡后苏木精染色10 min，经水洗返蓝后1%盐酸乙醇分化3 s，蒸馏水洗3遍，伊红染色20 s，最后梯度乙醇脱水，中性树胶封固。
1.5 主要观察指标 ①Alpl+/-小鼠的基因型鉴定；②第1代骨髓间充质干细胞的细胞形态；③骨髓间充质干细胞表面标记物的表达；④野生型小鼠和Alpl+/-小鼠来源骨髓间充质干细胞治疗后C57BL/6小鼠的体质量、疾病活动指数、结肠长度、结肠组织病理变化。
1.6 统计学分析采用Prism 8软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用x±s表示，两两间比较采用独立样本t 检验，P < 0.01为差异有显著性意义。

Alpl基因影响骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎

Alpl gene affects the therapeutic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on ulcerative colitis

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