长链非编码RNA-H19对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞生存和血管再生能力的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0430

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (13): 1969-1975.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0430

• 骨髓干细胞 bone marrow stem cells • 下一篇

长链非编码RNA-H19对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞生存和血管再生能力的影响

侯婧瑛，汪蕾，龙会宝，吴浩，伍权华，钟婷婷，周长青，郭天柱，陈旭翔，王彤

中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120

修回日期:2017-11-23 出版日期:2018-05-08 发布日期:2018-05-08
通讯作者: 王彤，博士，博士生导师，教授，主任医师，研究员，中山大学孙逸仙纪念医院急诊科，广东省广州市 510120
作者简介:侯婧瑛，女，1985年生，安徽省庐江县人，汉族，2012年中山大学孙逸仙纪念医院毕业，硕士，主治医师，主要从事干细胞与心血管疾病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81270213)；国家自然科学基金(81670306)；国家自然科学基金(81700242)；广东省科技计划项目(2014A020211002)；广东省科技计划项目(2017A020215176)；高校基本科研业务费中山大学重大项目培育和新兴、交叉学科资助计划(17ykjc18)；广东省医学科研基金(A2016264)；广东省医学科研基金(A2017001)

Long non-coding RNA H19 facilitates bone marrow mesenchymal stem cell survival and vascularization in hypoxic-ischemic conditions in vitro

Hou Jing-ying, Wang Lei, Long Hui-bao, Wu Hao, Wu Quan-hua, Zhong Ting-ting, Zhou Chang-qing, Guo Tian-zhu, Chen Xu-xiang, Wang Tong

Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China

Revised:2017-11-23 Online:2018-05-08 Published:2018-05-08
Contact: Wang Tong, M.D., Doctoral supervisor, Professor, Chief physician, Researcher, Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
About author:Hou Jing-ying, Master, Attending physician, Department of Emergency, Sun Yat-sen Memorial Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510120, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81270213, 81670306, 81700242; the Science and Technology Plan Project of Guangdong Province, No. 2014A020211002, 2017A020215176; the Fundamental Research Funds for Culture, Innovation, Interdisciplinary Plan of Sun Yat-sen University, No. 17ykjc18; the Medical Research Foundation of Guangdong Province, No. A2016264, A2017001

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
增强骨髓间充质干细胞生存和血管再生能力的策略：骨髓间充质干细胞移植的疗效仍难以令人满意，其中一个重要因素就是骨髓间充质干细胞移植后的生存力低下，新生血管形成较少。现阶段已有一些策略用于增强骨髓间充质干细胞的生存力和血管再生能力，如对骨髓间充质干细胞进行缺氧预处理，转染各种生长因子和抗凋亡基因等。
长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)：lncRNA-H19是最早被发现的印记基因之一，在进化上高度保守，且不同物种间具有高度同源性。研究表明lncRNA-H19能够促进组织细胞生存和抑制凋亡。此外，其还能够调节血管形成。近年来的研究显示lncRNA-H19与骨髓间充质干细胞的扩增和分化密切相关。

摘要
背景：课题组前期研究发现骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植后其在局部梗死组织中的生存力低下，形成新生血管的密度较低，在一定程度上影响了其治疗的效率。长链非编码RNA-H19(lncRNA-H19)被证实与骨髓间充质干细胞分化及血管形成密切相关。
目的：体外观察lncRNA-H19对骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下生存和血管再生能力的影响，并探讨其可能机制。
方法：体外培养的骨髓间充质干细胞分为5组：MSCs+H19组、MSCs+H19对照组(MSCs+H19 NC组)，MSCs+si-H19组、MSCs+si-H19对照组(MSCs+si-H19 NC组)和MSCs组。其中MSCs+H19组和MSCs+H19 NC组分别予以转染lncRNA-H19及lncRNA-H19 scramble RNA阴性对照，MSCs+si-H19组和MSCs+si-H19 NC组分别转染lncRNA-H19 siRNA及lncRNA-H19 siRNA scramble阴性对照，体外缺血缺氧条件(无血清，体积分数为1% O₂)下培养24 h，MTS法检测细胞增殖情况，TUNEL法检测细胞凋亡情况。取细胞培养基上清液分别刺激人脐静脉内皮细胞，观察血管形成情况。Western blot检测各组血管内皮生长因子A表达。
结果与结论：①与MSCs组及MSCs+H19 NC组相比，MSCs+H19组增殖能力显著增强，凋亡显著减少，血管管腔样结构明显增多(P < 0.01)；②与MSCs组及MSCs+si-H19 NC组相比，MSCs+si-H19组增殖能力显著减弱，凋亡显著增加，血管管腔样结构明显减少(P < 0.01)；③与MSCs组及MSCs+H19 NC组相比，MSCs+H19组血管内皮生长因子A表达显著增高；④与MSCs组及MSCs+si-H19 NC组相比，MSCs+si-H19组血管内皮生长因子A表达显著减少；⑤结果表明，lncRNA-H19促进骨髓间充质干细胞在体外缺血缺氧环境下的生存并增强其血管形成能力，此作用可能与其上调血管内皮生长因子A表达相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-0492-2216(侯婧瑛)

关键词: 长链非编码RNA-H19, 缺血缺氧, 生存, 干细胞, 骨髓间充质干细胞, 血管再生, 血管内皮生长因子, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Our previous study demonstrated that bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) presented with a low survival rate and newly formed vascular-like structures was sparsely distributed in the local infarct tissues after cell transplantation, which certainly impaired the therapeutic efficacy. Long non-coding RNA-H19 (lncRNA-H19) has been confirmed to be associated with MSCs differentiation and mediate vascularization.
OBJECTIVE: To observe the influence of lncRNA-H19 on the survival and vascularization potential of MSCs in vitro and to explore the possible mechanism.
METHODS: MSCs were obtained and cultured in vitro. Cells were divided into five groups: MSCs+H19, MSCs+H19 negative control (MSCs+H19 NC), MSCs+si-H19, MSCs+si-H19 negative control (MSCs+si-H19 NC) and MSCs groups. MSCs+H19 and MSCs+H19 NC groups were transfected with lncRNA-H19 and lncRNA-H19 scramble RNA respectively, while MSCs+siH19 and MSCs+si-H19 NC groups were transfected with lncRNA-H19 siRNA and lncRNA-H19 siRNA scramble respectively. Cells were cultured under hypoxic-ischemic condition (serum-free medium, 1% O₂) for 24 hours. Then, cell proliferation and apoptosis were evaluated using MTS and TUNEL, respectively. Cell supernatant from each experimental group was further co-cultured with human umbilical vein endothelial cells to induce vascularization. The expression of vascular endothelial growth factor A (VEGFA) was thereafter detected using western blot assay
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with MSCs+H19 NC and MSCs groups, MSCs+H19 group presented with significantly higher proliferation rate, lower apoptosis percentage and a larger number of vascular branches on matrigel (P < 0.01). There was a significantly higher expression of VEGFA in the MSCs+H19 group than MSCs+H19 NC and MSCs groups. Compared with the MSCs and MSCs+si-H19 NC groups, MSCs+H19 group presented with significantly lower proliferation rate, higher apoptosis percentage and a less number of vascular branches on matrigel (P < 0.01). In addition, VEGFA expression was distinctly downregulated in the MSCs+si-H19 group in comparison with the MSCs+si-H19 NC and MSCs groups. These findings indicate that lncRNA-H19 effectively promotes MSCs survival and vascularization under hypoxic-ischemic condition in vitro, and this effect may be associated with the upregulation of VEGFA.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Hypoxia, Vascular Endothelial Growth Factor A, Tissue Engineering

中图分类号:

R349.2

侯婧瑛，汪蕾，龙会宝，吴浩，伍权华，钟婷婷，周长青，郭天柱，陈旭翔，王彤. 长链非编码RNA-H19对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞生存和血管再生能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(13): 1969-1975.

Hou Jing-ying, Wang Lei, Long Hui-bao, Wu Hao, Wu Quan-hua, Zhong Ting-ting, Zhou Chang-qing, Guo Tian-zhu, Chen Xu-xiang, Wang Tong. Long non-coding RNA H19 facilitates bone marrow mesenchymal stem cell survival and vascularization in hypoxic-ischemic conditions in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(13): 1969-1975.

图/表（结果） 2

2.1 pcDNA3.1-H19载体酶切鉴定和测序结果 pcDNA3.1-H19酶切鉴定及测序结果均显示，目的基因H19已成功转入pcDNA3.1载体中(图1)。H19(2 288 bp)在相应的位置切出1条目的条带(箭头所指)，pcDNA3.1-H19载体构建成功。

2.2 各组lncRNA-H19表达情况 MSCs+H19组的lncRNA-H19表达量较MSCs+H19 NC组和MSCs组明显增高(P < 0.01，图2)，而 MSCs+si-H19组较MSCs+si-H19 NC和MSCs组明显降低(P < 0.01，图2)，表明骨髓间充质干细胞成功转染了lncRNA-H19和lncRNA-H19siRNA。

2.3 lncRNA-H19对骨髓间充质干细胞增殖的影响 MTS检测结果显示：MSCs+H19组在体外培养24，48，72 h的细胞增殖率均明显高于MSCs+H19 NC组和MSCs组(P < 0.01，图3A)，A₄₉₀值均高于MSCs+H19 NC组和MSCs组(P < 0.01，图3B)，MSCs+si-H19组上述不同时间点细胞增殖率明显低于MSCs+si-H19 NC组和MSCs组(P < 0.01，图3A)，A₄₉₀值均低于MSCs+si-H19 NC组和MSCs组(P < 0.01，图3B)，表明lncRNA-H19能够促进骨髓间充质干细胞的增殖。

2.4 lncRNA-H19 对骨髓间充质干细胞凋亡的影响 TUNEL检测结果显示：MSCs+H19组、MSCs+H19 NC组、MSCs+si-H19组、MSCs+si-H19 NC组和MSCs组的凋亡比例分别为(1.90±0.01)%，(2.56±0.06)%，(4.50±0.04)%，(2.62± 0.02)%和(2.50±0.09)%，MSCs+H19组的凋亡比例低于MSCs+H19 NC组和MSCs组(P < 0.01，图4)，而MSCs+ si-H19组凋亡比例高于 MSCs+si-H19 NC组和MSCs组(P < 0.01，图4)。

2.5 lncRNA-H19对骨髓间充质干细胞血管形成能力的影响 人脐静脉内皮细胞分别与各组骨髓间充质干细胞培养基上清液共培养后，在matrigel中均形成血管腔样结构(图5)。MSCs+H19组、MSCs+H19 NC组、MSCs+si-H19组、MSCs+si-H19 NC组和MSCs组血管腔样结构的数量分别为22.40±2.02，13.40±1.30，6.8±0.98，13.80±1.21和14.4±1.20。与MSCs+H19 NC组和MSCs组相比较，MSCs+H19组血管腔样结构的数量明显增多(P < 0.01)；与 MSCs+si-H19 NC组和MSCs组相比较，MSCs+si-H19组血管腔样结构数量显著减少(P < 0.01)，以上表明 lncRNA-H19对骨髓间充质干细胞的成管能力具有促进作用。

2.6 各组骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子A的表达 与MSCs组及MSCs+H19 NC组相比，MSCs+H19组血管内皮生长因子A表达显著增高，而与MSCs组及MSCs+si-H19 NC组相比，MSCs+si-H19组血管内皮生长因子A表达显著减少，差异有显著性意义(P < 0.01，图6)。

参考文献

[1] Wen Z, Zheng S, Zhou C, et al. Repair mechanisms of bone marrow mesenchymal stem cells in myocardial infarction. J Cell Mol Med. 2011;15(5):1032-1043.

[2] Faiella W, Atoui R. Therapeutic use of stem cells for cardiovascular disease. Clin Transl Med. 2016;5(1):34.

[3] Safari S, Malekvandfard F, Babashah S, et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes: A novel potential therapeutic avenue for cardiac regeneration. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 2016;62(7): 66-73.

[4] Wang T, Tang W, Sun S, et al. Mesenchymal stem cells improve outcomes of cardiopulmonary resuscitation in myocardial infarcted rats. J Mol Cell Cardiol. 2009;46(3):378-384.

[5] Wang T, Tang W, Sun S, et al. Improved outcomes of cardiopulmonary resuscitation in rats with myocardial infarction treated with allogenic bone marrow mesenchymal stem cells. Crit Care Med. 2009;37(3):833-839.

[6] Xing Y, Hou J, Guo T, et al. microRNA-378 promotes mesenchymal stem cell survival and vascularization under hypoxic-ischemic conditions in vitro. Stem Cell Res Ther. 2014; 5(6):130.

[7] 侯婧瑛,汪蕾,钟婷婷,等. apelin干预骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管再生[J].中国组织工程研究,2017,21(1):6-12.

[8] 侯婧瑛,周长青,郑韶欣,等. 用双萤光素酶报告基因技术验证小鼠lncRNA-H19与miR-199a-5p的靶向关系[J]. 中国病理生理杂志,2016, 32(12):2256-2260.

[9] Schmitz SU, Grote P, Herrmann BG. Mechanisms of long noncoding RNA function in development and disease. Cell Mol Life Sci. 2016; 73(13):2491-2509.

[10] Boon RA, Jaé N, Holdt L, et al. Long Noncoding RNAs: From Clinical Genetics to Therapeutic Targets. J Am Coll Cardiol. 2016;67(10): 1214-1226.

[11] Rosa A, Ballarino M. Long noncoding RNA regulation of pluripotency. Stem Cells Int. 2016; 2016:1797692.

[12] Ounzain S, Micheletti R, Arnan C, et al. CARMEN, a human super enhancer-associated long noncoding RNA controlling cardiac specification, differentiation and homeostasis. Mol Cell Cardiol. 2015; 89(Pt A):98-112.

[13] Hou J, Long H, Zhou C, et al. Long noncoding RNA Braveheart promotes cardiogenic differentiation of mesenchymal stem cells in vitro. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):4.

[14] Ratajczak MZ. Igf2-H19, an imprinted tandem gene, is an important regulator of embryonic development, a guardian of proliferation of adult pluripotent stem cells, a regulator of longevity, and a 'passkey' to cancerogenesis. Folia Histochem Cytobiol. 2012;50(2):171-179.

[15] Deng Y, Yang Z, Terry T, et al. Prostacyclin-producing human mesenchymal cells target H19 lncRNA to augment endogenous progenitor function in hindlimb ischaemia. Nat Commun. 2016;7: 11276.

[16] Voellenkle C, Garcia-Manteiga JM, Pedrotti S, et al. Implication of Long noncoding RNAs in the endothelial cell response to hypoxia revealed by RNA-sequencing. Sci Rep. 2016;6:24141.

[17] Hou J, Zhong T, Guo T, et al. Apelin promotes mesenchymal stem cells survival and vascularization under hypoxic-ischemic condition in vitro involving the upregulation of vascular endothelial growth factor. Exp Mol Pathol. 2017;102(2):203-209.

[18] 郭天柱,邢越,侯婧瑛, 等. miR-378对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞增殖及凋亡的影响[J].中国组织工程研究,2014,18(19):2961-2967.

[19] Carvalho E, Verma P, Hourigan K, et al. Myocardial infarction: stem cell transplantation for cardiac regeneration. Regen Med. 2015; 10(8):1025-1043.

[20] Narita T, Suzuki K. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of heart failure. Heart Fail Rev. 2015;20(1):53-68.

[21] Hou J, Wang L, Hou J, et al. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Promotes Mesenchymal Stem Cells to Express Connexin43 via the Inhibition of TGF-β1/Smads Signaling in a Rat Model of Myocardial Infarction. Stem Cell Rev. 2015;11(6):885-899.

[22] Karpov AA, Drahova AV, Buslova DV, et al. Modification of mesenchymal stem cells as a way to improve the effectiveness of cell therapy of ischemic myocardial injury. Ross Fiziol Zh Im I M Sechenova. 2015;101(9):985-998.

[23] 伍权华,侯婧瑛,郭天柱,等. 吡格列酮联合骨髓间充质干细胞移植治疗改善大鼠心肌梗死后的心功能[J].中国组织工程研究,2015,19(23): 3698-3704.

[24] Park JS, Suryaprakash S, Lao YH, et al. Engineering mesenchymal stem cells for regenerative medicine and drug delivery. Methods. 2015;84:3-16.

[25] Karantalis V, Suncion-Loescher VY, Bagno L, et al. Synergistic Effects of Combined Cell Therapy for Chronic Ischemic Cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2015;66(18):1990-1999.

[26] Tanaka Y, Shirasawa B, Takeuchi Y, et al. Autologous preconditioned mesenchymal stem cell sheets improve left ventricular function in a rabbit old myocardial infarction model. Am J Transl Res. 2016;8(5): 2222-2233.

[27] Bader AM, Klose K, Bieback K, et al. Hypoxic Preconditioning Increases Survival and Pro-Angiogenic Capacity of Human Cord Blood Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. PLoS One. 2015;10(9): e0138477.

[28] Ounzain S, Pedrazzini T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. 2015;25(7):592-602.

[29] Shen S, Jiang H, Bei Y, et al. Long Non-Coding RNAs in Cardiac Remodeling. Cell Physiol Biochem. 2017;41(5):1830-1837.

[30] Hou J, Zhou C, Long H, et al. Long noncoding RNAs: Novel molecules in cardiovascular biology, disease and regeneration. Exp Mol Pathol. 2016;100(3):493-501.

[31] Xue M, Zhuo Y, Shan B. MicroRNAs, Long Noncoding RNAs, and Their Functions in Human Disease. Methods Mol Biol. 2017;1617: 1-25.

[32] Zhang J, Liu CY, Wan Y, et al. Long non-coding RNA H19 promotes the proliferation of fibroblasts in keloid scarring. Oncol Lett. 2016; 12(4):2835-2839.

[33] He P, Zhang Z, Huang G, et al. miR-141 modulates osteoblastic cell proliferation by regulating the target gene of lncRNA H19 and lncRNA H19-derived miR-675. Am J Transl Res. 2016;8(4): 1780-1788.

[34] Ravid O, Shoshani O, Sela M, et al. Relative genomic stability of adipose tissue derived mesenchymal stem cells: analysis of ploidy, H19 long non-coding RNA and p53 activity. Stem Cell Res Ther. 2014;5(6):139.

[35] Jiang X, Yan Y, Hu M, et al. Increased level of H19 long noncoding RNA promotes invasion, angiogenesis, and stemness of glioblastoma cells. J Neurosurg. 2016;124(1):129-136.

[36] Jia P, Cai H, Liu X, et al. Long non-coding RNA H19 regulates glioma angiogenesis and the biological behavior of glioma-associated endothelial cells by inhibiting microRNA-29a. Cancer Lett. 2016; 381(2):359-369.

[37] Conigliaro A, Costa V, Lo Dico A, et al. CD90+ liver cancer cells modulate endothelial cell phenotype through the release of exosomes containing H19 lncRNA. Mol Cancer. 2015;14:155.

[38] Smadja DM, Levy M, Huang L, et al. Treprostinil indirectly regulates endothelial colony forming cell angiogenic properties by increasing VEGF-A produced by mesenchymal stem cells. Thromb Haemost. 2015;114(4):735-747.

[39] Moon HH, Joo MK, Mok H, et al. MSC-based VEGF gene therapy in rat myocardial infarction model using facial amphipathic bile acid-conjugated polyethyleneimine. Biomaterials. 2014;35(5): 1744-1754.

引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2017年4至6月在中山大学孙逸仙纪念医院完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SPF级3周龄雄性C57BL/6小鼠10只，体质量10 g，由中山大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(粤) 2016-0029，用于骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定、转染和血管形成实验等。

1.3.2 实验用主要仪器及试剂 超净工作台、恒温CO₂培养箱(Thermo，美国)；台式常温高速离心机、微量移液器(Eppendorff，德国)；高温灭菌器(樱花牌NSS-20，日本)；电热恒温水槽(上海深信实验仪器有限公司)；缺氧培养箱(Eppendorf/Galaxy®48 R，美国Eppendorf/Galaxy公司)；倒置荧光显微镜(Leica，德国)；巴氏吸管(美国JET BIOFIL公司)；酶标仪(multiscan MK3，Thermo，美国)；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗、PBS(Hyclone公司)；48孔板细胞培养板、24孔板细胞培养板、6孔板细胞培养板(美国CORNING公司)；96孔板细胞培养板、12孔板细胞培养板(美国NEST公司)；原代人脐静脉内皮细胞(广州奕源生物科技有限公司)；Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen，美国)；cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂(美国Promega公司)；TUNEL试剂盒(美国Promega公司)；Matrigel(美国BD公司)；血管内皮生长因子A兔多克隆抗体(Abcam，英国)。

1.4 实验方法

1.4.1 C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养 课题组已形成成熟的培养方法，采用C57BL/6小鼠，全骨髓法分离培骨髓间充质干细胞。具体方法参照课题组前期参考文献^[7^，^17]。

1.4.2 pcDNA3.1-H19过表达载体构建 lncRNA-H19扩增引物序列由苏州金唯智公司合成，lncRNA-H19引物序列：EcoRIF: 5’-ccg gaa ttc ACC GGG TGT GGG AGG GGG GTG GGG GGT-3’(下划线部分为EcoRI限制性酶切位点)，XhoIR: 5’-ccg ctc gag ATG ACT GTA ACT GTA TTT ATT GAT GG-3’(下划线部分为XhoI限制性酶切位点)，PCR扩增后进行产物回收，再行载体双酶切，扩增引物片段的长度为2 288 bp。将酶切回收产物与pcDNA3.1载体进行连接。连接产物转化后质粒提取并采用酶切鉴定阳性克隆，送阳性质粒进行测序，测序结果做Blast对比分析，证明基因H19成功克隆至pcDNA3.1载体中。

1.4.3 细胞转染 根据Invitrogen公司Lipofectamine 2000使用说明进行细胞转染。转染前1 d对细胞株进行传代，使其汇合度达到70%-80%，转染时采用Opti-MEM培养基。24孔板每孔加入质粒1 μg，稀释到100 μL Opti-MEM培养基制作为A液，取1 μL Lipofectamine 2000溶解于Opti-MEM培养基制作为B液，B液混合5 min后，再将A液和B液混合。静置20 min，将混合液加至细胞培养板并孵育4-6 h后更换为完全培养基^[13]。

1.4.4 细胞缺血缺氧培养 缺血缺氧前1 d对细胞株传代，第3代细胞接种于25 cm²培养瓶，当培养至90%-95%铺满后，分为5组：MSCs+H19组、MSCs+H19对照组(MSCs+H19 NC组)，MSCs+si-H19组、MSCs+si-H19对照组(MSCs+si-H19 NC组)和MSCs组。其中MSCs+H19组和MSCs+H19 NC组分别予以转染lncRNA-H19及lncRNA-H19 scramble RNA阴性对照，MSCs+si-H19组和MSCs+si-H19 NC组分别转染lncRNA-H19 siRNA及lncRNA-H19 siRNA scramble阴性对照。当天更换无血清低糖培养基后，再放置于体积分数1% O₂、5%CO₂、94%N₂ Galaxy^® 48R培养箱中，各组细胞缺血缺氧培养24 h后收集细胞及培养上清液备后续实验使用^[6-7^，^17-18]。

1.4.5 MTS检测细胞增殖 各组细胞缺血缺氧培养24 h后消化细胞，吹打散细胞并计数，调整细胞浓度至1×10⁸ L^-1再接种到96孔板，每孔100 μL(每孔细胞为1×10⁴个)，待细胞贴壁后再收集进行检测。在各个时间点收集细胞(0，24，48，72 h)之后加入cellTiter96AQ单溶液细胞增殖检测试剂，比例10︰1 (即100 μL培养液中加入10 μL检测液)。在孵育4 h后进行multiscan MK3酶标仪读板，读取A₄₉₀值^[6-7^，^17-18]。

1.4.6 TUNEL法检测细胞凋亡 各组细胞缺血缺氧培养24 h，取出爬片24 h后采用TUNEL法检测凋亡。培养好的细胞用PBS洗去培养液，体积分数为4%甲醛溶液4 ℃固定25 min；PBS洗涤5 min，2次；0.2% Triton X-100室温孵育5 min；PBS洗涤5 min，2次；加100 μL Equilibration Buffer室温平衡10 min。加入50 μL TdT工作液37 ℃湿盒避光孵育60 min。在高倍镜下随机选取5个视野做凋亡细胞计数，每组至少重复3次^{[6- 7}^，^17-18]。

1.4.7 血管形成实验 缺血缺氧培养24 h，48孔板中每孔加入200 μL Matrigel，37 ℃包被2 h。取人脐静脉内皮细胞2×10⁴重悬于200 μL条件培养基(前述骨髓间充质干细胞培养上清液)，加入到已包被的48孔板中，常氧条件下继续培养6 h，普通光镜下观察血管形成情况并拍照，分别在100倍镜下随机选取5个管型分布均匀的视野行管腔数计数，取平均值^[6-7^，^17-18]。

1.4.8 qRT-PCR检测 缺血缺氧培养24 h，收集细胞加入1 mL Trizol溶液裂解提取总RNA，并采用核酸蛋白分析仪以及1.6%琼脂糖电泳对提取的总RNA进行分析。取8 μL总RNA液，70 ℃水浴5 min后加入17 μL反转录反应液，再在42 ℃孵育60 min终止反应，留取产物后待用。qRT-PCR 扩增参数：95 ℃，10 min(1个循环)；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s(40个循环)；72 ℃，延伸10 min。反应结束后，软件自动计算定量结果，具体引物设计参见表1^[6-7^，^18]。

1.4.9 Western blot检测 各组细胞缺血缺氧培养24 h后采用western blot检测血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)的表达。按照1 mL裂解液加10 μL PMSF(100 mmol/L)和10 μL Cocktail，摇匀并置于冰上，每管细胞加100 μL含PMSF和Cocktail的裂解液，置于冰上裂解30 min，裂解后4 ℃下离心10 min(14 000 r/min)，提取细胞上清液中的总蛋白。采用BCA法测定各组样品的蛋白浓度，常规SDS-PAGE电泳和蛋白电转，转膜后的PVDF膜，使用5%脱脂奶粉溶液在室温下封闭1 h或4 ℃下过夜；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应的一抗稀释液进行4 ℃过夜或在37 ℃孵育2 h；TBST洗膜5 min，3次；滴加相应的二抗稀释液，37 ℃孵育1 h；TBST洗膜5 min，3次；用蒸馏水漂洗膜2 min，弃去液体，洗3次；总体积为0.125 mL/cm²膜面积的发光液均匀地加到膜表面，室温孵育5 min，小心吸去膜表面的多余发光液，放至暗盒后进行显影^[7]。

1.5 主要观察指标 不同处理组骨髓间充质干细胞的增殖、凋亡和血管形成情况。

1.6 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料以x(_)±s表示，多组间的差异比较采用单因素方差分析，组间的两两比较采用bonferroni法，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

骨髓间充质干细胞因其自身的优越性目前被认为是治疗心血管疾病的理想种子细胞^[1-3^，^16]，课题组的前期研究及他人的研究均证实骨髓间充质干细胞移植能够有效改善心肌梗死后心力衰竭^[4-5^，^19-20]。尽管如此，骨髓间充质干细胞移植的疗效仍难以令人满意，其中一个重要因素就是骨髓间充质干细胞移植后的生存力低下，新生血管形成较少^[6^，^21]。因此，寻找能够增强骨髓间充质干细胞生存和血管再生能力的新策略对于提高其移植疗效具有重要意义^[22]。现阶段已有一些策略用于增强骨髓间充质干细胞的生存力和血管再生能力，如对骨髓间充质干细胞进行缺氧预处理，转染各种生长因子和抗凋亡基因等^[23]，这些方法和手段虽然在一定程度上提高了骨髓间充质干细胞移植的治疗效果^[21^，^24-27]，但仍达不到理想水平，并且各种转染所带来的潜在风险未知且以动物模型为主，临床应用受到了极大限制。因此，迫切需要寻找到新的干预因素以进一步促进骨髓间充质干细胞的生存和血管再生，从而显著改善其移植疗效。

近年来的研究发现lncRNA在干细胞生存和心血管再生中发挥重要调控作用^[28-29]，作为一类新型的非编码RNA分子，其能够通过不同机制在不同层面对细胞生物学行为进行调节^[7^，³^0-31]。lncRNA-H19在胚胎发育期呈现出高表达，而在出生后，其在大多数组织中的表达出现下调^[12]。lncRNA-H19在调控细胞扩增和凋亡中均具有重要作用，它能够促进细胞生长并抑制凋亡^[32]。研究发现lncRNA-H19促进成纤维细胞的扩增^[32]。此外，lncRNA-H19表达增加能够促进成肌细胞在缺氧条件下的扩增和生存^[15]。另有报道削弱lncRNA-H19的表达会使成骨细胞的扩增能力下降，并且使其凋亡增加^[33]。有研究显示lncRNA-H19促进骨髓间充质干细胞在体外培养环境下的早期扩增^[34]。在缺血缺氧条件下对骨髓间充质干细胞转染lncRNA-H19后发现其表达lncRNA-H19显著增加，骨髓间充质干细胞的增殖率明显升高，凋亡明显减少；而在采用siRNA抑制lncRNA-H19的表达后，骨髓间充质干细胞的增殖率明显下降，凋亡明显增加，以上表明了lncRNA-H19能够促进骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存并抑制其发生凋亡。

证据表明lncRNA-H19具有调节血管生成的作用^[15^，³³^，^35]。lncRNA-H19能够促进血管内皮细胞的生长和毛细血管形成^[33^，^35]。lncRNA-H19表达降低会抑制内皮细胞生长并导致其出现细胞周期停滞，敲除lncRNA-H19后内皮细胞的成管能力出现明显减弱^[15]。已有研究显示lncRNA-H19能够通过调节血管生成因子的表达促进血管再生^[36]。此外，lncRNA-H19还能够促进内皮细胞向血管生成的表型进行转化并介导细胞间的黏附^[37]。缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞转染lncRNA-H19后进行血管形成实验，结果显示与单纯的骨髓间充质干细胞对照组和lncRNA-H19干扰对照组相比较，转染lncRNA-H19的骨髓间充质干细胞对人脐静脉内皮细胞形成血管腔样结构具有更加明显的促进作用，而采用siRNA抑制lncRNA-H19的表达后，骨髓间充质干细胞对人脐静脉内皮细胞形成血管腔样结构的促进作用显著减弱，以上说明lncRNA-H19能够增强骨髓间充质干细胞的血管再生能力。

由此可见，lncRNA-H19能够促进骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管再生，作者对其可能的作用机制进行了进一步探讨。既往研究表明血管内皮生长因子在骨髓间充质干细胞生存和血管再生中具有重要调节作用，增强血管内皮生长因子的表达能够提高骨髓间充质干细胞的生存力和血管再生能力^[6^，¹⁸^，^38]。有学者发现采用转染或者基因修饰的方式上调血管内皮生长因子表达后骨髓间充质干细胞的生存力显著提高，体内移植治疗后能够在梗死区域形成更多的新生血管和减少纤维化进而明显改善心肌梗死后的心功能和心室重构^[39]。lncRNA-H19有上调血管内皮生长因子表达的作用^{[33- 34]}。有研究报道体外缺氧环境下，在骨髓间充质干细胞早期扩增过程中可观察到lncRNA-H19与血管内皮生长因子表达的同步上调^[34]。目前已在细胞实验中发现lncRNA-H19通过上调血管内皮生长因子促进组织细胞生存、扩增并抑制细胞凋亡^[33-34]。本研究检测了各组骨髓间充质干细胞的血管内皮生长因子A表达情况，结果显示，骨髓间充质干细胞转染lncRNA-H19后血管内皮生长因子A的蛋白表达显著增高，而采用siRNA抑制lncRNA-H19后血管内皮生长因子A的蛋白表达出现显著降低，以上表明lncRNA-H19促进骨髓间充质干细胞生存与血管再生与其上调血管内皮生长因子A的表达相关。

综上所述，lncRNA-H19能够促进骨髓间充质干细胞在缺血缺氧条件下的生存和血管再生，此效应可能与其上调血管内皮生长因子的表达相关。该研究有利于阐明调控骨髓间充质干细胞生存和血管再生的相关分子机制，同时也为进一步提高骨髓间充质干细胞移植治疗的疗效提供了新思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

长链非编码RNA-H19对缺血缺氧条件下骨髓间充质干细胞生存和血管再生能力的影响

Long non-coding RNA H19 facilitates bone marrow mesenchymal stem cell survival and vascularization in hypoxic-ischemic conditions in vitro

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 2

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.