心脏转录因子Nkx2.5重组蛋白对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转分化的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1559

中国组织工程研究 ›› 2019, Vol. 23 ›› Issue (5): 685-690.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1559

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心脏转录因子Nkx2.5重组蛋白对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转分化的作用

麦丽萍，杨翔宇，吴岳恒，何国东，李晓红

广东省人民医院，广东省医学科学院医学研究部，广东省华南结构性心脏病重点实验室，广东省广州市 510080

修回日期:2018-10-30 出版日期:2019-02-18 发布日期:2019-02-18
通讯作者: 李晓红，副研究员，广东省人民医院，广东省医学科学院医学研究部，广东省华南结构性心脏病重点实验室，广东省广州市 510080
作者简介:麦丽萍，女，1985年生，广东省广州市人，汉族，2016年中山大学药学院毕业，硕士，主管技师，主要从事药理学相关研究。
基金资助:
广东省科技计划项目(2017B090904034，2017A070701013)，项目负责人：庄建；广州市科技计划项目(201704020126)，项目负责人：李晓红

Expression of recombinant Nkx2.5 and its effect during human bone marrow mesenchymal stem cells reprogramming into cardiomyocytes

Mai Liping, Yang Xiangyu, Wu Yueheng, He Guodong, Li Xiaohong

Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Southern China Key Laboratory of Structural Heart Disease in Guangdong, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China

Revised:2018-10-30 Online:2019-02-18 Published:2019-02-18
Contact: Li Xiaohong, Associate researcher, Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Southern China Key Laboratory of Structural Heart Disease in Guangdong, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
About author:Mai Liping, Master, Technician in charge, Medical Research Center of Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Southern China Key Laboratory of Structural Heart Disease in Guangdong, Guangzhou 510080, Guangdong Province, China
Supported by:
Guangdong Science and Technology Programs, No. 2017B090904034 (to ZJ) and 2017A070701013 (to ZJ); Guangzhou Science and Technology Program, No. 201704020126 (to LXH)

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
纳米-蛋白复合体：目标蛋白被纳米转导材料包裹形成复合物，携载蛋白穿膜并在细胞内释放和表达。
细胞重编程：在基因序列不改变的情况下，采用一些干扰方式，使细胞逆转恢复到全能细胞状态或从一种分化的细胞转化为另一种细胞的技术。

摘要
背景：大多数研究通过使用小分子物质或病毒等方式诱导获取心肌样细胞，而关于重组蛋白用于细胞重编程获得心肌样细胞的报道较少。
目的：探讨Nkx2.5重组蛋白对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转分化的作用。
方法：构建Nkx2.5原核表达载体，不同时间点诱导Nkx2.5重组蛋白表达和分离纯化。使用纳米转导试剂包裹Nkx2.5形成纳米-蛋白复合体，转染人骨髓间充质干细胞，观察蛋白转导效率；蛋白转导成功后，检测心肌细胞特异性标志MHC的表达，观察人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化情况。
结果与结论：①28 ℃ IPTG诱导培养4 h获取的蛋白表达量更高；②纳米-Nkx2.5复合体可成功转染人骨髓间充质干细胞并诱导其向心肌样细胞转化；③结果表明，重组蛋白能被高效转导到细胞内，并能促使人骨髓间充质干细胞重编程为心肌样细胞，但细胞转分化效率尚待提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID:0000-0001-8644-2376(麦丽萍)

关键词: 骨髓间充质干细胞, Nkx2.5重组蛋白, 细胞重编程, 纳米-蛋白复合体, 心肌样细胞, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Most studies mainly focus on using small molecules or viruses to obtain cardiomyocytes, but reports about the use of recombinant proteins to reprogram cells to obtain cardiomyocytes are rare.
OBJECTIVE: To explore the effect of recombinant Nkx2.5 protein on the transdifferentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes.
METHODS: The prokaryotic expression vector of Nkx2.5 was constructed. Nkx2.5 protein was induced to express at different time points, and then was isolated and purified. Nkx2.5 was encapsulated with nano-transducers to form nano-protein complexes, which were transfected into human bone marrow mesenchymal stem cells. The protein transfection efficiency was then detected. After successful protein transduction, the expression of myosin heavy chain, a specific marker of cardiomyocytes, was detected and the transformation of human bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The protein expression was higher when the cells were induced with isopropyl-β-d-thiogalactoside at 28 oC for 4 hours. To conclude, the nano-Nkx2.5 complexes can be efficiently transfected into human bone marrow mesenchymal stem cells and promote the reprogramming of bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes, but future studies are needed to improve the efficiency of the transdifferentiation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Transcription Factors, Myocytes, Cardiac, Tissue Engineering

中图分类号:

麦丽萍，杨翔宇，吴岳恒，何国东，李晓红. 心脏转录因子Nkx2.5重组蛋白对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转分化的作用[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(5): 685-690.

Mai Liping, Yang Xiangyu, Wu Yueheng, He Guodong, Li Xiaohong. Expression of recombinant Nkx2.5 and its effect during human bone marrow mesenchymal stem cells reprogramming into cardiomyocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(5): 685-690.

图/表（结果） 2

2.1 Nkx2.5片段的获取 重组pReceiver-B01-Nkx2.5表达载体经限制性内切酶XmnⅠ和XhoⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果，见图1。从图中可以看出pReceiver-B01-Nkx2.5经酶切后有目标片段出现，该片段长度约在1 kb，与Nkx2.5片段的理论大小一致。

2.2 Nkx2.5重组蛋白诱导表达情况与破菌检测结果 重组表达质粒pReceiver-B01-Nkx2.5经转化鉴定后进行表达，结果显示：加入IPTG诱导剂，28 ℃振荡培养4 h获取的蛋白表达较高，在35-40 kD之间有明显的目标片段Nkx2.5蛋白出现，见图2。裂解细菌包涵体后离心分别检测上清和沉淀，检测到沉淀中有蛋白表达，上清则没有，见图3。

2.3 Nkx2.5重组蛋白纯化 上述所获得的沉淀进行纯化和复性后，取蛋白溶液进行SDS-PAGE检测，结果可见：包涵体蛋白样在35-45 kD之间出现明显的目标片段，见图4。

2.4 Nkx2.5重组蛋白的鉴定 采用Dot blotting方法检测各次分离纯化后的蛋白，结果可见在硝酸纤维素膜上目的蛋白出现明显黑色斑点，而阴性对照则不显影，见图5。

2.5 纳米-Nkx2.5复合体转染骨髓间充质干细胞 根据实验室前期的研究^[18]，纳米转导材料能够以复合体的形式携载蛋白，随后穿膜并在细胞内释放和表达；前期研究结果显示：纳米粒子和蛋白质的最适摩尔比为4∶1。纳米-Nkx2.5复合体转染至骨髓间充质干细胞后可见转染率高达95%，对照组仅用纳米粒子转染骨髓间质干细胞则未见表达，见图6。Western Blot检测转染后的细胞，结果显示Nkx2.5蛋白表达明显上调，见图7。

2.6 Nkx2.5重组蛋白能促进骨髓间质干细胞向心肌样细胞转化 实验组培养基中加入Nkx2.5重组蛋白，对照组培养基中未加入Nkx2.5重组蛋白，细胞培养至第8天时，采用免疫荧光法检测心肌的特异性标志物MHC表达，显微镜下计数每1 000个细胞含有绿色荧光标记的MHC数目，阳性细胞占(5.67±1.53)%，而对照组未见MHC阳性表达，见图8。同时采用Western Blot检测MHC蛋白表达，结果可见加入Nkx2.5重组蛋白的细胞与对照组比较，MHC蛋白表达水平上调，见图9。

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引言

材料方法

1.1 设计 重组蛋白的表达及分离纯化实验；细胞实验。

1.2 时间及地点 于2016年10月至2017年8月在广东省人民医院医学研究部完成。

1.3 材料

1.3.1 细胞株 骨髓间充质干细胞，货号：HUXMA-01001，购买自赛业生物科技有限公司，已经过鉴定。

1.3.2 实验试剂和仪器 骨髓间充质干细胞完全培养基(赛业生物科技有限公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；PBS(Life Technologies公司)；LB培养基(Sigma公司)；盐酸胍(国药集团化学试剂有限公司)；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy-β-D-Thiogalactoside，IPTG)(Amresco公司)；质粒提取试剂盒(OMEGA Bio-Tek公司)；变性预制SDS-PAGE凝胶(Ubiotech公司)；MHC抗体、Nkx2.5抗体(Abcam公司)；HRP抗体(Wuhan goodbio公司)；超声破碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；恒温摇床(上海知楚仪器有限公司)；电泳系统(大连捷迈科贸有限公司)；凝胶成像系统(日本GE公司)；荧光显微镜(Leica公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 重组pReceiver-B01-Nkx2.5表达质粒的构建 利用PCR引物：Forward：5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'，Reverse：5'-TTC ACT TCT GAG TTC GGC ATG-3'，以人心脏cDNA文库为模板，PCR扩增Nkx2.5基因。纯化PCR产物，克隆入pReceiver-B01载体，并行DNA测序鉴定。提取Nkx2.5序列正确的重组pReceiver-B01-Nkx2.5质粒。用XmnⅠ和XhoⅠ双酶切筛选鉴定重组pReceiver-B01-Nkx2.5质粒，并送Invitrogen公司测序鉴定。

1.4.2 重组蛋白的诱导表达与破菌检测 重组表达质粒pReceiver-B01-Nkx2.5转化BL21后进行铺板，挑阳性克隆到含氨苄西林的3 mL LB培养基中37 ℃振荡培养过夜，-20 ℃保种。次日将100 μL菌液接种于含氨苄西林的100 mL LB液体培养基中，振荡培养过夜；在2 000 mL的LB液体培养基中接种100 mL菌液，37 ℃进一步扩大培养，直至A₆₀₀约为0.6，降低培养温度至30 ℃；再加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy-β-D-Thiogalactoside，IPTG)诱导剂至终浓度为0.5 mmol/L，在28 ℃条件下继续振荡，分别培养1，2，3，4 h，或18 ℃继续振荡，诱导过夜培养，以摸索最佳的诱导时间；8 000 r/min离心3 min收集菌体，然后重悬于50 mL预冷镍柱平衡缓冲液中，置冰浴中30 min；使用超声破碎菌体；4 ℃ 16 000 r/min离心50 min，收集上清和沉淀；然后取少量上清及沉淀分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测蛋白的表达，剩余上清及沉淀置于4 ℃保存备用。

1.4.3 包涵体蛋白的纯化 沉淀以50 mL镍柱平衡缓冲液重悬，加入DTT至终浓度1 mmol/L；超声促进杂蛋白溶解，离心去上清；重复上述步骤至上清透明；沉淀以PBS重悬，超声，离心去上清；使用3 mL 6 mol/L盐酸胍重悬包涵体，加DTT至终浓度5 mmol/L； 37 ℃振荡3 h至包涵体全部溶解，离心去上清。

1.4.4 包涵体蛋白复性 使用2倍体积的3 mol/L盐酸胍稀释蛋白溶液，在4 ℃环境下用注射器逐滴缓慢加入到200 mL复性液(pH 8.0)中，把转速调节至最大值，搅拌24 h；降低转速，搅拌24 h；取蛋白溶液于透析袋中，以PEG20000浓缩体积至50-100 mL；4 ℃以PBS透析过夜；取蛋白溶液，以PEG20000浓缩体积至2-4 mL；继续在4 ℃条件下以PBS透析过夜，取蛋白溶液进行SDS-PAGE检测。

1.4.5 复性蛋白纯化 用0.22 µm过滤器把上清蛋白溶液过滤备用；准备镍亲和层析柱；将上清蛋白溶液缓慢过柱，使用镍柱平衡缓冲液(pH 8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)；分别以20，60，200，500 mmol/L咪唑洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；上述每一步都需收集样品进行SDS-PAGE电泳检测洗涤情况；最后用3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以体积分数为20%乙醇封柱。

1.4.6 Dot blotting检测Nkx2.5分离纯化后的蛋白 把分离纯化后的各次蛋白样本分别加到硝酸纤维素膜上，再加入Nkx2.5单克隆抗体，4 ℃条件下孵育过夜；次日加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温条件下孵育2 h，加入显色液，在暗室中显影冲片。阳性结果呈现黑色斑点，阴性结果不显影。阴性对照为无关蛋白样品。

1.4.7 纳米材料与蛋白结合参照实验室前期方法^[18]，在200 μL Nkx2.5蛋白溶液(100 mg/L)中，加入纳米转导材料(8 g/L)0.4 μL，使纳米粒子与蛋白质的摩尔比为4∶1，置4 ℃ 条件下，搅拌过夜。

1.4.8 重组蛋白细胞转导实验 以人骨髓间充质干细胞为研究对象，细胞培养基中加入上述纳米-Nkx2.5蛋白，蛋白工作质量浓度为0.4 mg/L，12 h后固定细胞，采用免疫荧光法检测细胞内蛋白的转染情况。

1.4.9 细胞重编程实验 在培养皿中接种人骨髓间充质干细胞，待细胞长满至70%-80%，实验组在基础培养液中加入终质量浓度为0.4 mg/L的纳米-Nkx2.5，与人骨髓间充质干细胞过夜孵育，对照组培养基中未加入纳米-Nkx2.5；12 h后更换为基础培养液，此培养液不含蛋白；48 h后再次给予蛋白诱导。以上蛋白诱导步骤重复4次。基础培养液中含有0.4 mmol/L α-硫代甘油和2 mmol/L谷氨酰胺。每天观察细胞形态变化，培养至第8天时，采用免疫荧光法和Western Blot检测人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转分化情况。

1.4.10 细胞免疫荧光检测纳米-Nkx2.5复合体转染后心肌细胞标志基因的表达 细胞去除培养基，PBS清洗3次；40 g/L多聚甲醛室温固定10 min；PBS清洗3次，每次5-10 min；0.2% tritonX-100室温下通透15 min；4%BSA/ 0.2% tritonX-100室温封闭30 min；吸干多余液体；加入鼠来源单克隆一抗anti-MHC，4 ℃孵育过夜；PBS清洗3次，每次5-10 min；吸干多余液体；加入羊抗鼠二抗，室温避光孵育1 h，PBS清洗3次，每次5-10 min；吸干多余液体；DAPI复染细胞核后封固；置荧光显微镜下观察细胞并拍照；同时计算1 000个细胞中含有绿色荧光的细胞数目。

1.4.11 Western Blot检测Nkx2.5蛋白和心肌细胞标志蛋白MHC的表达 细胞去除培养基，PBS洗3次，加入细胞裂解液，冰上刮取细胞进行总蛋白提取；使用BCA法测定细胞总蛋白浓度；95 ℃蛋白变性8 min；使用预制胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，各孔的上样体积根据前面测得的蛋白浓度计算，电压调至140 V，电泳1.5 h后停止。电泳结束后，取出胶，开始转膜，放冰盒上进行，将电流调到200 mA，转膜2 h；取出膜，用5%脱脂奶粉在摇床下封闭1 h；4 ℃摇床上孵育一抗过夜；TBST漂洗3次，每次5 min；常温摇床上孵育二抗1 h；TBST漂洗3次，每次5 min；进行显色和曝光。

1.5 主要观察指标 ①Nkx2.5重组蛋白诱导表达情况；②纳米-Nkx2.5复合体转染骨髓间充质干细胞的转染率；③Nkx2.5重组蛋白能否促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

研究表明，Nkx2.5与人先天性心脏病密切相关^[19-25]，其参与了心脏前体细胞分化、房室分隔、心脏环化和传导系统的形成，是影响心脏发育的关键转录因子之一，表达贯穿心脏发育的整个过程。近年来，国内外众多学者都在关注Nkx2.5与心脏疾病发生的确切机制和临床应用^[26-34]，因此，构建Nkx2.5原核表达载体对研究其在心肌分化、心脏发育中的作用和心肌再生修复中的应用是非常有利的。

随着生物技术的发展，人们能利用DNA重组技术将所需的编码蛋白DNA序列克隆到表达载体上，可以实现目的蛋白的大量表达^[35-37]。该研究利用镍柱亲和层析法分离纯化裂解上清中的Nkx2.5蛋白，能获得较好的分离效果。

目前，大多数细胞重编程采用miRNA、化学小分子或病毒方式进行干扰，但通过质粒或者病毒过表达的方式重编程效率低下，且基因整合或者病毒介导机制可能会在临床应用方面存在安全性问题^[28^，^38-39]。小分子化合物诱导重编程由于受细胞的信号传导影响因素较多，作用机制复杂，难以获得稳定而高效细胞重编程效果。相较而言，蛋白质的诱导方式安全且有效，具有一定的临床应用前景。课题组先前已采用新型纳米材料转运GATA4、TBX5、MEF2C和HAND2等心脏特异性转录因子到人成纤维细胞内，成功将其重编程为了心脏祖细胞^[40]。但目前尚未有报道关于Nkx2.5在细胞转分化过程中的作用。

该研究使用实验室前期研究所得的纳米转导材料，该纳米载体与蛋白质的摩尔比为4∶1时，具有较高转染率；当转染的复合体质量浓度低于4 mg/L时，对细胞无明显的毒性作用^[18]。将已鉴定的纯化蛋白与Nkx2.5形成复合体后转染骨髓间充质干细胞，能获得较高转染率。此方法与目前应用最多的病毒型载体转染相比，具有较高转染效率；同时，可避免病毒所介导的随机整合和免疫排斥反应等可能潜在危害，具有较好的安全性。Nkx2.5重组蛋白干预处理人骨髓间充质干细胞后，可见人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转化。从上述结果可见，该研究所构建的Nkx2.5重组蛋白可应用在细胞重编程中，为心肌细胞的再生研究提供了一个新途径。但目前重编程为诱导心肌样细胞的效率还有待进一步提高，后续拟加入其他心肌转录因子共同作用并进一步优化研究方案，以提高重编程效率，为后续在心肌梗死治疗、心力衰竭预防等心肌再生修复的临床应用中提供种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

心脏转录因子Nkx2.5重组蛋白对人骨髓间充质干细胞向心肌样细胞转分化的作用

Expression of recombinant Nkx2.5 and its effect during human bone marrow mesenchymal stem cells reprogramming into cardiomyocytes

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