鼠神经生长因子体外诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0492

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 2027-2032.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0492

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鼠神经生长因子体外诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化

陈俊，杨自金

徐州医科大学附属连云港医院(连云港市第一人民医院)儿内科，江苏省连云港市 222002

修回日期:2017-12-18 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 杨自金，主任医师，硕士生导师，徐州医科大学附属连云港医院(连云港市第一人民医院)儿内科，江苏省连云港市 222002
作者简介:陈俊，男，1991年生，湖北省随州市人，汉族，徐州医科大学在读硕士，主要从事脐血间充质干细胞相关研究。
基金资助:
江苏省连云港市科技局重点科室建设(SH1117)

Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells differentiate into neuron-like cells: in vitro induction by mouse nerve growth factor

Chen Jun, Yang Zi-jin

Department of Pediatrics, Lianyungang Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University (First People’s Hospital of Lianyungang), Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China

Revised:2017-12-18 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Yang Zi-jin, Chief physician, Master’s supervisor, Department of Pediatrics, Lianyungang Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University (First People’s Hospital of Lianyungang), Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China
About author:Chen Jun, Master candidate, Department of Pediatrics, Lianyungang Hospital Affiliated to Xuzhou Medical University (First People’s Hospital of Lianyungang), Lianyungang 222000, Jiangsu Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
鼠神经生长因子：是从小鼠颌下腺分离纯化出的一种细胞因子，对神经元有营养支持作用，能够促进受损神经的修复，对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。
脐血间充质干细胞：胎儿脐血中因富含间充质干细胞而被认为是非胚胎干细胞的主要来源之一，脐血间充质干细胞相比骨髓间充质干细胞具有非侵入取材、花费少等优点，相比胚胎干细胞、神经干细胞具有来源更为原始、低免疫原性、无伦理学争议等优点，另外由于其具备向多胚层分化能力，因此成为干细胞领域研究热点。为了攻克神经系统损伤后修复的难题，如何有效诱导脐血间充质干细胞分化为类神经元用于治疗神经系统疾病是当前研究热点之一。

摘要
背景：脐血间充质干细胞是从胎儿脐血中分离出的一种成体干细胞，具有分化为类神经元的潜能，可用于多种神经系统疾病的治疗。如何有效诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化一直是干细胞领域的研究热点，具有很高的科学研究价值。
目的：探讨鼠神经生长因子在体外条件下对脐血间充质干细胞向类神经元诱导分化的作用。
方法：复苏人脐血间充质干细胞，体外扩增培养并观察细胞形态特征，绘制细胞生长曲线。取第5代脐血间充质干细胞，分别加入质量浓度为50，100，150，200 μg/L的鼠神经生长因子培养液作为诱导组，另设不加任何诱导剂的空白对照组，每日倒置显微镜下观察细胞形态变化并拍照记录，诱导7 d后采用免疫细胞化学法检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的表达，使用Image-Pro Plus 6.0软件计算NSE、GFAP阳性表达率。
结果与结论：①脐血间充质干细胞复苏后活性达90%以上，形态为大小不一的长梭形、纺锤形，其生长曲线呈“S”型，第3-6天为细胞对数生长期；②经鼠神经生长因子诱导后细胞形态出现典型类神经元样改变，而对照组细胞形态无明显变化；③免疫细胞化学法显示鼠神经生长因子诱导后细胞NSE、GFAP均呈阳性表达，其中100 μg/L 鼠神经生长因子诱导组的NSE、GFAP阳性表达率最高，相比其他鼠神经生长因子诱导组差异有显著性意义(P < 0.05)，而对照组无NSE、GFAP阳性细胞；④结果表明，鼠神经生长因子在体外能够诱导脐血间充质干细胞分化为类神经元，100 μg/L为较合适的诱导质量浓度。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-3762-1586(陈俊)

关键词: 干细胞, 鼠神经生长因子, 脐血, 间充质干细胞, 神经元, 诱导分化, 神经元特异性烯醇化酶, 胶质纤维酸性蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells (hUCB-MSCs) are a kind of adult stem cells in the human umbilical cord blood, which have the potential to differentiate into neuron-like cells and can be used for the treatment of a variety of nervous system diseases. How to effectively induce hUCB-MSCs differentiation into neuron-like cells is always a hotspot in the stem cell research, which is of high scientific research value.
OBJECTIVE: To explore the induction effect of mouse nerve growth factor (mNGF) on the differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro.
METHODS: The donated hUCB-MSCs were resuscitated and the cell morphology after culture was observed to draw a cell growth curve. Passage 5 cells were cultured in the culture medium containing 0 (blank control), 50, 100, 150, 200 μg/L mNGF, and the cell morphology was observed and recorded daily under inverted phase contrast microscope. Immunocytochemistry detection was used to examine the expression of neuron-specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) at 7 days of induction, and then the NSE and GFAP positive expression was calculated by Image-Pro Plus 6.0 software.
RESULTS AND CONCLUSION: The viability of resuscitated hUCB-MSCs was up to over 90%. The cell morphology was in long shuttle shape and spindle shape with unequal size, and the cells presented with “S”-shaped growth curve and entered the logarithmic growth phase at 3-6 days. Typical neuron-like changes were observed after induction by mNGF; however, there was no change in the cell morphology in the control group. Immunocytochemical staining showed that the induced cells were positive for both NSE and GFAP, and the highest positive rates of NSE and GFAP were observed after induction by 100 μg/L mNGF (P < 0.05). In the control group, there was no positive expression of NSE and GFAP. To conclude, mNGF can induce the in vitro differentiation of hUCB-MSCs into neuron-like cells, and 100 μg/L mNGF can achieve the best induction effect.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Nerve Growth Factor, Fetal Blood, Mesenchymal Stem Cells, Neurons, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈俊，杨自金. 鼠神经生长因子体外诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 2027-2032.

Chen Jun, Yang Zi-jin. Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells differentiate into neuron-like cells: in vitro induction by mouse nerve growth factor[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 2027-2032.

图/表（结果） 1

2.1 脐血间充质干细胞复苏后的细胞活性 用锥虫蓝染色检测复苏后细胞活性：正常活细胞的胞膜结构完整，锥虫蓝不能进入胞内，因此不能被染上颜色，此现象为“锥虫蓝拒染”；而死细胞或胞膜不完整的细胞，因胞膜破坏而可被锥虫蓝染成蓝色。实验中大部分活细胞为锥虫蓝拒染，少数死细胞被染成蓝色，计算细胞活性率达90%以上，表明细胞复苏后活性良好(图1)。

2.2 脐血间充质干细胞的生长曲线 最初1-3 d细胞生长处于延滞期，此段时间内细胞生长较为缓慢；从第3天开始到第6天止细胞进入对数生长期，此段时间内细胞生长极为迅速，细胞数量以几何级数增长；6 d后细胞生长进入平台期，相比对数生长期增速明显减缓，生长曲线总体呈“S”型(图2)。

2.3 脐血间充质干细胞的形态特征 倒置相差显微镜下观察可见脐血间充质干细胞形态为大小不一的长梭形、纺锤形 (图3A)，折光性强。培养六七天后细胞基本达80%融合状态，此时可见细胞集落呈漩涡状或放射状生长(图3B)。

2.4 mNGF诱导过程中脐血间充质干细胞形态学变化 加入mNGF进行诱导分化培养后，每日在倒置相差显微镜下观察，诱导第1天各实验组脐血间充质干细胞形态均未见明显变化，诱导第 2，3天可见各实验组细胞形态发生改变——细胞胞体逐渐回缩变圆，胞体一侧或双侧伸出突起，呈现出单极、双极类神经元样改变，随着诱导时间的延长，可见细胞突起逐渐伸长并发出次级突起，诱导至第7天可见各实验组中相邻细胞通过突触相互连接，其中质量浓度为100 μg/L mNGF诱导组最为明显，而对照组脐血间充质干细胞形态则无明显改变，罕见类似细胞(图4)。7 d诱导时间内所有实验组细胞生长状态均良好，未见明显的脱落、死亡现象。

2.5 免疫细胞化学染色鉴定结果 对mNGF诱导第7天的脐血间充质干细胞进行免疫细胞化学染色，发现各mNGF诱导组细胞NSE、GFAP均阳性表达，阳性细胞胞浆被染为棕褐色，而对照组细胞仅部分胞浆着色且着色浅，为非特异性染色，故NSE、GFAP均不表达为阴性(图5)。

2.6 统计学分析 ①各mNGF诱导组细胞NSE阳性率差异有显著性意义(F=41.52，P < 0.01)，50，100，150，200 μg/L mNGF诱导组NSE阳性率分别为(21.7±3.2)%，(37.2±3.4)%，(25.7±2.5)%，(25.3±4.9)%； ②各mNGF诱导组细胞GFAP阳性率差异也有显著性意义(F=37.01，P < 0.01)，50，100，150，200 μg/L mNGF诱导组GFAP阳性率分别为(30.5±2.9)%，(52.7±5.2)%，(39.3±2.5)%，(36.5±4.2)%；③各mNGF诱导组组间比较，100 μg/L组NSE，GFAP细胞阳性率均高于50，150，200 μg/L组，差异有显著性意义(P < 0.05，图6)。

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引言

中枢神经系统损伤后自身修复能力有限，如何有效修复受损神经组织、恢复神经功能一直困扰着广大医疗工作者及研究者。随着干细胞移植技术的出现和发展，神经损伤性疾病的治疗看到了新的希望──从胎儿脐血中分离出的脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，hUCB-MSCs)具有分化为骨、软骨、肝、脂肪、肌、内皮、神经等3个胚层多种细胞的能力^[1]，此外还具有免疫原性低、来源广泛、伦理争议少等优点^[2]，是一种理想的种子细胞，能够通过细胞移植治疗脑卒中、小儿脑性瘫痪、神经退行性疾病、脊髓损伤、缺血缺氧性脑损伤等多种神经系统疾病^[3-7]，如何有效诱导脐血间充质干细胞分化为类神经元一直是干细胞领域的研究热点。

目前诱导脐血间充质干细胞分化为类神经元的方法主要有：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法、基因转染诱导法、中药诱导法等^[8-12]。其中，化学试剂法和细胞因子法在研究中最为常用，而细胞因子法由于具有应用操作简便、毒副作用小、细胞存活率高等特点，是比较理想的细胞诱导方法。鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor，mNGF)是从小鼠颌下腺分离纯化出的一种细胞因子，对神经元有营养支持作用，能够促进受损神经的修复^[13]，已用于临床治疗小儿面神经炎、新生儿缺血缺氧性脑病、脑性瘫痪、脑炎后遗症等多种儿科神经系统疾病^[14-17]，均取得较好疗效。目前已有研究表明NGF能够有效诱导神经干细胞向类神经元分化^[18]，并且诱导后的类神经元对受损神经具有修复和保护作用^[19]。本实验探讨mNGF诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化的可行性及合适的诱导浓度，为今后mNGF联合脐血间充质干细胞治疗神经系统疾病的实验研究及临床应用提供理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年11月至2017年5月在徐州医科大学附属连云港医院中心实验室完成。

1.3 材料 人脐血间充质干细胞(江苏省博雅干细胞库馈赠)；澳洲优等胎牛血清(美国Clark公司)；不完全低糖DMEM培养基(南京凯基生物科技公司)；金路捷注射用鼠神经生长因子，产品批号：201607054098(武汉海特生物制药股份有限公司)；兔抗神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)抗体(美国Proteintech公司)；兔抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(美国Proteintech公司)；免疫组化检测试剂盒(美国Proteintech公司)。超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；细胞培养箱(美国Thermo Forma公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；成像系统DP73(日本OLYMPUS公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 脐血间充质干细胞复苏 将冻存人脐血间充质干细胞从液氮罐中取出，立即放入37 ℃水浴箱中快速搅动，使其在2 min中内完全融化。乙醇棉球擦拭离心管壁后在超净台中打开，用吸管转移至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min后弃去上清液，完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基)重悬细胞，0.3%锥虫蓝染色检测细胞活力，调整细胞浓度后接种于75 cm²培养瓶中进行扩增培养。

1.4.2 脐血间充质干细胞传代培养 倒置相差显微镜下观察到细胞生长至80%融合时进行传代操作，首先弃去75 cm²培养瓶中的细胞培养液，用PBS冲洗2次或3次以除去培养瓶中残留血清成分、死细胞以及贴壁不牢状态欠佳的细胞。然后加入3 mL含EDTA的0.25%胰酶溶液，放入37 ℃细胞培养箱中消化1.0-2.0 min，倒置显微镜下观察细胞状态，当细胞皱缩变圆、彼此分离后加入完全培养基终止消化，用吸管轻轻吹打培养瓶底使细胞从瓶壁脱落，将吹打后的细胞悬液转入15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min后弃去上清液，完全培养基重悬细胞后，按1︰3的比例分装到新培养瓶中，补加适量的完全培养基后转入培养箱中培养。

1.4.3 脐血间充质干细胞生长曲线 取生长状态良好、约80%融合的第4代脐血间充质干细胞，消化传至第5代后按1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于24孔板中，共培养8 d，每天取3孔细胞消化后计数，取平均值作为当日细胞数，然后以培养天数为横轴(X轴)，细胞数量为纵轴(Y轴)，绘制脐血间充质干细胞生长曲线。

1.4.4 脐血间充质干细胞冻存 取处于对数生长期的细胞，胰酶消化离心后弃去上清液，加入1 mL由10%二甲基亚砜和体积分数为90%胎牛血清配制的细胞冻存液，将细胞重悬后转入无菌冻存管中，管壁标明细胞名称、代数以及冻存时间，然后按照温度梯度慢速冻存细胞：4 ℃冰箱放置30 min，-20 ℃冰箱放置30 min，-80 ℃冰箱过夜，第2天转入-196 ℃液氮罐中长期保存。

1.4.5 脐血间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化

实验分组：将mNGF按照50，100，150，200 μg/L的质量浓度梯度分为4个诱导组，诱导液均使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM完全培养基配制。另设空白对照组，其中不加任何诱导剂，仅加入等量完全培养基。

诱导分化：取生长状态良好的第5代脐血间充质干细胞，制备细胞悬液，细胞计数板计数后按1×10⁸ L^-¹的细胞浓度随机接种于6孔板中，板底事先铺有经赖氨酸处理过的无菌盖玻片，以制备细胞爬片。然后根据上述实验分组向6孔板中分别加入2 mL由不同质量浓度mNGF配制的诱导液，置于37 ℃、含体积分数为5%CO₂、95%湿度的细胞培养箱中，每日倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，并拍照记录。

1.4.6 免疫细胞化学染色 对诱导第7天的脐血间充质干细胞行免疫细胞化学染色，检测各组细胞NSE、GFAP的表达：用镊子将各组细胞爬片从6孔板中取出，PBS洗涤后放入 40 g/L多聚甲醛中固定20 min；再经0.2% Triton-X100透化处理5 min；体积分数为3% H₂O₂孵育10 min以消除内源性过氧化物酶活性；山羊血清封闭20 min后滴加按比例稀释过的一抗NSE(1︰100)、GFAP(1︰200)置于湿盒中4 ℃过夜；PBS充分冲洗爬片后滴加二抗，置于湿盒中37 ℃孵育30 min；去除二抗后使用现配的DAB显色剂显色3-5 min；蒸馏水冲洗后再用苏木精复染3 min，脱水封固后镜下观察并拍照记录。

1.4.7 Image-Pro Plus 6.0软件分析 光镜下随机取10个不重叠视野(×100)进行拍照，然后通过Image-Pro Plus 6.0软件对苏木精染为蓝紫色的胞核进行计数，结果记为细胞总数，细胞胞浆被DAB染成棕黄色为阳性显色并计数，结果记为阳性细胞数。所有照片在使用软件分析过程中均采用同一种选色标准进行结果判定，以保证分析结果的客观性，并进行人工校对以提高准确性。

1.5 主要观察指标 ①脐血间充质干细胞复苏后的细胞活性以及生长情况；②脐血间充质干细胞诱导前后的形态学变化；③诱导后细胞的神经元细胞表面标志物NSE、神经胶质细胞表面标志物GFAP的表达。

1.6 统计学分析 统计各组细胞总数及阳性细胞数，计算阳性细胞率=阳性细胞数/细胞总数，结果以x(_)±s表示，建立excel数据库，采用SPSS 21.0统计分析软件进行数据处理分析。多组均数比较用单因素方差分析(ANOVA)、多组间均数两两比较用LSD-t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

mNGF是在神经系统生长、分化以及功能维持中发挥重要作用的一种细胞因子，对受损神经组织的修复具有促进作用，目前已应用于多种神经系统损伤性疾病，均取得比较满意的疗效，且治疗后未见明显不良反应^[20]。实验在加入mNGF诱导后，倒置显微镜观察发现细胞生长状态良好，未见细胞大量死亡或成片脱落的现象，表明鼠来源的神经生长因子对人脐血间充质干细胞无明显毒害作用，二者能够更广泛应用于今后的临床研究当中，例如将mNGF联合脐血间充质干细胞移植治疗神经系统疾病。

mNGF生物作用的发挥与其两类受体关系密切，包括高亲和力的TrkA受体和低亲和力的神经营养素受体p75^NTR。TrkA是酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinase，PTK)家族成员之一，广泛存在于胆碱能神经元和感觉神经元细胞中^[21-22]，当这些神经元细胞受到缺血缺氧等损伤后可激活受损区域TrkA的表达^[23]，通过ERK1/2，PI3K-Akt等途径来保护受损神经元细胞、促进轴突生长^[24]；p75^NTR属于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor， TNFR)超家族成员，可激活NF-κB途径促进细胞存活以及诱导神经元分化、促进轴突生长^[25-27]，也可激活JNK通路诱发细胞凋亡^[28]。综上所述，mNGF的两类受体TrkA和p75^NTR可通过多种不同的机制促进神经元存活和再生轴突的生长成熟，对受损神经进行修复。

除具有修复受损神经功能外，实验还发现mNGF具有促进神经分化的作用。应用mNGF诱导脐血间充质干细胞后，细胞形态发生类神经元样改变，并且免疫化学法检测到神经元表面标记物NSE以及神经胶质细胞表面标记物GFAP阳性表达，表明mNGF能够诱导脐血间充质干细胞分化成类神经元和神经胶质细胞。有研究者在探讨NGF诱导神经干细胞分化为类神经元的机制中发现，使用PI3K-Akt抑制剂能够阻断NGF对Akt的磷酸化作用从而阻断NGF促进神经干细胞分化的作用^[29]。另有研究发现脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子均能通过PI3K-Akt信号通路促进类神经元分化^[30-31]，以上研究表明PI3K-Akt信号通路参与了神经分化的过程。前文提到PI3K-Akt可被mNGF受体TrkA激活，由此猜想PI3K-Akt信号通路在mNGF诱导脐血间充质干细胞分化为类神经元的过程中可能发挥了重要作用，但其具体诱导机制还需要更深入研究。

实验对比50，100，150，200 μg/L这4个不同质量浓度mNGF诱导组的NSE和GFAP阳性率，发现各组GFAP阳性率均高于NSE阳性率，说明经mNGF诱导后，脐血间充质干细胞更多转换为神经胶质细胞，而转换为类神经元则相对较少。类似的研究表明，表皮生长因子、胰岛素样生长因子主要促进间充质干细胞向神经胶质细胞分化，而成纤维生长因子、脑源性神经营养因子则主要促进间充质干细胞向类神经元分化^[32-33]，产生这种现象的原因可能与这些细胞因子分别作用于细胞神经分化过程中的不同阶段有关。有研究发现，PI3K-Akt信号通路激活后可以抑制神经胶质细胞的凋亡^[34]，GFAP是神经胶质细胞标志物，故其表达量高可能与mNGF激活PI3K-Akt信号通路后神经胶质细胞凋亡减少有关。另外，作者发现当mNGF质量浓度为100 μg/L时，无论是NSE还是GFAP的阳性细胞率均高于其他诱导组，说明100 μg/L质量浓度的mNGF具有更好地促进脐血间充质干细胞分化为类神经元的能力，提高mNGF质量浓度反而使类神经元分化率降低。

虽然实验证实了mNGF能够体外诱导脐血间充质干细胞分化为类神经元，但其诱导分化的具体机制、不同诱导时间对神经分化的影响，诱导后细胞是否具备神经元生物功能等问题仍不清楚，有待更进一步研究去探讨验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

鼠神经生长因子体外诱导脐血间充质干细胞向类神经元分化

Human umbilical cord blood mesenchymal stem cells differentiate into neuron-like cells: in vitro induction by mouse nerve growth factor

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