猪脱细胞软骨基质生物相容性及细胞毒性评价系统的建立

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0920

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (22): 3539-3544.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0920

• 材料生物相容性 material biocompatibility • 上一篇下一篇

猪脱细胞软骨基质生物相容性及细胞毒性评价系统的建立

王效，徐宏光，肖良，刘晨，金中行，沈阳

皖南医学院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市 241001

收稿日期:2018-05-19 出版日期:2018-08-08 发布日期:2018-08-08
通讯作者: 徐宏光，教授，皖南医学院弋矶山医院脊柱外科，安徽省芜湖市 241001
作者简介:王效，男，1989年生，安徽省界首市人，汉族，皖南医学院在读硕士，主要从事脊柱外科与老年骨病研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81572185)；安徽省自然科学基金面上项目(1708085MH185)；安徽省科技厅对外科技合作项目(1704e1002229)；安徽省自然科学基金青年项目(1708085QH205)；皖南医学院中青年科研基金项目(WK2016F02)；安徽省自然科学基金青年项目(1808085QH275)

Porcine decellular endplate cartilage matrix: biocompatibility assessment and establishment of a cytotoxicity evaluation system

Wang Xiao, Xu Hong-guang, Xiao Liang, Liu Chen, Jin Zhong-xing, Shen Yang

Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China

Received:2018-05-19 Online:2018-08-08 Published:2018-08-08
Contact: Xu Hong-guang, Professor, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China
About author:Wang Xiao, Master candidate, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, Anhui Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81572185; the Natural Science Foundation of Anhui Province, No. 1708085MH185, 1708085QH205, 1808085QH275; the External Cooperation Projects of the Science and Technology Department of Anhui Province, No. 1704e1002229; Young and Middle-aged Research Fund Project of Wannan Medical College, No. WK2016F02

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

脱细胞基质材料：众多研究已证实细胞表面存在有特异性的免疫球蛋白，能够引起抗原抗体反应。因此，如果能够去除天然材料中的细胞成分并保留其基质成分，将会有效降低天然材料的免疫源性，同时能够保持材料的机械强度。而具备这种特点的天然生物材料便是脱细胞基质材料。

生物相容性：是指生物材料在宿主特定的环境和部位，与宿主直接或间接产生反应的能力，是在宿主体内的动态变化过程中能够耐受宿主各系统作用而保持相对稳定，不被排斥和破坏的生物学特性，包括组织相容性和血液相容性。

背景：相对于其他用于支架材料的高分子化合物，脱软骨细胞基质能够模拟出更接近原生理状态下的细胞外环境，由其制备的椎间盘支架弹性模量也更加接近软骨组织。

目的：制备脱细胞软骨基质，并从细胞和活体两方面评价其生物相容性。

方法：将猪软骨粉碎后，经胰酶、核酶及TritonX-100处理得到脱细胞软骨基质。①细胞毒性实验：将脱细胞基质溶于醋酸，制备成脱细胞基质膜。将SD大鼠腰椎终板软骨干细胞接种于脱细胞基质膜上，培养1-5 d，采用CCK-8检测软骨干细胞在基质膜上的增殖情况，评价细胞毒性分级；②动物体内毒性实验：将含有脱细胞基质的醋酸(实验组)与醋酸(对照组)分别注射至SD大鼠背部皮下，形成皮丘，注射后36 h内观察大鼠体温与皮丘直径变化。

结果与结论：①细胞毒性实验：倒置显微镜下可见，腰椎终板软骨干细胞接种于脱细胞基质膜2 d即贴壁，呈梭形生长，接种5 d内的细胞相对增殖率均在80%以上，细胞毒性分级为0至1级；②动物体内毒性实验：注射后即刻，两组大鼠背部均可见皮丘形成，注射36 h内皮丘内溶液被完全吸收，并且对照组吸收速度快于实验组，两组皮丘边缘均无红肿现象；注射36 h内，实验组与对照组大鼠体温均未超过37.5 ℃；③结果表明：脱细胞软骨基质具有很好的生物相容性，符合生物支架选材标准。

ORCID: 0000-0001-5231-3779(徐宏光)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 脱细胞软骨基质, 终板软骨干细胞, 生物相容性评价, 细胞毒性, 国家自然科学基金, 生物材料

Abstract:

BACKGROUND: Compared to other high-molecular compounds used for scaffold materials, the decellular endplate cartilage matrix (DEPM) can simulate the extracellular environment closer to the original physiological state, and the elastic modulus of the intervertebral disc scaffold made of DEPM therefore is closer to that of the cartilage tissue.

OBJECTIVE: To prepare DEPM and explore its biocompatibility at cellular level and in vivo.

METHODS: Porcine endplate cartilage samples were crushed and digested with Trypsin combined with ribozyme and TritonX-100 to obtain DEPM. (1) Cytotoxicity test: After dissolved in acetic acid, the DEPM was prepared into the acellular matrix membrane. Cartilage stem cells from the lumbar endplate of Sprague-Dawley rats were seeded onto the acellular matrix membrane, and cell proliferation was detected using cell counting kit-8 after 1-5 days of culture. Then cytotoxicity of the cells was graded. (2) Toxicity test in vivo: Acetic acid containing DEPM (experimental) or not (control) was subcutaneously injected into the back of Sprague-Dawley rats to form a bump. Rat body temperature and bump’s size were observed within 36 hours after injection.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cytotoxicity test: Under the inverted microscope, cartilage stem cells from the lumbar endplate were adherent within 2 days after implantation, and grew in a fusiform shape. The relative cell growth rate was over 80% within 5 days after implantation, and the cell toxicity grade was level 0 to 1. (2) Toxicity test in vivo: A bump was formed on the rat back in the two groups immediately after injection, and completely disappeared within 36 hours after injection. Moreover, the absorption rate in the control group was faster than that in the experimental group. No red and swelling bump occurred in the two groups. the body temperature of the rats in the two groups did not exceed 37.5 ℃ within 36 hours after injection. To conclude, the DEPM has good biocompatibility, which is in line with the selection criteria of biological scaffolds.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Materials Testing, Extracellular Matrix, Intervertebral , Cytotoxicity Tests, Immunologic, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王效，徐宏光，肖良，刘晨，金中行，沈阳. 猪脱细胞软骨基质生物相容性及细胞毒性评价系统的建立[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(22): 3539-3544.

Wang Xiao, Xu Hong-guang, Xiao Liang, Liu Chen, Jin Zhong-xing, Shen Yang. Porcine decellular endplate cartilage matrix: biocompatibility assessment and establishment of a cytotoxicity evaluation system[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(22): 3539-3544.

图/表（结果） 6

2.1 脱细胞软骨基质的特性制备的脱细胞软骨基质呈乳白色糜状，质软(图1A)。制备的脱细胞基质膜呈无色的透明凝胶状，不易溶于水(图1B)；DAPI染色后免疫荧光显微镜下观察，软骨基质脱细胞之后未见被染成蓝色的细胞核(图1C)，说明脱细胞之后无细胞残留，脱细胞效果较好。

扫面电镜下可见脱细胞软骨基质呈现出无序排列的胶原纤维，其上无细胞残留(图1D)。傅里叶红外光谱分析脱细胞软骨基质在1 650 cm^-1和1 444 cm^-1处出现吸收峰，分别对应酰胺Ⅰ键和酰胺Ⅱ键的特征性吸收峰，说明其成分主要为胶原蛋白；在1 078 cm^-1和567 cm^-1出现吸收峰，说明软骨基质中含有多糖类物质(图1E)。

2.2 大鼠腰椎终板软骨干细胞的分离与鉴定将大鼠原代终板软骨细胞低密度接种培养，3 d可见有细胞贴壁，随后可见贴壁的细胞不断分裂增殖，形成细胞集落，10 d后可见较大的细胞集落形成(图2A)。流式细胞检测，细胞表面CD44和CD90表达率高达90.75%和99.7%(图2B，C)。后续的成骨、成脂肪及成软骨也验证所获取的细胞具有干细胞特性。

2.3 腰椎终板软骨干细胞与脱细胞软骨基质的细胞相容性实验组将终板软骨干细胞接种于含有脱细胞软骨基质的96孔板，倒置相差显微镜下观察细胞在接种后2 h就可以发生贴壁，相较于对照组，细胞能更好地呈现梭形(图3A)。CCK-8检测并绘制细胞增殖曲线，结果显示实验组和对照组有相似的增殖趋势(图3B)，说明生长在脱细胞软骨基质上的终板软骨干细胞和生长在空白板上一样具有分裂增殖能力。细胞相对增殖评级发现(表1)，实验组终板软骨干细胞接种后前2 d内细胞毒性评级为0级，说明其生长速度大于对照组；在3-5 d内评级为1级，说明其增殖率略低于对照组，但综合培养5 d的增殖情况，脱细胞软骨基质与大鼠腰椎终板软骨干细胞有很好的生物相容性，符合组织工程支架的选材标准。

null

2.4 脱细胞软骨基质的动物体内相容性吸取溶于醋酸溶液的脱细胞软骨基质悬液和醋酸溶液各1 mL分别注射到大鼠皮下后，测量注射后即刻及注射后12，24，36 h的大鼠体温及皮丘直径。注射后即刻可见大鼠背部皮丘形成(图4A)，注射后36 h皮丘内溶液被完全吸收，对照组吸收速度大于实验组，两组均未见皮丘边缘有红肿形成(图4B)。

注射后不同时间点的皮丘直径比较无差异(表2)，说明注射猪脱细胞软骨基质未引起大鼠急性免疫反应。同时测量了实验组和对照组在相应时间段内的体温，发现实验组大鼠体温波动在36.4-37.1 ℃，对照组在35.8-37.0 ℃，均未超过37.5 ℃，也可说明猪脱细胞软骨基质具有很好的组织相容性(图4D)。

参考文献

[1] Chiu TJ,Wang JW,Chen YJ,et al.Intraarterial Cisplatin and intravenous adriamycin in nonmetastatic osteosarcoma of the extremities: a single institution experience in Taiwan.Chang Gung Med J.2009;32(1):72-80.

[2] Hughes SP,Freemont AJ,Hukins DW,et al.The pathogenesis of degeneration of the intervertebral disc and emerging therapies in the management of back pain.J Bone Joint Surg Br.2012;94(10): 1298-304.

[3] Andersson GB.Epidemiological features of chronic low-back pain. Lancet.1999;354(9178): 581-585.

[4] 周志杰.腰椎融合术后邻近节段退变的手术相关危险因素分析和早期临床观察[D].浙江大学,2012.

[5] Hansraj KK.Stem Cells in Spine Surgery.Surg Technol Int.2016;XXIX: 348-358.

[6] 秦春英,梁继文,张锋,等.丝素蛋白在医学领域的应用研究[J].轻纺工业与技术,2010,39(5):63-65.

[7] Jin HJ, Kaplan DL.Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature.2003;424(6952): 1057-1061.

[8] 孟永春,陈晓峰,南开辉,等.胶原/生物活性玻璃/壳聚糖增强型复合支架[J].中国组织工程研究,2014, 18(21):3367-3373.

[9] 帕尔哈提•阿布肚热合曼,木合塔尔•霍加,多力昆•吾甫尔,等.体外诱导聚氧乙烯-聚氧丙烯醚共聚物水凝胶内兔牙髓干细胞成骨向分化的研究[J].中华口腔医学杂志,2016,51(7):420-425.

[10] Zhang J,Nie J,Zhang Q,et al.Preparation and characterization of bionic bone structure chitosan/hydroxyapatite scaffold for bone tissue engineering.J Biomater Sci Polym Ed.2014;25(1): 61-74.

[11] 张旭婧,许燕,周建平,等.骨组织工程支架的不同孔隙率对成形性能的影响分析[J].机械设计与研究, 2016,32(5):151-154.

[12] 刘晨,王晟昊,王奕彬,等.兔纤维环干细胞与猪脱细胞纤维环基质的生物相容性[J].中国组织工程研究, 2014,18(41):6655-6660.

[13] Sekiya I,Larson BL,Smith JR,et al.Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality.Stem Cells.2002;20(6): 530-541.

[14] Risbud MV,Guttapalli A,Tsai TT,et al.Evidence for skeletal progenitor cells in the degenerate human intervertebral disc.Spine(Phila Pa 1976). 2007;32(23):2537-2544.

[15] Lee DH,Joo SD,Han SB,et al.Isolation and expansion of synovial CD34(-)CD44(+)CD90(+) mesenchymal stem cells: comparison of an enzymatic method and a direct explant technique. Connect Tissue Res. 2011;52(3):226-234.

[16] Hou Y,Wang X,Yang J,et al.Development and biocompatibility evaluation of biodegradable bacterial cellulose as a novel peripheral nerve scaffold.J Biomed Mater Res A. 2018;106(5):1288-1298.

[17] 郝和平.ISO10993-1.医疗器械生物学评鉴标准实施指南[M].北京:中国标准出版社,2000: 285-295,334-347.

[18] 孙皎.生物材料和医疗器械的生物学评价[J].中国医疗器械杂志,2003, 27(1):1-3,8.

[19] 孙立魁,骆红宇.医疗器械生物学评价国际标准进展与2010年ISO/TC194年会[J].中国医疗器械杂志, 2010,34(4):245.

[20] 熊党生.生物材料与组织工程[M].北京:科学出版社,2010:25-28.

[21] 杜晓丹,陈鸿波,杨昭鹏.我国医疗器械检验机构产品技术要求预评价工作现状、问题和建议[J].中国药事, 2017,31(9):1085-1089.

[22] 丁建勇,郑如恒,乔玉磊,等.深低温冷冻保存降低大鼠气管移植物免疫原性的机制[J].复旦学报(医学版),2008,35(1):94-98.

[23] 邓玖征,张友乐,李翔.低温冻存同种异体骨膜和骨髓移植免疫原性研究[J].中国修复重建外科杂志,2014,28(5):649-653.

[24] 朱祥,陈旭义,刘英富,等.胶原及丝素蛋白支架材料在脊髓组织工程中的应用[J].中国组织工程研究,2014,18(39):6359-6363.

[25] 徐云强,刘迎节,李瑞欣,等.胶原/丝素蛋白神经导管修复周围神经缺损的研究与应用进展[J].中国组织工程研究, 2016,20(38):5745-5751.

[26] 田莉,闵思佳.丝素蛋白在组织工程细胞支架方面的研究进展[J].生物医学工程学杂志,2006,23(6): 1375-1378.

[27] 丁晓明,徐宝山,杨强.丝素蛋白应用于椎间盘纤维环组织工程的研究进展[J].中国矫形外科杂志,2014,22(7):613-616.

引言

导致椎间盘退变的因素有年龄、力学刺激及创伤等，其中力学刺激扮演重要角色^[1]。椎间盘退变会诱发患者腰部疼痛^[2]，使其无法站立及负重，使社会劳动力大量丧失^[3]，为亿万家庭带来了长期的家庭负担。而关于椎间盘退变的治疗，临床上多以针对腰部疼痛进行的内科治疗为主。部分符合手术指征者，也可使用外科方法解决。虽然外科手术短期可有效解决患者的腰部疼痛症状，但不能改变腰椎间盘退变的病变进程，长期还会导致手术临近腰椎节段的退变^[4]。

近年来，干细胞与组织工程的兴起为椎间盘退变治疗提供了新的思路^[5]，从生物学方面治疗椎间盘退变离不开3方面：细胞、载体及细胞因子。如果单纯的将细胞注射到退变的腰椎间盘中，因缺乏固有层结构，其注射的细胞流动性增加^[6-7]，会导致椎间盘边缘骨刺的发生。支架作为一种载体，提供了细胞黏附的环境，减少了其并发症的产生。关于载体大多数是各种类型的生物支架，目前的研究将支架分为3种：天然高分子支架，比如再生纤维、胶原透明质酸等^[8]；人工合成支架，比如硅橡胶，涤纶、尼龙聚烯烃等^[9]；仿生支架，比如胶原与聚乙烯醇的交联杂化物等^[10]。这些支架提供了细胞生长的外环境，应具有良好的生物相容性和降解率，并有一定的形态和孔径率^[11]，便于营养物质的运输。

此次实验通过一定方法从猪软骨组织中获得脱细胞软骨基质，制备脱细胞基质膜，将前期研究获得的大鼠腰椎终板软骨干细胞种植于基质膜上，从细胞学方面评价家猪脱细胞软骨基质与大鼠终板软骨干细胞的组织相容性，并创新性地建立了评价系统；另外，将脱细胞软骨基质注射到大鼠皮下，从组织学验证脱细胞基质用于活体的可能性。基于细胞和组织方面的生物相容性评价，验证脱细胞软骨基质对于异体植入的免疫排斥反应，以期为下面的载体构建及治疗椎间盘退变奠定基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计对比观察细胞学实验与动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年11月至2018年2月在中国科学院上海生命科学院骨科分子与生物学实验室完成。

1.3 材料

实验动物：1月龄SD大鼠幼鼠5只，体质量100-200 g，雌性不拘；6月龄SD大鼠，雌雄不拘，体质量200-300 g，均购于南京青龙山实验动物研究中心。

实验试剂与仪器：DMEM/F12培养基、干细胞胎牛血清、0.25%EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；DAPI染色液、Triton X-100、0.2%Ⅱ型胶原酶(sigma）；普通胰酶、核糖核酸(RNA)酶、脱氧核糖核酸(DNA)酶(solarbio)；CCK-8增殖试剂盒(凯基生物)；组织研磨机(九阳)；红外线体温计(鱼跃)；扫描电镜(FEI Quanta250，FEI)；傅里叶变换红外光谱仪(Nicolet 8700，Thermo Nicolet)；流式细胞仪(Beckman Counter FC500 Cytometer，Beckman)。

1.4 实验方法

1.4.1 脱细胞软骨基质的制备及特性^[12] 从市场购得家猪脊柱，使用手术刀切开上下椎体之间的椎间盘，仔细剔除与终板软骨相连接的椎间盘及髓核组织，将终板软骨从椎体仔细刮下。PBS冲洗3次，将获得的腰椎终板软骨放入研磨机，加入适量干冰。待软骨冷冻后，启动研磨机。在不断重复的研磨后，收集软骨粉末。加入0.25%普通胰酶溶液，每6 h换液1次，置于37 ℃环境下消化24 h后，使用PBS冲洗3次，每次30 min。再加入TritonX-100消化24 h，继续按上述的步骤用PBS进行冲洗，最后加入含有核酶溶液(含有50 U/mL DNAase和1 U/mL RNAase，溶于tri-HCl，pH=7.5)继续消化24 h后，使用PBS冲洗6次，每次30 min。然后将所得到的脱细胞软骨基质置于-20 ℃冰箱备用。

将获得的脱细胞基质溶解于醋酸中，磁力搅拌过夜，吸取300 μL悬液加入24孔板，自然风干后，40 g/L多聚甲醛固定，加入500 μL DAPI染液，观察脱细胞后细胞核的残留情况。使用乙醇阶梯脱水，超临界点干燥，扫面电镜观察脱细胞效果及脱细胞软骨基质的形态特点，采用傅里叶红外光谱仪检测分析脱细胞软骨基质的主要成分。

1.4.2 大鼠腰椎终板软骨干细胞的获取取4周龄SD大鼠幼鼠，颈椎脱臼法处死后，全部浸没于体积分数75%乙醇中10 min，无菌条件下分离腰椎L₁-L₅，解剖显微镜下分离终板软骨，然后将分离到的软骨浸泡在含青霉素-链霉素的双抗的PBS中10 min，取出后PBS冲洗3次，剪碎至 1 mm³大小。加入0.25%EDTA-胰酶，置于37 ℃温水浴箱中40 min后，再次离心并弃上清，再加入0.2%Ⅱ型胶原酶，重新置于水浴箱中消化3 h左右，每半小时震荡1次以加速消化。待组织完全消化后用200目滤网过滤，1 500 r/min离心5 min，弃上清，重新加入培养基吹打混匀，备用。

将上述得到的原代软骨细胞按照50个/cm²的密度接种于10 cm培养皿中^[13]，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中，每3 d换液1次，连续培养12 d，培养过程中观察细胞集落形成状况。待细胞集落之间相互融合时，使用0.25% EDTA-胰酶消化并收集所得细胞，用于下一步实验。

取上述细胞体外扩增培养后，取第2代细胞，EDTA-胰酶消化收集，PBS冲洗3次，1 000 r/min离心5 min，按照每1×10⁶细胞分别加入10 μL细胞表面标记物CD44和 2 μL细胞表面标记物CD90，避光染色30 min后，流式细胞仪检测CD44和CD90的表达情况^[14-15]。

1.4.3 直接接触法细胞毒性实验

腰椎终板软骨干细胞与猪脱细胞软骨基质复合培养：将上述溶于醋酸的脱细胞软骨基质，按照20 μL/孔加到96孔板上，震荡，使脱细胞软骨基质悬液均匀铺在孔底，自然风干，紫外线照射消毒后，备用。取5块96孔板，实验组将第2代终板软骨干细胞按照1 000个/孔的密度接种于96孔板上，以不加脱细胞软骨基质的细胞为对照组，每组5个复孔。培养1 d后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于避光环境下2 h，置于酶标仪上，选择450 nm波长光检测两组各孔的吸光度，同理，连续检测2，3，4，5 d的细胞增殖情况。

接触法毒性实验评级标准：引入细胞相对增殖率的概念，表示在相同时间间隔内细胞的增殖速率。在酶标仪上测量各个孔的吸光度，计算细胞相对增殖率RGR(%)=(实验组吸光度均值/对照组吸光度均值)×100%。将细胞相对增殖率百分比转化为细胞毒性0-5级的评价标准：细胞相对增殖率≥100%，为0级；细胞相对增殖率≥75%，为1级；细胞相对增殖率≥50%，为2级；细胞相对增殖率≥25%，为3级；细胞相对增殖率≥1%，为4级；细胞相对增殖率= 0，为5级。0到1级(包含1级)表示细胞增殖能力优，脱细胞基质膜对细胞增殖基本无影响；1到2级(包含2级)表示细胞增殖能力良，脱细胞基质膜对细胞增殖产生部分影响；2到3级(包含3级)表示细胞增殖能力一般，脱细胞基质膜对细胞增殖产生较大影响；3到5级(包含5级)表示细胞增殖能力差，脱细胞基质膜对细胞增殖产生严重影响，不符合构建组织工程支架原料标准。

1.4.4 直接接触法动物活体毒性实验室温26 ℃下，取6月龄SD大鼠6只，实验组和对照组各3只，使用动物脱毛器脱毛，使每组大鼠背部呈现2 cm×2 cm大小的无毛区，实验组采用微量注射器吸取1 mL醋酸脱细胞软骨基质悬液，注射到脱毛处皮下形成一皮丘；对照组吸取1 mL醋酸，注射到大鼠皮下形成一皮丘。测量两组大鼠注射后12，24，36 h的体温及皮丘直径，观察皮丘周围是否有红肿现象。红外线体温计使用前用冰水混合物(0 ℃)校正，每次直径测量按公式皮丘直径(cm)=(皮丘最长径+皮丘最短径)/2计算皮丘直径平均值。

1.5 主要观察指标软骨干细胞在基质膜上的增殖情况；醋酸脱细胞软骨基质悬液在SD大鼠皮下形成的皮丘直径。

1.6 统计学分析以上数据采用SPSS 18.0版本软件进行统计学分析，计量资料(皮丘直径、体温)以x(_)±s表示，组间资料使用配对t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

3.1 生物相容性的概念及评价标准生物相容性是指生物材料在宿主特定的环境和部位，与宿主直接或间接产生反应的能力^[16]，是在宿主体内动态变化过程中能够耐受宿主各系统作用而保持相对稳定，不被排斥和破坏的生物学特性，包括组织相容性和血液相容性。而评价生物相容性应该从微观到宏观、局部到整体、静态到动态进行。

目前医疗器械的生物学评价，是根据国际标准化组织医疗器械生物学评价委员会制定的国际标准ISO10993-1^[17-19]，该标准多为关于医疗器械的生物学评价，具体是：实验指南的选择，关于动物福利的要求，致癌性及生殖毒性实验，与血液相互作用实验、细胞毒性体外实验、植入后局部反应实验、刺激与过敏实验、全身毒性实验等。而中国关于生物学评价关于如下方面^[20-21]：溶血评价实验、细胞毒性实验、急性全身毒性实验、过敏实验、刺激实验、植入实验、热原实验、血液相容性实验、皮内反应实验、生物降解实验、遗传毒性实验、致癌性实验、亚急性毒性实验、慢性毒性实验、生殖与发育毒性实验、药物动力学评价的实验等16个方面。

生物学评价是用来判定材料带来的任何生物学危害，评价其使用可能产生的风险，并将此风险控制在一个可接受的范围。评价实验总体包括体内和体外两大类，无论是从体外实验推及到体内应用的情况，还是从动物体内实验推及到人，这其中都包含着许多非可控因素，绝对安全是达不到的。目前，关于生物学评价的标准还未完善，判断依据多是参考现行的纲领性的标准文件，这些文件不一定代表目前最先进的检测手段，因此生物学评价应该是一种科学的、合理有效的基于风险分析基础上的细化评价。

3.2 实验的优缺点此次实验将脱细胞软骨基质溶于醋酸制备脱细胞软骨基质膜，将获得的大鼠腰椎终板软骨干细胞种植于脱细胞基质膜上，通过后期培养发现，生长在脱细胞基质膜上的干细胞比空白板上的细胞能够更好地呈现其“梭形”形态，因此，联想到是否脱细胞软骨基质内残留一种或多种细胞因子，能够让干细胞更好的维持其形态？故未检测脱细胞软骨基质的生物学特性是此次实验的不足之处。

家猪软骨组织经胰酶、核酶及TritonX-100脱细胞后基本无细胞残留，其抗原性显著降低，又将获得的脱细胞软骨基质冷冻于-20 ℃，进一步降低其免疫原性^[22-23]，后期的细胞学毒性和活体实验也很好地证明了这点。与活体实验相比，体外细胞毒性实验具有简便、快捷、敏感性高等特点，是近年研究生物相容性的主要方法。此外，如何有效地对生物相容性进行评价，没有一个量化的标准来衡量，简单的统计学方法只能说明实验组和对照组在数据上有差异，但这些差异有多大及这些差异能否影响到细胞在脱细胞基质上的增殖，针对这些，此次实验引入了相对增殖率的概念，通过两组细胞相对增殖率的量化比较，能够将这些差异量化出来，并且通过评级系统来判断这些差异是否影响到细胞在材料上的增殖情况；这种新的评价系统，为组织工程支架材料的选择提供了理论依据。

在评价材料动物体内生物相容性时，测量了两组在注射即刻及注射后12，24，36 h的皮丘直径变化，发现二者变化无统计学意义，说明将家猪脱细胞软骨基质种植于大鼠皮下时未引起免疫反应，该基质有很好的活体组织相容性。

3.3 脱细胞软骨基质的临床应用及展望目前组织工程生物支架为腰椎间盘退变治疗带来了新希望，如天然高分子丝素蛋白混合胶原制备的支架研究炙手可热，被普遍认为是组织修复的理想材料，在脊髓损伤^[24]、骨缺损及周围神经损伤已有广泛研究^[25]。但丝素蛋白由天然蚕丝经脱胶制成，相对于其他天然高分子有着良好的物理化学性能及生物相容性，且无毒、无污染、无刺激性，可降解。因此，其作为手术缝合线的原材料被广泛悠久的用于临床^[26-27]。但在此次研究中，借用红外线光谱仪来分析脱细胞软骨基质的主要成为胶原蛋白，又将溶于醋酸的脱细胞软骨基质制备成软骨基质膜，电镜扫描下发现基质膜是由无序排列的胶原纤维组成，这为制备仿生学生物支架提供了新思路。脱细胞软骨基质可代替天然胶原，为细胞在支架上的生长提供更加接近原状态下的细胞外环境。无论胶原丝素蛋白支架还是脱细胞基质支架，都能够很好地为细胞增长提供细胞外环境。从来源方面说，脱细胞基质制备的支架更加科学，更能够模拟出细胞生存的外环境。此次研究通过以上实验检测了家猪脱细胞软骨基质的生物相容性，为下一步的临床应用提供了理论依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

猪脱细胞软骨基质生物相容性及细胞毒性评价系统的建立

Porcine decellular endplate cartilage matrix: biocompatibility assessment and establishment of a cytotoxicity evaluation system

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 6

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	李黎, 马力. 磁性壳聚糖微球固定化乳糖酶及其酶学性质[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 576-581.
[2]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[3]	何林, 吴稀, 何淞, 杨森. 经聚多巴胺涂层的羟基磷灰石生物陶瓷具有亲水性与细胞黏附性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3540-3544.
[4]	周安琪, 唐渝菲, 吴秉峰, 向琳. 骨膜组织工程设计：共性与个性的结合[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3551-3557.
[5]	郎丽敏, 何生, 姜增誉, 胡奕奕, 张智星, 梁敏茜. 导电复合材料在心肌梗死组织工程治疗领域的应用进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3584-3590.
[6]	王任先, 曹晶晶, 王宏刚, 万奔, 刘巍峰. 几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2500-2505.
[7]	解健, 苏俭生. 静电纺丝取向纳米纤维作为组织工程生物支架的优势与特征[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2575-2581.
[8]	纪琦, 喻正文, 张剑. 3D打印金属基生物材料工艺和临床应用的问题与趋势[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2597-2604.
[9]	宋涯含, 吴云霞, 范道洋. 基于VOSviewer生物医学领域3D打印的知识图谱分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(15): 2385-2393.
[10]	钱楠楠, 张潜, 杨睿, 敖俊, 章涛. 间充质干细胞治疗脊髓损伤：细胞治疗及联合新药和生物材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2114-2120.
[11]	罗雅馨, 毕浩然, 陈晓旭, 杨琨. 细胞外基质与组织的再生与修复[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(11): 1785-1790.
[12]	贾巍, 张满栋, 陈维毅, 王晨艳, 郭媛. 股骨假体材料对人工膝关节置换性能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1477-1481.
[13]	张利兴, 田昂, 李锡, 白希壮. TiO₂纳米管/羟基磷灰石载万古霉素涂层的释药性及生物毒性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1500-1506.
[14]	王倩, 李璐, 舒静媛, 董志恒, 靳友士, 王青山. 氧化锆基纳米羟基磷灰石功能梯度生物材料的微观形貌和物相分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1517-1521.
[15]	杨亚楠, 李峻峰, 王立, 刘恒全, 赖雪飞. 柠檬酸钙：一种有趣的有机钙生物医用材料[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1609-1615.