荨麻提取物诱导骨膜细胞增殖分化：构建组织工程骨及超微结构的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0196

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (12): 1805-1810.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0196

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荨麻提取物诱导骨膜细胞增殖分化：构建组织工程骨及超微结构的变化

徐兵1，柳园2

1深圳市龙华区人民医院，广东省深圳市 518109；2深圳市龙华区中心医院，广东省深圳市 518110

收稿日期:2017-12-20 出版日期:2018-04-28 发布日期:2018-04-28
通讯作者: 柳园，主管护士，深圳市龙华区中心医院，广东省深圳市 518110
作者简介:徐兵，男，1969年生，四川省宜宾市人，汉族，1992年成都大学毕业，主治中医，主要从事手外骨科，中医针炙研究。
基金资助:
江西省科技计划项目(20134BBG00009)

Urtica extracts induce periosteal cell proliferation and differentiation: tissue-engineered bone construction and ultrastructural changes

Xu Bing1, Liu Yuan2

1the People’s Hospital of Longhua, Shenzhen 518109, Guangdong Province, China; 2Shenzhen Longhua District Central Hospital, Shenzhen 518110, Guangdong Province, China

Received:2017-12-20 Online:2018-04-28 Published:2018-04-28
Contact: Liu Yuan, Nurse-in-charge, Shenzhen Longhua District Central Hospital, Shenzhen 518110, Guangdong Province, China
About author:Xu Bing, Attending physician, the People’s Hospital of Longhua, Shenzhen 518109, Guangdong Province, China
Supported by:
the Science and Technology Program of Jiangxi Province, No. 20134BBG00009

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
碱性磷酸酶：分布于人体骨骼、肾脏、肝脏等各个组织，这种酶可作用于核酸分子使其脱掉5’磷酸基团，其同工酶有6种，其中一种来源于骨细胞，有研究表明骨形成中必不可少的酶是碱性磷酸酶，也是成骨细胞前体细胞分化为成熟的成骨细胞的重要检测指标，也是评估其功能的重要标志，其表达和成骨细胞分化成熟度和活跃度密切相关。同时它也密切参与到骨的矿化中去，可调控细胞间质中无机磷酸的浓度和电解质比例，启动和促进矿化。
荨麻：是荨麻科多年生草本植物，是传统的中草药，分布广泛，在中国多地均有产出，全草可入药，有祛风除湿和止咳等功效，其提取物主要成分包括硝酸钾、异鼠李素和山奈酚等多种成分，荨麻提取物中包含多种植物类雌激素。

摘要
背景：荨麻作为一种传统的中草药，目前认为其主要的药理作用是抗炎、抗风湿等作用，其对骨膜细胞的效果的相关研究较少。
目的：探讨荨麻诱导人骨膜细胞增殖及分化特性，并诱导其体外构骨，为荨麻运用于骨组织工程提供理论依据。
方法：实验取材于成人锁骨。体外组织块培养法获得骨膜原代细胞，恒温培养扩增后，取第3代骨膜细胞种植于细胞培养板中。实验分为3组，实验组分别加入10-6，10-5及10-4 g/L荨麻提取物，阳性对照组加入50 μg/L 骨形态发生蛋白7，对照组仅加入纯净水。分别在第1，4，7和10天MTT法检测骨膜细胞增殖情况，碱性磷酸酶染色和Von Kossa染色检测碱性磷酸酶和钙结节的表达。分别将10-4 g/L荨麻提取物及骨形态发生蛋白7加入到含有聚己内酯三维支架中和骨膜细胞复合培养构建组织工程骨，培养24 d，电镜下观察不同组细胞形态学情况。
结果与结论：①MTT结果显示各时间点荨麻提取物不同浓度组和阳性对照组的吸光度值均显著高于对照组 (P < 0.05)，荨麻提取物不同浓度组的各时间点吸光度值相比，10-4 g/L组>10-5 g/L组>10-6 g/L组(P < 0.05)，表明10-4 g/L为最佳浓度；②实验组各时间点碱性磷酸酶和钙结节的染色阳性率与阳性对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，但2组各时间点表达量均显著高于对照组(P < 0.05)；③电镜下观察实验组细胞膜表面有大量微绒毛状突起，线粒体基质致密有少量嵴，细胞增殖和分化活跃。且阳性对照组和荨麻组细胞内线粒体数量显著多于对照组(P < 0.05)；④结果提示，荨麻能促进骨膜细胞增殖，同时能诱导骨膜细胞分化为成骨细胞，可作为组织工程中的诱导剂。另外，荨麻可诱导骨膜细胞在聚己内酯三维支架中扩增并构建组织工程骨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-0277-1573(柳园)

关键词: 荨麻, 骨膜细胞, 细胞增殖, 碱性磷酸酶, 骨组织构建, 钙结节, 聚己内酯支架, 骨形态发生蛋白7

Abstract:

BACKGROUND: Urtica, a traditional Chinese herbal, holds anti-inflammatory and anti-rheumatic effects, but its influence on periosteal cells is little reported.
OBJECTIVE: To investigate the proliferation and differentiation of human periosteal cells induced by urtica and to construct tissue-engineered bone by periosteal cells in vitro, thereby providing theoretical basis for the application of urtica in bone tissue engineering.
METHODS: Human clavicle periosteum was obtained. Primary periosteal cells were cultured by tissue culture method in vitro, passaged, and the 3 generations of periosteal cells were seeded into cell culture plate, and treated with urtica extracts (10-6, 10-5 and 10-4 g/L, experimental group), 50 μg/L bone morphogenetic protein-7 (positive control group) or purified water (control group). The absorbance values of periosteal cells were measured by MTT assay, and the expression levels of alkaline phosphatase and calcium nodules were detected by alkaline phosphatase staining and Von Kossa staining at 1, 4, 7 and 9 days after culture. 10-4 g/L urtica extracts and bone morphogenetic protein-7 were added into the three-dimensional polyclonal lactone scaffold and periosteal cells to construct tissue-engineered bone. After 24 days of culture, the morphological changes of periosteal cells were observed under electron microscope.
RESULTS AND CONCLUSION: MTT results revealed that the absorbance values of periosteal cells in the experimental and positive control groups were significantly higher than those in the control group at different time points (P < 0.05); the order of absorbance values was as follows: 10-4 group > 10-5 group > 10-6 g/L group (P < 0.05), suggesting 10-4 g/L was the optimal concentration. The positive rates of alkaline phosphatase and calcium nodules in the experimental and positive control groups were significantly higher than those in the control group (P < 0.05), but the experimental and positive control groups did not differ significantly (P > 0.05). In the experimental group, there were abundant microvilli on the cell membrane, the mitochondria matrix was dense and appeared with crista, and active proliferation and differentiation of cells were detected. The number of mitochondria in the experimental and positive control groups was significantly more than that in the control group (P < 0.05). These findings indicate that periosteal cells can be induced by urtica to amplify and differentiate into osteoblasts, and construct tissue-engineered bone in the three-dimensional polyclonal lactone scaffold.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Osteoblasts, Urticaceae, Cell Proliferation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

徐兵，柳园. 荨麻提取物诱导骨膜细胞增殖分化：构建组织工程骨及超微结构的变化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(12): 1805-1810.

Xu Bing1, Liu Yuan2. Urtica extracts induce periosteal cell proliferation and differentiation: tissue-engineered bone construction and ultrastructural changes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(12): 1805-1810.

图/表（结果） 3

2.1 MTT法检测荨麻提取物对骨膜细胞的增殖作用荨麻提取物不同浓度组的吸光度值均显著高于对照组 (P < 0.05)，提示荨麻提取物可促进骨膜细胞增殖，其对细胞刺激增殖作用在第1，4，7和10天均存在。10^-4g/L荨麻提取物组的吸光度值和阳性对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)。荨麻提取物不同浓度组的各时间点吸光度值相比，10^-4g/L组>10^-5 g/L组>10^-6 g/L组(P < 0.05)，表明 10^-4g/L为荨麻提取物的最佳浓度(表1)。

2.2 荨麻提取物诱导骨膜细胞碱性磷酸酶和钙结节的表达使用10^-4g/L的荨麻提取物在第1，4，7及10天能有效的诱导骨膜细胞碱性磷酸酶的表达和钙结节的形成。其碱性磷酸酶和钙结节的染色阳性率与骨形态发生蛋白7组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，但各时间点表达量均显著高于对照组(P < 0.05)，见表2，3，图1，2。

2.3 荨麻提取物诱导骨膜细胞组织工程骨的构建

2.3.1 组织工程骨超微形态学结构骨膜细胞培养9 d后，对照组、荨麻组、骨形态发生蛋白7组诱导的细胞均已经和三维支架紧密结合，组织工程骨已经形成。骨膜细胞胞体呈梭形，电镜下见细胞膜表面有大量微绒毛状突起，细胞核呈杆状、梭状或分叶形，线粒体基质致密有少量嵴，高尔基体内见小囊泡，部分细胞内能见小脂滴及钙小泡，细

胞的包浆内有大量溶酶体及异噬体等。细胞内见更多的小囊泡及小脂滴，同时细胞内粗面内质网更粗，表明细胞在实验组增殖和分化更加活跃。细胞和细胞间见钙质聚集，细胞相连(图3)。

2.3.2 电镜下不同组成骨细胞线粒体数量骨形态发生蛋白7组和荨麻组细胞内线粒体数量显著多于对照组 (P < 0.05)，线粒体体积更大，细胞增殖更加活跃。荨麻组和骨形态发生蛋白7组相比，线粒体数量无明显差异 (P > 0.05)(图4)。

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引言

荨麻分布于全世界，为多年生植物，是在国内长期使用的中药^[1]。荨麻具有多种药效，常见的有消炎、止血、抗过敏、治疗糖尿病和提高免疫力的作用^[2-4]。荨麻提取物能抑制病毒糖代谢，同时荨麻叶子中的异株荨麻凝集素有消炎和治疗风湿病的作用^[5]。有研究发现荨麻提取物对风湿性关节炎有疗效，因为其能抑制核因子κB的活性，把荨麻叶搅烂后敷在关节炎皮肤表面，能让关节很快的消肿^[6-7]。此外，荨麻有明显的止血功能，能治疗呼吸系统疾病如肺炎和支气管炎，对某些消化系统的疾病也有一定的疗效^[8]。Balzarini等^[9]证实荨麻提起物对艾滋病有选择的抑制作用。尽管目前研究较多，但在关于其在体外与细胞的相互作用仅见少量报道。

目前骨组织工程中种子细胞的选择一般选用成骨细胞，但是成骨细胞有分化方向已经确定且增殖潜力有限的缺点^[10]。研究所选用骨膜细胞含有骨祖细胞等未分化细胞，具有潜在的成骨分化能力，但是有成骨及软骨等不同的分化方向，其分化方向和体外诱导刺激因素密切相关，此特性类似于具有多方向分化特点的骨髓基质细胞，但骨膜细胞取材相对容易，体外培养条件宽松，增殖速度快，体外诱导培养后可快速用于骨组织工程中^[11-12]。同时骨膜细胞比较容易获得原代细胞，经多次传代培养后，其数量上可满足组织工程的需求，因此选择骨膜细胞有一定的优越性。

骨组织工程的支架材料有多种，常用的包括天然和人工合成两大类材料。天然材料主要包括自体骨、同种异体骨和异种骨，但是以上3类均受到来源和伦理学的限制^[13-14]。人工合成材料常见的包括羟基磷灰石、聚乙酸、聚乳酸等，但以上材料其细胞相容性参差不一，立体空间结构难以进行标准化控制，孔隙大小不均在等缺点，故进一步应用受到限制^[15]。研究选用的聚己内酯三维支架，具有韧性大、强度高、易于成型加工及组织相容性好等特点，最重要的是能在生物体内降解并被吸收代谢，因此有很好的运用前景^[16]。

当前研究拟探讨荨麻诱导骨膜细胞增殖和分化为成骨细胞的作用，并研究其诱导细胞体外扩增的最佳培养体系，旨在探讨荨麻运用于骨组织工程的可能性，为荨麻作为定向诱导剂诱导骨膜细胞成骨分化提供理论基础，为传统中药植物提取物用于组织工程拓宽思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点于2017年1月至8月在南方医科大学实验中心完成。

1.3 材料荨麻提取物(广州中医药大学)；DMEM-F12培养基(上海博光生物科技有限公司)；骨形态发生蛋白7(广州市一科生物科技有限公司)；胰蛋白酶(Sigma，美国)；β-甘油磷酸钠、地塞米松(合肥博美生物科技有限责任公司)、抗坏血酸；胎牛血清(上海嵘崴达实业有限公司)；聚己内酯三维支架(3D Biotek，美国)；CO₂恒温培养箱(Thermo，美国)；倒置相差显微镜(尼康，日本)；超净工作台(河北蓝梦生物医药科技有限公司)；碱性磷酸酶试剂盒(上海容创生物技术有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(北京北实纵横科技发展有限公司)；电子显微镜(上海师范大学)。

1.4 方法

1.4.1 人原代骨膜细胞培养骨膜来源于中年男性锁骨骨折患者，已经签署知情同意书并通过伦理委员会审核。于无菌操作下切取锁骨约3 cm×1.5 cm的骨膜1块，切除骨膜表面覆盖的结缔软组织，切下后立刻浸泡于细胞培养液中，20 min内行原代细胞组织块法培养，先用Hanks液反复冲洗，冲洗后剪成细小碎片，丢弃悬浮物质，剩下骨膜碎片置于培养瓶中，加入DMEM细胞培养液、双抗(青霉素和链霉素)，0.125%胰蛋白酶。在恒温细胞培养箱中培养， 2 d换液一次，每次换液均去除坏死表面细胞^[17]。5 d后可见骨膜细胞铺满细胞培养瓶底，细胞消化脱落后传代培养，传代至第3代的细胞用于各项实验。

1.4.2 荨麻对骨膜细胞增殖的影响(MTT法) 接种骨膜细胞入3块24孔板中，10⁴/孔。实验分为3组，实验组分别加入不同质量浓度(10^-6，10^-5及10^-4 g/L)的荨麻提取物，对照组加入等体积的纯净水，阳性对照组加入骨形态发生蛋白7(质量浓度为50 μg/L)。分别在第1，4，7和10天用MTT法检测骨膜细胞增殖情况，检测前4 h在每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，弃上清后加入150 μL二甲基亚砜，微孔板振荡器上振荡10 min，酶标仪检测各孔吸光度值(λ=490 nm)，测3次，取平均值。通过吸光度值反映细胞增殖情况，得出荨麻提取物最佳浓度。

1.4.3 荨麻诱导骨膜细胞碱性磷酸酶和钙结节的表达骨膜细胞按照10⁴/孔在细胞培养板中培养，实验分为3组，荨麻组(加入10^-4g/L的荨麻提取物)，阳性对照组(加入 50 μg/L的骨形态发生蛋白7)和对照组(加入纯净水)。实验中用碱性磷酸酶试剂盒检测骨膜细胞在第1，4，7及10天的碱性磷酸酶的表达，用Von Kossa染色法检测骨钙结节。

碱性磷酸酶染色：①取细胞爬片滴加固定液，室温固定3 min，水洗；②滴加作用液数滴，玻片置湿盒内，加盖疏水膜，避光于37 ℃孵育15 min，水洗；③趁湿滴加苏木素复染液数滴，复染3 min，水洗封固，镜检。阳性细胞核呈紫色，胞浆中出现蓝紫色颗粒。各组每张盖玻片分别随机取3个视野，采用网格计数法计算碱性磷酸酶染色阳性率。

Von Kossa染色：①取细胞爬片，PBS冲洗2次，每次3 min；②40 g/L多聚甲醛固定8 min；③蒸馏水冲洗2次；④5%硝酸银紫外线下照20 min；⑤蒸馏水冲洗2次；⑥加入2%硫代硫酸钠5 min；⑦水洗封固，镜检。镜下观察阳性细胞染色呈棕黑色，没有钙沉积则不显色。两组每张盖玻片分别随机取3个视野，采用网格计数法计算钙结节染色阳性率。每组均检测3次，取平均值。

1.4.4 荨麻诱导骨膜细胞组织工程骨的构建取第3代的骨膜细胞在细胞培养板中培养，各组内放的材料为：①骨形态发生蛋白7组：50 μg/L骨形态发生蛋白7+青、链霉素 (100 U/mL)+体积分数10%小牛血清+DMEM/F12培养基+ 1 cm³聚己内酯三维支架+10⁴L^-1的骨膜细胞；②荨麻提取物组：荨麻提取物(10^-4 g/L)+青、链霉素(100 U/mL)+ DMEM/F12培养基+1 cm³聚己内酯三维支架+体积分数 10%小牛血清+10⁴L^-1骨膜细胞；③对照组：青、链霉素 (100 U/mL) +DMEM/F12培养基+10%小牛血清+1 cm³聚己内酯三维支架+10⁴ L^-1骨膜细胞。每天在倒置显微镜下观察骨膜细胞，详细记录骨膜细胞的生长情况及骨膜细胞的形态学特征。在细胞培养瓶中培养骨膜细胞24 d，分别取实验组和对照组三维支架骨细胞复合体作6个切片，在电子显微镜下观察细胞内小脂滴、钙小泡、溶酶体、粗面内质网、线粒体和细胞间钙质，通过电子显微镜下超微结构直观的观察来反映骨组织工程骨的构建情况。同时根据细胞内这些超微结构的数量判定细胞的活跃程度。计数每个切片视野下线粒体数量，分析不同组细胞的活跃程度，间接证实诱导剂对骨膜细胞促进增殖和分化的作用。

1.5 主要观察指标 ①不同时间点骨膜细胞的吸光度值；②骨膜细胞碱性磷酸酶和钙结节的阳性表达率；③电镜下复合支架中骨膜细胞的超微结构；④镜下成骨细胞线粒体数目。

1.6 统计学分析统计学软件采用SPSS 17.0，数据用 x(_)±s表示，不同组之间的比较用方差分析，组间比较用最小差异法(LSD法)，P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

荨麻促进骨膜细胞增殖的相关机制目前尚无相关报道，虽然有研究证实荨麻提取物对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1细胞株有明显的促进增殖作用^[18]。黄酮类化合物对骨细胞的作用已经被证实，当前实验使用的荨麻提取物主要含有的槲皮素是一种黄酮类物质，有研究证实此类物质有多种生物学作用有抗炎，诱导成骨细胞的增殖抑制破骨细胞增殖及促进其凋亡，诱导骨髓基质干细胞分化等^[19-26]。黄酮类化合物具有植物雌激素活性，细胞表面的雌激素受体和其有亲和力^[27]。雌激素先和细胞膜上雌激素特定受体结合，然后协同其他激酶启动信号传导通路，引起的钙离子内流、环核苷酸合成和各种激酶的活化，转录因子及底物蛋白被激酶磷酸化，从而激活信号传导通路并调控通路中相关蛋白基因表达，进一步促进细胞的增殖和分化^[28]。

骨组织工程中，研究的热点之一是诱导剂诱导种子细胞生长。实验选用传统中药荨麻提取物作用于骨膜细胞，体外培养诱导增殖和分化，发现荨麻组活性细胞数比对照组高，同时碱性磷酸酶和钙结节也比对照组增多，说明荨麻有促进骨膜细胞增殖及分化为成骨细胞的作用。实验选用骨形态发生蛋白7作为阳性对照物，是因为多项实验均证实骨形态发生蛋白家族内多个因子都能对成骨细胞骨间质干细胞、骨髓基质细胞、成骨细胞都有促进其成骨增殖和分化的作用^[29]。当前实验发现荨麻对骨膜细胞的刺激增殖分化作用和骨形态发生蛋白7组对比无显著差别，进一步论证了荨麻对骨膜细胞的正向促进作用。实验通过聚己内酯支架结合骨膜细胞在体外成功构建了组织工程骨，通过电镜扫描分析，发现荨麻明显增强细胞的活跃度，并且三维支架和细胞契合良好，为传统廉价中草药荨麻提取物结合聚己内酯支架用于骨组织工程打下坚实的基础。

实验选用的种子细胞是骨膜细胞，近年来越来越多的学者认识到骨膜细胞在骨组织工程中的重要作用，发现骨膜细胞有成骨及成软骨方向分化^[30-32]。骨膜有产生新骨的作用，其在动物及人的幼年期增殖和分化活跃，能直接参与到骨的形成和增长之中，成年后由于骨质停止增长，骨膜转入静止潜伏状态，但是，一旦发生了骨损伤，骨膜功能又被激活，又恢复增殖和促进成骨作用，参与到骨损伤处的修复和愈合，骨膜在骨损伤修复中起着至关重要的作用，膜内和膜外成骨都是骨折修复的重要机制^[33-34]。考虑到骨膜细胞的解剖结构和在机体中承载的功能，骨膜细胞可作为骨组织工程的待选种子细胞之一。实验证实荨麻提取物、骨形态发生蛋白7均能促进骨膜细胞增殖，证明荨麻提取物能诱导骨膜细胞分化为成骨细胞。但骨膜细胞的分化方向是软骨方向还是成骨方向目前尚有争议。实验通过MTT法检测不同组骨膜细胞吸光度值，吸光度值和培养体系中活性细胞数目呈正相关，实验证明了荨麻在质量浓度大于10^-6g/L时有明显促进骨膜细胞增殖的作用，其最大的促进细胞增殖作用的浓度为10^-4g/L。

研究虽然通过细胞实验证实了荨麻可诱导骨膜细胞增殖和分化，同时体外构建了三维支架，证明了其促进体外构骨的可能性。但是仍然有一定的局限性： ①所构建的细胞-三维支架复合体尚需要进一步的动物实验论证其对骨不连的治疗效果；②进一步做多浓度梯度论证荨麻对骨膜细胞的促增殖作用；③可进一步论证荨麻对成骨细胞和软骨细胞的作用；④荨麻为混合，实验证实了荨麻这个植物整体有诱导骨膜细胞增殖的作用，还需具体进一步实验论证其具体何种化合物有此功效。

综上所述，荨麻有类似于骨形态发生蛋白7一样的促进骨膜细胞向成骨方向分化的作用。因此荨麻可作为组织工程优先选择的诱导剂。实验通过MTT、三维支架体外构骨等方法，论证了荨麻的促细胞在体外分化且构建活细胞组织工程骨的用，为骨组织工程选用有效诱导剂及合适的支架材料奠定了理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

荨麻提取物诱导骨膜细胞增殖分化：构建组织工程骨及超微结构的变化

Urtica extracts induce periosteal cell proliferation and differentiation: tissue-engineered bone construction and ultrastructural changes

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