脂肪干细胞移植联合乌司他丁对急性肠缺血再灌注损伤的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0995

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
肠缺血再灌注损伤：是一种复杂的病理生理改变，当肠屏障功能发生障碍时，将导致肠内细菌及毒素移位、促炎因子大量释放，进而发生全身炎性反应综合征、多器官功能障碍。目前认为，除氧自由基损伤和细胞凋亡外，再灌注过程中包括血管内皮细胞等组织细胞的炎性反应造成的损伤也引起了学术界的重视。
脂肪干细胞移植联合乌司他丁治疗肠道缺血再灌注损伤：近年来多项研究显示乌司他丁可以通过调节机体免疫因子和抑制炎症反应、氧化应激等途径改善急性肠道缺血再灌注损伤。脂肪干细胞移植可以明显缓解心肌、肝脏、脑等器官的缺血再灌注损伤，其可能是通过缓解炎症反应，促进细胞功能恢复，抑制机体氧化应激实现的。

摘要
背景：研究表明乌司他丁可抑制小肠细胞凋亡，有助于减轻由于缺血再灌注引起的肠道损伤。另有研究表明移植的间充质干细胞能够迁移并定居到受损肠道，对肠缺血再灌注损伤也有一定的治疗作用。在乌司他丁治疗的基础上，联合脂肪干细胞移植可能具有协同作用，相互提高治疗效果。
目的：探讨乌司他丁联合脂肪干细胞移植对大鼠急性肠缺血再灌注损伤的修复作用及其可能机制。
方法：105只SD大鼠，随机取20只为正常对照组采用生理盐水灌肠和尾静脉注射生理盐水，余85只用TNB灌肠以建立急性肠道缺血再灌注损伤模型，最终建模成功80只大鼠，将之随机均分为4组，其中模型组尾静脉注射生理盐水，脂肪干细胞组尾静脉注射PKH26标记的脂肪干细胞悬液，乌司他丁组腹腔注射乌司他丁；联合治疗组尾静脉注射脂肪干细胞悬液，同时腹腔注射乌司他丁，1次/d，连续3 d。治疗3 d后取结肠组织行苏木精-伊红染色、TUNEL染色、RT-PCR、Western blot检测。
结果与结论：①脂肪干细胞组和联合治疗组大鼠结肠组织内可见PKH26标记的阳性细胞；②模型组大鼠肠道组织损伤明显加重，肠黏膜上皮细胞脱落较多；脂肪干细胞组和乌司他丁组肠道组织损伤明显减轻，联合治疗组肠道组织损伤最轻；③模型组结肠细胞凋亡最多，脂肪干细胞组和乌司他丁组次之，联合治疗组最少；④脂肪干细胞组和乌司他丁组结肠组织中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达水平较模型组明显降低(P < 0.05)，联合治疗组结肠组织中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达水平较脂肪干细胞组和乌司他丁组也有明显降低(P < 0.05)；⑤结果表明，基质金属蛋白酶2及基质金属蛋白酶9可能参与了急性肠缺血再灌注损伤发生过程，脂肪干细胞移植联合乌司他丁治疗具有协同作用，明显减轻了大鼠肠缺血再灌注损伤程度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-8856-3152(王树英)

关键词: 脂肪干细胞, 乌司他丁, 细胞移植, 大鼠, 肠道损伤, 缺血再灌注损伤, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that ulinastatin inhibits apoptosis in small intestinal cells and helps relieve intestinal ischemia-reperfusion injury. Transplanted mesenchymal stem cells can migrate and colonize in the damaged intestinal tract, and thereby have a certain therapeutic effect on intestinal ischemia-reperfusion injury. Ulinastatin treatment combined with adipose stem cell transplantation may have synergistic effects and enhance the therapeutic effects.
OBJECTIVE: To explore the repair effect and possible mechanism of ulinastatin combined with adipose-derived stem cells (ADSCs) transplantation on acute intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.
METHODS: A total of 105 Sprague-Dawley rats were selected, 20 of which were randomly selected as normal control group and received saline enemas and tail vein injection of normal saline. The remaining 85 rats were used to make animal models of acute intestinal ischemia-reperfusion injury, and equally randomized into 4 groups: model group treated with normal saline via tail vein, ADSCs group treated with PKH26 labeled ADSCs suspension via tail vein, ulinastatin group treated with intraperitoneal injection of ulinastatin, and combined treatment group treated with ADSCs suspension via tail vein and intraperitoneal injection of ulinastatin (once a day, for 3 consecutive days). After 3 days of treatment, the colon tissues of rats in each group were taken for hematoxylin-eosin staining, TUNEL staining, RT-PCR detection and western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The positive cells labeled by PKH26 were observed in ADSCs and combined treatment group. (2) Compared with the normal control group, the intestional damage in the model group significantly aggravated and the exfoliated cells of colon tissue were increased in number, while the tissue damage levels were significantly reduced and the exfoliated cells were also reduced in number in the ADSCs group, ulinastatin group and combined treatment group. The most significant improvement in tissue damage was found in the combined treatment group. (3) The number of apoptotic cells was the most in the model group followed by ADSCs and ulinastatin groups, and least in the combined treatment group. (4) The levels of matrix metalloproteinases 2, 9 in the ADSCs and ulinastatin groups were significantly reduced compared with the model group (P < 0.05), but significantly higher than those in the combined treatment group (P < 0.05). In conclusion, matrix metalloproteinases 2, 9 may participate in the process of acute intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. ADSCs transplantation combined with ulinastatin have synergistic effects, and can considerably relieve intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.

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Key words: Adipose Tissue, Stem Cell Transplantation, Colon, Reperfusion Injury, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王树英. 脂肪干细胞移植联合乌司他丁对急性肠缺血再灌注损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4601-4606.

Wang Shu-ying. Ulinastatin combined with adipose-derived stromal cell transplantation for treatment of acute intestinal ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(29): 4601-4606.

图/表（结果） 2

2.1 脂肪干细胞的形态 细胞复苏6 h后即可见到有少量的脂肪干细胞贴壁，接种24 h后脂肪干细胞呈现出多角形或者长梭形的形态(图1A)。PKH26标记脂肪干细胞发出红色荧光，标记后细胞生长状态良好(图1B)。

2.2 结肠组织苏木精-伊红染色结果 见图2。与正常对照组比较，模型组结肠组织具有明显的损伤，可见较多的脱落细胞。与模型组相比，脂肪干细胞组和乌司他丁组结肠组织损伤明显减轻，细胞脱落也明显较少，联合治疗组结肠组织损伤最轻，结肠组织细胞脱落最少。

2.3 PKH26标记的脂肪干细胞的存活及分布情况 见图3。脂肪干细胞组和联合治疗组大鼠结肠组织镜下可见PKH26标记的脂肪干细胞，其数目分别为(13.58±2.09)个/高倍镜视野和(25.27±2.76)个/高倍镜视野。而正常对照组、模型组以及乌司他丁组均未见到PKH26标记的脂肪干细胞，由此可以表明移植的脂肪干细胞经过迁移已到达并分布于大鼠结肠组织中。

2.4 结肠细胞凋亡情况 见图4。与正常对照组[(3.80±0.63)%]相比，模型组结肠组织细胞凋亡率显著升高[(39.1±0.72)%]；乌司他丁组和脂肪干细胞组细胞凋亡率[(24.8±0.46)%，(24.4±0.43)%]显著低于模型对照组，但高于正常对照组；联合治疗组结肠细胞凋亡率明显减少[(10.1±0.74)%]。

2.5 各组结肠组织基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达水平 见表2和图5，6。与正常对照组相比，模型组结肠组织基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的基因和蛋白表达水平均显著提高(P < 0.05)，脂肪干细胞组和乌司他丁组表达水平较模型组明显降低(P < 0.05)，联合治疗组基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9基因和蛋白表达水平明显低于脂肪干细胞组和乌司他丁组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年2月至2018年1月在天津医科大学实验动物中心实验室完成。

1.3 材料 冻存脂肪干细胞购买于中国医学科学院。胰蛋白酶(美国Sigma公司)；DMEM培养基、胎牛血清、PBS(Hyclone公司)；细胞培养箱(Heraeus Sepatech公司)；Trizol试剂盒(Invitrogen公司)；基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9一抗为兔抗人多克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔多克隆抗体；内参GAPDH一抗为小鼠抗人单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠多克隆抗体，所有抗体均由艾康生物技术(杭州)有限公司提供。

雄性成年SD大鼠105只，体质量约240 g，由北京维通利华动物实验技术有限公司提供，生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号：SYXK(津) 2014-0002。所有大鼠于室温25 ℃，湿度50%-80%，SPF环境下自由饮水和采食。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪干细胞复苏与标记 将购买的脂肪干细胞迅速放入38 ℃水浴中，并不时摇动，在60 s内使其完全融化，然后在无菌环境下取出细胞，进行稀释、离心、弃上清、洗涤细胞等操作，用DMEM完全培养液重悬细胞并调整脂肪干细胞浓度为1×10⁹ L^-1，培养7 d之后对细胞进行荧光标记。向细胞悬液中加入5 μL PKH26，在细胞培养箱中孵育25 min，重复此操作2次后显微镜下观察细胞形态和细胞标记情况。

1.4.2 实验分组与建模 从105只SD大鼠中随机选取20只大鼠作为正常对照组，给剩余的85只大鼠用TNB灌肠以建立急性肠道缺血再灌注损伤模型。最终建模成功的大鼠有80只，随机分为模型组、脂肪干细胞组、乌司他丁组和联合治疗组，每组20只。正常对照组和模型组SD大鼠经尾静脉注射20 μL生理盐水；脂肪干细胞组经尾静脉注射20 μL PKH26标记的脂肪干细胞悬液(细胞浓度为2×10⁷ L^-1)；乌司他丁组腹腔注射乌司他丁10×10⁴ U/kg；联合治疗组大鼠经尾静脉注射20 μL PKH26标记的脂肪干细胞悬液(细胞浓度为2×10⁷ L^-1)，同时经腹腔注射乌司他丁10×10⁴ U/kg，每天治疗1次，连续3 d。治疗3 d后，每组随机挑选5只大鼠水合氯醛注射麻醉，打开胸腔用PBS灌流冲洗2 min，取一部分结肠组织在-80 ℃下保存用于RT-PCR和Western blot检测，另一部分结肠组织用于病理检测。

1.4.3 结肠组织苏木精-伊红染色 取中段结肠组织，进行脱水浸蜡包埋后制成6 μm厚的薄片，放到加热的水中熨平，再贴到载玻片上，放入恒温箱中烘干，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，进行苏木精-伊红染色，在显微镜下观察结肠组织病理变化。

1.4.4 TUNEL法检测结肠细胞凋亡情况 取中段结肠组织制作石蜡切片后脱蜡处理，向切片上滴加复合消化酶室温孵化20 min；洗涤后滴加50 μL TUNEL标记反应混合液，在湿盒中37 ℃孵育1 h，滴加POD2转化液50 μL，湿盒37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，DAB显色；进行苏木精-伊红复染后即可在荧光显微镜下观察凋亡细胞数目。

1.4.5 RT-PCR检测基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9基因表达 取出冻存结肠组织，研磨匀浆后使用Trizol试剂提取大鼠结肠组织中的总RNA，反转录获得cDNA，进行RT-PCR反应检测基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9基因表达。通过Primer Primer 5.0软件设计引物，见表1。采用Image proplus6.0图像分析软件分析电泳条带的吸光度值，进而计算其相对表达量。

1.4.6 Western blot检测基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9蛋白表达 取出冻存结肠组织，加入裂解液制成匀浆液，离心取上清液，采用BCA法测定总蛋白浓度，然后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、摇床封闭2 h；加入一抗孵育过夜，加入二抗孵育2 h，PBS洗涤后用化学发光试剂显影，扫描图像并半定量分析，测定基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9蛋白相对表达水平，以GAPDH为内参。

1.5 主要观察指标 ①各组结肠组织苏木精-伊红染色结果；②各组结肠细胞凋亡情况；③各组结肠组织中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的基因表达水平；④各组结肠组织中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的蛋白表达水平。

1.6 统计学分析 采用SPSS 16.0进行统计学分析，实验数据以x(_)±s形式表示，用t 检验来比较组间差异，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

急性肠道缺血再灌注是临床上常见的一种损伤，在严重感染、休克、手术、外伤等疾病的病理演变过程中起重要作用，其可以引发严重的败血症或者毒血症，甚至引起严重的多种器官炎症反应乃至衰竭^[19-21]。因此，寻求一种可靠有效的治疗方案显得尤为重要。近年来多项研究显示乌司他丁可以通过调节机体免疫因子和抑制炎症反应、氧化应激等途径改善急性肠道缺血再灌注损伤^[22-27]。脂肪干细胞移植可以明显缓解心肌、肝脏、脑等器官的缺血再灌注损伤，其可能是通过缓解炎症反应，促进细胞功能恢复，抑制机体氧化应激实现的^[28-34]。

实验将脂肪干细胞移植与乌司他丁治疗相互结合，研究二者联合对大鼠急性肠道缺血再灌注损伤的修复作用，以期为该病的治疗提供借鉴和依据。脂肪干细胞复苏标记后，显微镜下可见到明显的PKH26标记的活力正常阳性细胞，由此可知脂肪干细胞标记成功^[35-36]。根据模型组大鼠机体结肠组织形态变化和结肠细胞凋亡情况可知急性肠道缺血再灌注模型建立成功^[37]。治疗3 d之后，脂肪干细胞组和联合治疗组大鼠结肠组织中可见到较多的脂肪干细胞分布于结肠组织中，由此可知在发生急性肠道缺血再灌注后脂肪干细胞成功移植到了损伤结肠部。根据组织形态和凋亡细胞数目比较可知，脂肪干细胞和乌司他丁可以显著缓解肠道缺血再灌注引起的机体损伤，而二者联合的治疗作用更强。该研究显示模型组大鼠结肠组织中的基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9基因和蛋白呈高表达，脂肪干细胞组和联合治疗组结肠组织中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9的表达则低于模型组，联合治疗组则低于单独治疗组。基质金属蛋白酶是锌离子依赖蛋白酶家族，该家族可以参与细胞外基质的代谢，其对保持细胞外基质的营养和防止底物堆积具有重要的作用^[38-40]。基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的激活参与了细胞外基质的降解，是一类结构中含Zn²⁺和Ca²⁺的蛋白水解酶类，主要参与细胞外基质的代谢。它们在血管形成、伤口愈合、肿瘤浸润和纤维化等方面起着重要的作用^[41-43]。该研究显示急性肠道缺血再灌注模型大鼠结肠组织中基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9基因和蛋白表达水平显著升高，其可能在损伤进程中促进了细胞外基质的降解，从而导致了细胞的凋亡和组织器官功能的退化^[44]。研究结果显示单独治疗组中大鼠结肠组织中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达水平显著降低；而联合治疗组中大鼠结肠组织中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9表达水平则显著低于单独治疗组。据此可知脂肪干细胞移植和乌司他丁可能通过降低基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达水平减少细胞外基质降解从而缓解肠道缺血再灌注损伤。

总之，将脂肪干细胞和乌司他丁相互联合治疗急性肠道缺血再灌注损伤，其能够减少结肠细胞凋亡，降低结肠组织中基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达水平，并促进结肠组织修复。

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