1.1 设计 随机对照动物实验。
1.2 时间及地点 实验于2017年10月至2018年6月在广西医科大学动物实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 新西兰大白兔60只,3-5月龄,体质量为(2.5±0.5)kg,单笼饲养,实验动物由广西医科大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK桂2014-0005。
1.3.2 主要试剂和仪器 戊巴比妥钠(P3761-5G,SIGMA);骨形态发生蛋白2(BMP)ab14933,abcam);聚合HRP标记抗兔IgG(SV0002,博士德);酶标仪(Rayto RT-6100酶标分析仪);电热恒温培养箱(DHP-9162A,武汉一恒苏净科学仪器有限公司);显微镜(MODEL CX41RF,Olympus Corporation)。
1.3.3 相关药物前处理 ①活血接骨汤:药物组成:当归12 g,赤芍12 g,白芍11 g,生地黄15 g,桃仁10 g,红花6 g,骨碎补12 g,土鳖虫8 g,煅自然铜(先煎)10 g,续断15 g,五加皮12 g,乳香5 g,威灵仙12 g,生薏苡仁20 g,生甘草6 g等。以上药物均由广西邕宁区人民医院中药房提供,经药物制剂室制成含生药5 g/mL的浓缩口服液,灭菌后装瓶冷藏备用;②环氧化酶2抑制剂:依托考昔片(批号:JX20130036,默沙东制药有限公司) 60 mg/片,以生理盐水配制成0.5 g/L,药液用药前10 min配制。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型建立 大白兔要经过1周的适应性饲养。采用0.3%戊巴比妥钠30 mg/kg耳缘静脉注射麻醉,麻醉后将兔双侧前肢的兔毛处理干净,将兔子以俯卧位固定四肢,沿着桡骨中下1/3纵行切开皮肤及皮下组织,露出桡骨,将桡骨中下1/3交界处切开骨膜,用骨锯将其造成为3 mm骨质缺损,不固定,然后用生理盐水将切口冲洗干净,用线逐层缝合。术后采用分笼常规饲料及饮水饲养,术后每天肌肉注射青霉素40 IU/次,注射3 d,预防感染。
1.4.2 动物分组及给药方法 将42只大白兔建立桡骨骨折兔模型,造模成功后随机分为单纯环氧化酶2抑制剂组(环氧化酶2抑制剂组)、空白对照组、活血接骨汤拮抗环氧化酶2抑制剂组(活血接骨汤+环氧化酶2抑制剂组),每组20只,各组均于造模术后第2天开始给药。环氧化酶2抑制剂组予依托考昔片200 mg/kg以混匀灌胃,2次/d;空白对照组予等剂量蒸馏水灌胃,2次/d。活血接骨汤+环氧化酶2抑制剂组先予依托考昔片200 mg/kg以混匀灌胃,1 h后给予活血接骨汤浓缩口服液灌胃,给药剂量为家兔对人等效剂量的2倍,2次/d灌胃。术后1,2,3,4,6周时各组随机选取4只家兔测定血清中骨钙素水平,再取材进行免疫组织化学染色,观察骨折愈合不同时间点外骨膜、内骨膜和骨髓腔骨形态发生蛋白的表达情况。
1.4.3 酶联免疫吸附测定血清中骨钙素水平 于造模后1,2,3,4,6 周时随机抽取各组家兔4只,抽取静脉血 5 mL,然后离心分离血清。按照说明书操作,通过ELISA试剂盒检测血清中骨钙素水平,采用酶标分析仪进行检测,450 nm 波长测量样品的吸光度(A值),检测完成后,用标准物的浓度与A值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的A值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
1.4.4 免疫组织化学检测骨形态发生蛋白2的表达 术后采用空气栓塞法处死兔子,取出桡骨原骨折端,先经40 g/L的多聚甲醛固定,再用15%的EDTA进行脱钙处理。脱钙后将骨段纵行剖开,石蜡包埋切片,切片二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水,抗原修复后,体积分数3%过氧化氢阻断过氧化物酶。非特异性封闭后,一抗BMP-2 4 ℃孵育过夜,滴加适量聚合HRP标记抗兔IgG二抗工作液,在37 ℃孵育 30 min,PBS充分淋洗;DAB显色5 min,在显微镜下掌握染色程度,PBS或自来水冲洗1 min;苏木精复染3 min,盐酸乙醇分化,返蓝;自来水冲洗1 min,脱水、透明、封固,于显微镜下观察阳性信号。
1.4.5 图像分析 采用显微图像采集系统,每张切片选骨折中心及附近的外骨膜、内骨膜、骨髓腔取高倍镜3个视野
拍照,采用ImagePro plus 6.0 图像分析软件测定骨形态发生蛋白2的表达阳性细胞平均吸光度(MOD)值。
1.5 主要观察指标 ①骨折愈合不同时间点血清中骨钙素水平;②骨折愈合不同时间点骨形态发生蛋白2表达。
1.6 统计学分析 所有实验数据采用SPSS 19.0软件分析,应用LSD法对每个时间点组间差异进行比较,结果采用x±s,表示检验水准α=0.05。
中国组织工程研究杂志出版内容重点:组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程