2.1 干细胞和再生医学 干细胞是尚未成熟的组织前体细胞，能够自我更新形成克隆细胞群，从而分化成为多个细胞谱系。这一特性使得其备受组织修复工程的青睐。目前，多样性的干细胞主要包括以下3个种类：①来源于早期胚胎的胚胎干细胞；②诱导多能干细胞；③成体干细胞，包括造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞等[1]。干细胞的治疗潜能归功于3个关键的调控机 制[2]，首先是“归巢”，系统调控干细胞迁移至损伤部位，目前的学说认为该迁移过程与白细胞的迁移过程类似，该化学吸引被细胞表面受体如趋化受体所调控。尽管干细胞内皮系统的接触机制尚未完全明确，但已知整合蛋白(integrins)、血管细胞黏附分子(VCAM-1)和G蛋白受体信号在其中扮演重要角色；其次是分化成为多种不同细胞类型，该作用机制能够快速补充或替代周围的损伤细胞[3]；第三是分泌具有生物活性的因子，既能够影响周围组织，又能进行远距离调控[4]。
2.2 间充质干细胞 间充质干细胞是1968年由Friedenstein等发现的，当时描述该类细胞是成纤维状的能够分泌造血功能相关生长因子和细胞因子的细胞[5]。后来研究发现间充质干细胞无处不在，目前已经从多种组织中分离出来，包括脂肪组织、皮肤、肺、滑膜组织、牙髓、鼻黏膜、乳汁、头皮组织、肌肉、骨膜、角膜缘、血液、子宫内膜、胎儿组织。这些组织基质中均能分离和扩增出间充质干细胞，而骨髓组织和皮下脂肪是常用的细胞来源[6]。间叶组织干细胞的国际治疗协会于2006年建立了人类间充质干细胞的识别特征，包括在标准培养条件下维持黏附外形，表达CD105、CD73、CD90分子，不表达CD45、CD34、CD14、CD45、CD11b、CD79a或CD19、HLA-DR表面分子，具有在体外向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力[7]。
尽管间充质干细胞在很多组织中存在，但在体内的总体含量还是很低的。然而细胞治疗标准一般要求每次治疗需要数以亿计的细胞量。在治疗前，一般在体外扩增10周。患者的年龄和临床特征也影响间充质干细胞的体内培养条件。早期研究将间充质干细胞的治疗效果归功于它的移植和分化能力。有几项研究显示间充质干细胞的存活时间很短暂，达不到起效的时间。另外据报道，能够存活超过1周的间充质干细胞不超过1%，说明间充质干细胞的主要效果是由其他机制介导的[8]。近期研究已经开始重点关注间充质干细胞分泌的生物活性分子，这些分子在生理调控过程中扮演重要角色。间充质干细胞的分泌功能是Haynesworth等定义的，他们报道间充质干细胞能够产生和释放一系列的生长因子、化学因子，这些因子能够调控临近细胞的行为。实际上，这些分泌的因子能够增强血管再生，降低凋亡和纤维化，增强神经元的存活和分化，刺激细胞外基质重塑，适应免疫应答。他们进一步对间充质干细胞分泌物刺激靶细胞进行生物调节进行了研究，包括骨和软骨再生、神经疾病、肝脏损伤、急性肾脏损伤和心血管疾病等都证实间充质干细胞所分泌的分子既能够直接激活靶细胞又能够刺激临近细胞分泌活性因子。因此，间充质干细胞分泌物在组织修复和再生领域引起相当大的重视。间充质干细胞分泌物质包括细胞因子和胞外囊泡，胞外囊泡又可细分为凋亡小体、微粒和外泌体[9]。外泌体通过转移信息至损伤的细胞或组织参与组织再生，并且保持与间充质干细胞相同的生物活性，是间充质干细胞旁分泌的重要组成部分。
2.3 间充质干细胞来源外泌体 外泌体是一类特殊的胞外囊泡，其直径为40-150 nm，密度为1.09-1.18 g/mL。近年来外泌体的研究呈爆炸性增长，见图2。越来越多的证据显示间充质干细胞相比其他细胞能够产生大量的外泌体，其干细胞的再生特性能够通过外泌体进行调控[10]。外泌体能够通过吞噬、胞膜融合、受体接触等方式被其他细胞内化，从而将其内容物释放进细胞质内。外泌体的再生潜能被一系列机制所调控，例如，人脐血来源间充质干细胞受干扰素γ的炎性环境影响能够减弱其对抗急性缺血性肾损伤的能力[11]。间充质干细胞能够加工产生含有相关信息mRNA的外泌体，从而远距离运输，产生作用于靶细胞的能力。最近报道Huntington疾病研究中，加载有修饰化小干扰RNAs的外泌体能够被原代神经元所内化，并且能够引起mRNA和蛋白的沉默[12]。间充质干细胞来源外泌体的另外一项重要作用是具有作为疾病特异性诊断标志物的潜能。例如，在阿尔茨海默疾病中，来源于脂肪干细胞的外泌体较来源于骨髓间充质干细胞的外泌体在降解β-淀粉样蛋白时更有效率[13]。另外，已经证实，脂肪干细胞来源外泌体能够降低Huntingtin突变体的集聚，改善异常的凋亡蛋白水平，降低线粒体损伤，从而治疗Huntingtin疾病。与脐带、浆膜、骨髓来源相比，月经来源间充质干细胞外泌体更具有促神经突生长的能力[14]。这些研究说明，人体不同组织间充质干细胞来源外泌体具有重要功能，需要进行深入研究。在再生医学领域，外泌体治疗相比于干细胞直接治疗更具有优势，体现在外泌体的应用能够使转移过程更加安全；间充质干细胞来源外泌体在安全性、作用剂量、作用效果方面优于传统药物；内容物能够长时间存在而不受潜在的毒性物质的损害；在临床应用过程中避免了侵入性细胞收集过程，从而更经济和更具有操作性；在特定的实验条件下，通过特制的细胞株进行大规模生产，从而更便利的提供生物活性因子；维持和扩增培养干细胞的成本和时间大幅下降；最后，用于治疗的生物产品能够修饰为特定的特异性细胞分子。
2.4 间充质干细胞来源外泌体在疾病组织修复方面的应用 见表1。
2.4.1 保护和营养神经组织 在过去的几十年，很多研究已经证实间充质干细胞分泌物质的神经保护和神经营养效果[15-17]。实际上，间充质干细胞培养液含有大量的神经营养因子。几项研究报道了间充质干细胞在神经损伤模型中的作用，这些作用包括炎性环境调控、再生靶点的血管化、增加髓鞘厚度、加快纤维再生和改善纤维组织[15]。间充质干细胞分泌物质作为神经修复的关键调控角色最近被报道，神经干细胞和间充质干细胞均能分泌许多生长因子，且将这些细胞类型在体外共同孵育能够产生叠加的有利效果[18]。人脱落乳牙干细胞培养液治疗阿尔茨海默病动物模型有效。鼻管内注射人脱落乳牙干细胞能够改善认知功能和神经再生能力，能够减轻由淀粉样斑块或M2类似神经胶质细胞引起的促炎应答。间充质干细胞来源外泌体在治疗神经源性和神经变性疾病方面拥有潜在的治疗优势。在鼠脑卒中模型中，静脉注射间充质干细胞来源外泌体能够促进神经修复和改善神经易塑性，同时证明间充质干细胞来源外泌体是通过转移miR-133b至神经元细胞和星形胶质细胞，增强其神经修复能力，促进功能恢复。研究还报道间充质干细胞来源外泌体富含miR-17-92，能够通过抑制PTEN和增强PTEN下游蛋白的磷酸化促进退化神经元的功能恢复。研究发现间充质干细胞来源外泌体能够起到长期的神经保护作用，促进神经再生和血管再生。在早产缺氧缺血性脑损伤模型中，间充质干细胞来源外泌体能够通过降低神经后遗症从而改善脑功能。在另外一项研究中，间充质干细胞来源外泌体能够改善脑损伤大鼠认知功能。在创伤性脑损伤模型中，间充质干细胞来源外泌体能够促进血管和神经再生，降低炎症反应，形成成熟或不成熟的神经元，从而促进创伤性脑损伤后的功能恢复。研究发现脂肪间充质干细胞来源外泌体包含有大量的脑啡肽酶，该酶能够降解脑组织中的β-淀粉样肽段。将外泌体转移进入成纤维瘤样细胞内，能够降低β-淀粉样肽段水平，对阿尔茨海默疾病的治疗有益。
2.4.2 血管再生的调控 研究证实间充质干细胞分泌物在血管再生中发挥关键作用。例如，不同来源(脂肪组织、羊水、骨髓组织、脐静脉血)的间充质干细胞能够引起内皮细胞的增殖和迁移，促进管腔形成，降低体外内皮细胞的凋亡[10]。间充质干细胞在血管增生领域的角色对于大部分血管增生不足的临床疾病，例如动脉粥样硬化、创伤愈合失调有着重要作用。在很多动物实验中，间充质干细胞已经成功应用于脑卒中、心肌梗死、神经源性膀胱疾病、外周动脉病、应激性尿失禁等动物模型[19-21]。在间充质干细胞来源外泌体中，许多血管生成刺激因子和抑制因子已经被鉴定出来[22]。最近，对炎性因子刺激的间充质干细胞来源外泌体进行组学分析，鉴定出具有抗血管增生性质的基质金属蛋白酶抑制蛋白[23]。间充质干细胞来源外泌体中存在的许多因子能够维持平衡促进血管再生，例如血管内皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板来源生长因子、白细胞介素6、白细胞介素8[24]。
2.4.3 内脏疾病组织修复 研究已经证实间充质干细胞来源外泌体对肾脏疾病有保护效果。在肾缺血再灌注损伤大鼠模型中，注射间充质干细胞来源外泌体能够通过降低凋亡水平和促进肾小管内皮细胞增殖从而保护急性肾损伤，改善肾脏功能；用RNase处理外泌体后，该保护效果消失。结果说明外泌体能够保护肾小管细胞转运效应mRNA和miRNA至受体细胞[25]。在一项肾脏切除模型中，将间充质干细胞来源外泌体与间充质干细胞进行了比较，发现间充质干细胞来源外泌体与间充质干细胞类似，能够降低纤维化，消除管型化。以上研究说明间充质干细胞来源外泌体可能复制了间充质干细胞的功能[26]。在肝脏疾病模型中，间充质干细胞来源外泌体同样发挥治疗作用。在心脏疾病模型中，间充质干细胞来源外泌体具有心肌保护能力。人胚胎间充质干细胞来源外泌体能够减小血栓，增强NADH和ATP水平，降低氧化应激水平，并且在该过程中间充质干细胞来源外泌体能够增加Akt和GSK-3β的磷酸化(抗凋亡通路)，降低c-JNK的磷酸化(促凋亡通路)。在心肌梗死模型中，间充质干细胞来源外泌体能够改善心脏功能，与血管再生的激活和炎症反应的抑制有关[27]。Teng等[28]报道骨髓间充质干细胞来源外泌体能够显著增强人脐静脉细胞微管的形成，抑制体外T细胞的增殖。
2.4.4 伤口愈合和组织修复 间充质干细胞在损伤处的组织修复功能已经被证实，从动物模型得到的数据显示间充质干细胞的自分泌和旁分泌在伤口愈合过程中扮演了比直接作用更关键的角色[29]。最近有报道包含外泌体在内的脐带间充质干细胞条件培养基处理大鼠干眼损伤，能够改善内皮细胞代谢，并且降低巨噬细胞炎性蛋白和肿瘤坏死因子αmRNA的表达水平。炎症、化学烧伤和角膜感染导致白细胞渗透进角膜，这能够通过释放炎症因子引起角膜新的感染。多项研究显示间充质干细胞条件培养基中外泌体的存在对于损伤器官组织的再生有重要作用。间充质干细胞来源外泌体具有抗纤维化和增殖效果，从而能够减少瘢痕的形成。研究显示间充质干细胞来源外泌体能够促进体外水平的肌细胞生成及血管再生。他们发现在心脏毒素造成的肌肉损伤模型中。间充质干细胞来源外泌体能够促进肌肉再生，该过程是通过miR-494调控的[30]。
2.4.5 骨骼及软骨的再生 在再生医学领域，运用间充质干细胞进行骨组织再生及修复研究具有广阔前景。Furuta及其同事检测了CD9-/-小鼠模型骨折愈合过程中间充质干细胞来源外泌体的治疗效果，发现间充质干细胞来源外泌体能够促进骨折愈合[31]；生物信息学分析进一步明确PI3K/AKT信号通路是人诱导多能干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨分化的主要通路[32]；研究显示人胚胎干细胞来源外泌体对于软骨损伤具有治疗效果。该研究在制备软骨缺损大鼠模型之后，关节内注射间充质干细胞来源外泌体，每周1次，连续注射12周，对侧注射生理盐水，最终在实验组形成软骨修复，而对照组只有纤维组织修复。该研究的缺陷是不能排除注射入观察组关节内的外泌体有可能随着血液的流动进入另外一侧，从而造成干扰[33]。
.jpg)
文题释义：
外泌体：在人体体液中广泛存在，由细胞分泌的一类特殊的胞外囊泡，其直径为40-150 nm，密度为1.09-1.18 g/mL。外泌体是细胞与细胞之间进行交流的工具，是间充质干细胞分泌的重要组成部分。
外泌体治疗的优势：在再生医学领域，外泌体治疗相比于干细胞直接治疗更具有优势，体现在外泌体的应用能够使转移过程更加安全；间充质干细胞来源外泌体在安全性、作用剂量、作用效果方面优于传统药物；内容物能够长时间存在而不受潜在的毒性物质的损害；在临床应用过程中避免了侵入性细胞收集过程，从而更经济和更具有操作性；在特定的实验条件下，通过特制的细胞株进行大规模生产，从而更便利的提供生物活性因子；维持和扩增培养干细胞的成本和时间大幅下降；最后，用于治疗的生物产品能够修饰为特定的特异性细胞分子。.jpg)
.jpg)