不同血清体积分数对脂肪干细胞成脂分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0518

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂肪干细胞培养：脂肪干细胞是脂肪来源的具有多向分化潜能的干细胞，在适宜条件下可定向分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等，是组织工程的重要种子细胞来源。脂肪干细胞分离培养通常采用含血清的特定培养基，培养基成分及浓度对干细胞的生长速率及不同定向分化能力可产生不同影响。优化培养基成分对脂肪干细胞的生长、定向分化具有重要意义。
脂肪干细胞分离培养中的主要影响因素：①脂肪离心速度应适宜，速度过高将影响干细胞的产量；②合适的种植密度：密度过低影响干细胞克隆形成及生长速度；③培养基的种类、血清体积分数、糖浓度及pH值：不同种类基础培养基对干细胞的生长及分化可产生不同影响，同样不同血清体积分数对干细胞的定向分化也可产生不同影响；低糖浓度有利于维持脂肪干细胞的多向分化潜能；适宜的pH值(7.2左右)有利于维持脂肪干细胞的形态。目前针对不同的组织工程应用领域，确定出分类细致的脂肪干细胞最佳培养条件仍是未来研究的热点之一。

摘要
背景：培养基中不同体积分数血清对干细胞增殖分化有不同影响。
目的：探讨含不同体积分数胎牛血清的培养基对小鼠脂肪干细胞增殖及成脂分化能力的影响。
方法：取7-10 d龄C57小鼠皮下脂肪提取脂肪干细胞。培养基中胎牛血清体积分数设定为5%，10%，15%，20%，将小鼠脂肪干细胞培养至第3代，采用CCK-8法测定细胞的增殖能力。成脂诱导分化后采用Bodipy染色观察脂滴形成情况，采用荧光定量PCR法和western blot法检测Cebpa，Pparg基因表达量和C/EBP-α，PPAR-γ蛋白表达量。
结果与结论：①体积分数为20%胎牛血清组脂肪干细胞在2-6 d的450 nm处吸光度值较体积分数为5%，10%，15%胎牛血清组低，但各组间差异无显著性意义；②体积分数为10%胎牛血清组Cebpa，Pparg基因表达量和C/EBP-α，PPAR-γ蛋白表达量最高，体积分数为5%，10%胎牛血清组显著高于体积分数为15%，20%胎牛血清组；③结果提示，不同体积分数胎牛血清培养条件对小鼠脂肪干细胞的增殖影响无显著差异。但不同体积分数胎牛血清培养条件下，脂肪干细胞成脂相关基因表达不同，高体积分数胎牛血清可抑制脂肪干细胞向脂肪细胞的分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-9888-796X(杨朵)

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 小鼠, 血清, 培养基, 增殖, 成脂分化

Abstract:

BACKGROUND: Serum concentrations in culture medium influence the proliferation and differentiation of stem cells.
OBJECTIVE: To study the proliferation and adipogenic differentiation potential of adipose-derived stem cells under culture with different concentrations of fetal bovine serum.
METHODS: The mouse adipose-derived stem cells were harvested from subcutaneous adipose tissue of C57 mice at 7-10 days of age. Concentrations of fetal bovine serum in the culture medium were set to 5%, 10%, 15% and 20%. The passage 3 cells were used for subsequent studies. The proliferation of cells cultured with different serum concentrations was tested using the cell counting kit-8 assay. The adipogenic differentiation potential of cells was evaluated with Bodipy staining. Quantitative RT-PCR and western blot assay were used to determine expression levels of Cebpa and Pparg mRNA as well as C/EBP-α and PPAR-γ protein levels.
RESULTS AND CONCLUSION: There was no statistical difference in the cell proliferation among cells cultured with different serum concentrations, even though adipose-derived stem cells cultured with 20% fetal bovine serum showed lower absorbance value at 450 nm than those cultured with 5%, 10% and 15% fetal bovine serum. The expression levels of Cebpa and Pparg mRNA and C/EBP-α and PPAR-γ protein in the 5% and 10% groups were considerably higher than those of the 15% and 20% groups, and the expression levels were highest in the 10% group. To conclude, different concentrations of fetal bovine serum have no significant effects on the proliferation of adipose-derived stem cells, while the adipogenic differentiation potentials of cells are different when cultured with different serum concentrations. High serum concentration can inhibit the adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adipose Tissue, Stem Cells, Adipogenesis, Cell Culture Techniques, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

材料方法

1.1 设计 体外细胞学实验。

1.2 时间及地点 于2017年5至8月在首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验试剂和仪器 DMEM培养基、胎牛血清、Ⅰ型胶原酶(美国GIBCO公司)；Bodipy(美国Sigma公司)；含DAPI的抗荧光淬灭剂(北京中山金桥生物科技有限公司)；FITC-anti-mouse-CD29、FITC-anti-mouse-CD31、FITC-anti-mouse-CD44、FITC-anti-mouse-CD45、兔抗鼠anti-PPAR-γ、anti-C/EBP-α抗体、羊抗兔荧光二抗(美国Abcam公司)；抗体cDNA合成kit，SYBR Green Mix (北京康为世纪科技有限公司)；RIPA细胞总蛋白提取试剂(北京普利莱基因技术有限公司)；BCA蛋白定量测定试剂盒(美国Thermo Scientific公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。流式细胞仪(美国Bekman-culter公司)；QuantStudio 6 Flex 96 荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems)；A1共聚焦显微镜(日本尼康公司)。

1.3.2 实验动物 健康7-10 d龄C57BL/6小鼠10只，雌雄各半，体质量6-8 g，由北京维通利华动物实验中心提供。实验中对小鼠的处置完全符合中华人民共和国科学技术部《关于善待实验动物的指导性意见(2006)》标准^[22]。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠脂肪干细胞的提取 参照文献[12]方法提取小鼠脂肪干细胞。将小鼠皮下脂肪剪碎后，胶原酶Ⅰ 37 ℃消化1 h；2 000 r/min离心10 min，弃上清，加入无血清DMEM，轻轻吹打制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1，最终细胞接种密度为(3.0-4.0)×10⁴/cm²。

1.4.2 不同培养条件的设定 目前脂肪干细胞培养及成脂分化的血清添加物多数采用胎牛血清(查阅96份涉及脂肪干细胞的独立研究中，血清添加物100%为胎牛血清，血清来源美国GIBCO公司占比74%。此统计结果未在此次研究中显示)，故将胎牛血清(美国GIBCO公司)作为研究变量。原代脂肪干细胞采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，从第1代起，将细胞分为4组，DMEM中胎牛血清体积分数分别为5%，10%，15%，20%。于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱培养，每48 h换液1次，分别传代至第3代时开始进行后续实验。

1.4.3 脂肪干细胞鉴定 取第3代脂肪干细胞(体积分数为10%胎牛血清组)用于流式细胞仪检测细胞表面标记物，包括CD29、CD31、CD44、CD45。取待测细胞1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬细胞至细胞浓度为1×10⁷ L^-1，每管分装100 μL，分别加入上述单克隆抗体，室温避光孵育30 min，PBS洗涤离心(1 500 r/min，5 min)2次，上机检测。

1.4.4 CCK-8检测细胞活性 将各组第3代细胞接种至96孔板(每孔1 000个细胞)，分别在24，48，72，96，120，144 h时，每孔按10%的量加入CCK-8工作液，37 ℃孵育4 h，测定450 nm波长吸光度值。

1.4.5 脂肪干细胞的成脂诱导 各组第3代细胞生长满培养皿时，记为第0天，随后在含不同体积分数胎牛血清的DMEM培养基中加入成脂诱导液^[23](含0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L胰岛素，200 μmol/L吲哚美辛)，诱导四五天后收集细胞用于后续实验。

1.4.6 脂肪细胞Bodipy染色^[24] 成脂诱导5 d后进行脂肪滴的Bodipy染色，弃去培养基，PBS洗涤细胞1次，40 g/L多聚甲醛室温固定细胞30 min，滴加100 μL Bodipy工作液(将1 g/L储存液按1︰1 000用PBS稀释，工作液需避光4 ℃保存)。室温染色15 min后PBS洗涤细胞3次，用含300 nmol/L DAPI的抗荧光淬灭剂染色5 min后进行荧光检测。

1.4.7 定量PCR检测 成脂诱导4 d后常规提取细胞总RNA并进行反转录^[25]，操作程序按试剂盒说明书进行。荧光定量PCR在QuantStudio 6 Flex 96设备上完成。内参选用GAPDH。所用引物见表1^[26]。

1.4.8 Western blot检测 成脂诱导4 d后提取细胞总蛋白用于Western blot测定。采用RIPA细胞裂解法提取总蛋白，按照试剂盒操作说明书进行。经BCA法蛋白定量后取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，转NC膜后一抗4 ℃过夜。TBST洗涤后二抗室温孵育1 h，TBST洗涤后扫描观察NC膜。

1.5 主要观察指标 ①细胞内脂肪滴的形成情况；②Cebpa与Pparg基因mRNA表达量以及C/EBP-α与PPAR-γ蛋白表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 20.0软件对各组数据进行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。图表制备采用GraphPad Prism5.02软件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

适宜的细胞外微环境有利于维持干细胞特征，同时与细胞的分化密切相关^[15-16^，^27-28]。目前脂肪干细胞的培养常规采用含血清的低糖DMEM培养基^[11^，^29-30]。血清中含有丰富的细胞生长必须营养成分，同时也存在细胞生长抑制因子，对细胞的增殖、分化均有影响^[28^，^31-32]，故而研究不同血清微环境对细胞生长和分化的影响具有重要意义。

目前脂肪干细胞各向诱导分化主要采用多种化学药物联合诱导的方法，在化学试剂诱导的同时，不同血清微环境也可对分化进程产生不同影响。有研究显示，不同血清体积分数条件下，脂肪干细胞向软骨分化的效率亦不同^[33-34]。但不同血清体积分数是否影响成脂分化尚无研究报道。此次研究对比分析了成脂诱导过程中不同血清微环境的影响，希望有助于成脂诱导时选择最佳体积分数血清提供依据。

张树威等^[35]研究发现，体积分数为10%血清相较于体积分数为1%血清，更易诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化。而玉石等^[36]报道体积分数为2%血清相比较高体积分数血清，可最佳诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞的定向分化。上述结果提示不同种类干细胞在分化中对血清体积分数的耐受不同。该研究中脂肪干细胞在体积分数为5%，10%血清环境下诱导成脂后，成脂相关基因Cebpa，Pparg mRNA表达和C/EBP-α，PPAR-γ蛋白表达量差异均无显著性意义，但明显高于体积分数为15%，20%胎牛血清组，体积分数为20%胎牛血清组上述基因与蛋白表达量最低，提示高体积分数胎牛血清可抑制脂肪干细胞向脂肪细胞的分化。这可能与血清中含有多胺氧化酶成分有关，其能与来自高度繁殖细胞的多胺起反应，形成有细胞毒害作用的聚胺醛，从而对细胞产生去分化作用^[37]。

有文献报道在间充质干细胞的培养中，体积分数为5%与10%血清组的细胞增殖率无差异，加入血清超过体积分数30%后，细胞生长过程中老化较快^[15]。葛敏等^[27]报道在淋巴管内皮细胞的培养中，体积分数为7.5%血清培养条件下细胞增殖效率高于体积分数为10%血清。上述结果提示，较高的血清体积分数对细胞的增殖可能起抑制作用。研究中体积分数为20%胎牛血清组细胞增殖较体积分数为5%，10%，15%组略低，但4组间差异无显著性意义，提示在脂肪干细胞培养中，血清体积分数在5%-15%之间均可支持细胞生长，血清体积分数超过15%后，部分抑制了细胞的增殖，其原因可能为高体积分数血清可提高培养基渗透压及pH值，而高渗透压及碱性环境可导致细胞生长受限。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程