脂肪间充质干细胞移植联合人工虫草多糖改善肾病综合征的高凝血状态及肾功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.50.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
脂肪间充质干细胞：是脂肪组织中一类多能性干细胞。由于脂肪组织来源广泛、取材容易、不涉及伦理问题、便于自体移植、给患者带来的痛苦较小，因此日益受到研究者的重视。目前研究人员已成功地在体内、体外条件下，将其诱导分化形成脂肪、骨、软骨、肌肉等组织类型细胞。
虫草多糖：是由甘露糖、虫草素、腺苷、半乳糖、阿拉伯糖、木糖精、葡萄糖、岩藻糖组成的多聚糖。实验证明，虫草多糖可提高人体免疫功能，升高白细胞，临床已用于治疗恶性肿瘤。

摘要
背景：临床上常将人工虫草多糖作为肾病综合征的辅助药。采用阿霉素建立SD大鼠肾病综合征模型是经典的实验性肾病综合征模型之一，该模型的临床表现及病理变化均类似于人类微小病变肾病。
目的：观察人工虫草多糖与脂肪间充质干细胞联合应用对肾病综合征大鼠肾功能及凝血的影响。
方法：体外培养脂肪间充质干细胞制备细胞悬液，并对悬液进行PKH26标记。50只SD大鼠随机取10只为正常组(不予任何处理)，余40只SD大鼠静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型，随机均分为4组，模型组不作处理；脂肪间充质干细胞组尾部静脉注射脂肪间充质干细胞连续3 d；人工虫草多糖组灌胃人工虫草多糖连续12周；联合组连续3 d尾静脉注射干细胞，同时灌胃人工虫草多糖连续12周。实验12周测定各组大鼠 24 h 尿蛋白定量、血清血脂指标、肌酐、尿素氮及凝血指标变化；光镜下观察双肾组织病理学变化；荧光显微镜观测PKH26标记的脂肪间充质干细胞存活及分布情况，采用RT-PCR技术检测肾组织中Hpa基因表达情况。
结果与结论：①检测指标：脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组及联合组的 24 h 尿蛋白定量及血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮水平均明显低于模型组(P < 0.05)，而血清总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白水平则明显高于模型组(P < 0.05)。联合组各项指标与脂肪间充质干细胞组及人工虫草多糖组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)；②血液高凝状态：脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组大鼠的血液高凝状态较模型组明显缓解，联合组进一步缓解(P < 0.05)；③双肾组织病理变化：联合组的双肾组织病理改善情况明显优于脂肪间充质干细胞组和人工虫草多糖组，脂肪间充质干细胞组和人工虫草多糖组较模型组稍有改善，但不及联合组；④荧光显微镜观测PKH26标记的脂肪间充质干细胞：联合组多于脂肪间充质干细胞组及人工虫草多糖组；⑤Hpa基因表达：模型组较正常组明显增加，脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组较模型组减少，联合组明显减少(P < 0.05)；⑥结果提示，脂肪间充质干细胞移植联合人工虫草多糖能够改善肾病综合征大鼠的肾功能及血液高凝状态，减轻肾组织的病理学损害。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-3224-4459(郭志伯)

关键词: 干细胞, 移植, 人工虫草多糖, 脂肪间充质干细胞, 大鼠, 肾病综合征, 肾功能, 凝血

Abstract:

BACKGROUND: Cordyceps polysaccharide is a commonly used adjuvant drug for clinical treatment of nephrotic syndrome. As a classic model of nephrotic syndrome induced by adriamycin, the Sprague-Dawley rat model of nephrotic syndrome exhibits similar clinical manifestations and pathological changes to minimal-change nephropathy in humans.
OBJECTIVE: To observe the effect of adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) transplantation combined with cordyceps polysaccharide on renal function and hypercoagulable state in rats with nephrotic syndrome.
METHODS: ADMSCs suspension was made in vitro and labeled using PKH26. Fifty Sprague-Dawley rats were randomized into normal (no intervention), model, ADMSCs, cordyceps polysaccharide and combined treatment groups (n=10/group). Adriamycin administration was performed to make rat models of nephrotic syndrome in the latter three groups. After modeling, model rats were respectively given no treatment, ADMSCs intravenously for 3 days, cordyceps polysaccharide intragastrically for 12 weeks, or their combined use. Then, 24-hour urinary protein, serum total cholesterol, triglyceride, total protein, albumin, high-density lipoprotein, low-density lipoprotein, creatinine, blood urea nitrogen levels and coagulation changes were detected at 12 weeks. Meanwhile, histopathological changes of renal tissues were observed under light microscope; survival and distribution of PKH26-labeled ADMSCs were observed by fluorescence microscopy; and expression of Hpa gene in renal tissue was detected by RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the model group, the 24-hour urinary protein, serum total cholesterol, triglyceride, low-density lipoprotein, creatinine, and blood urea nitrogen levels were significantly lower, while the serum total protein, albumin and high-density lipoprotein levels were significantly higher in the three treatment groups (P < 0.05). These indicators showed significant differences between the combined group and ADMSCs and cordyceps polysaccharide groups (P < 0.05). Both ADMSCs transplantation and cordyceps polysaccharide significantly relieved the hypercoagulable state of rats with nephrotic syndrome, and their combined effects were stronger (P < 0.05). After treatment, the pathological improvement in the kidney tissues was found in the three treatment groups; moreover, it was better in the combined treatment group than the ADMSCs and cordyceps polysaccharide groups. Better improvement in the number of PKH26-labeled ADMSCs and the expression of Hpa mRNA was observed in the combined treatment group compared with the ADMSCs and cordyceps polysaccharide groups. In conclusion, the combination of ADMSCs transplantation and cordyceps polysaccharide can improve kidney function and hypercoagulable state in rats with nephrotic syndrome, reducing pathological damage to the kidney tissue.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Mesenchymal Stem Cells, Stem Cell Transplantation, Nephrosis, Lipoid, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

郭志伯，张晨洁，马李娜，高大维，宋聚星，李小静. 脂肪间充质干细胞移植联合人工虫草多糖改善肾病综合征的高凝血状态及肾功能[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(50): 7549-7556.

Guo Zhi-bo, Zhang Chen-jie, Ma Li-na, Gao Da-wei, Song Ju-xing, Li Xiao-jing. Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation combined with cordyceps polysaccharide improves renal function and hypercoagulable state of rats with nephrotic syndrome[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(50): 7549-7556.

图/表（结果） 2

2.1 实验动物数量分析 动物分组实验纳入50只SD大鼠，随机分为5组，全部进入结果分析，无脱失。

2.2 脂肪间充质干细胞的形态观察 体外培养第3代的脂肪间充质干细胞两至三天后即可铺满瓶底达80%以上；1周后可见脂肪间充质干细胞成集落样生长，核仁明显，核染色质细，胞浆丰富，结构清晰，形态具有典型的成纤维样细胞的形态，细胞表面光滑，分布较为均匀，可见明显漩涡状的细胞克隆，杂细胞基本消失。传第3代的脂肪间充质干细胞形态逐渐均一，呈平行排列生长或旋涡状生长，见图1。

2.3 各组大鼠24 h尿蛋白及各血清指标检测结果 与正常组比较，模型组的24 h尿蛋白定量及血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮水平均明显升高(P < 0.05)，血清总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白水平则明显降低(P < 0.01)。脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组及联合组的24 h尿蛋白定量及血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮水平均明显低于模型组(P < 0.05)，而血清总蛋白、白蛋白和高密度脂蛋白水平则明显高于模型组(P < 0.05)。联合组各项指标与脂肪间充质干细胞组及人工虫草多糖组比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。各组大鼠24 h尿蛋白及血清各指标检测结果见表1，2。

2.4 各组大鼠凝血指标变化 各组大鼠的凝血指标检测结果显示，脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组大鼠的血液高凝状态较模型组明显缓解，联合组进一步缓解，各组间差异有显著性意义(P < 0.05)。各组大鼠的凝血指标变化比较见表3及图2。

2.5 各组大鼠的肾组织病理学变化 联合组的病理改善情况明显优于脂肪间充质干细胞组和人工虫草多糖组，脂肪间充质干细胞组和人工虫草多糖组较模型组稍有改善，但不及联合组。各组大鼠的病理学变化见图3。

2.6 PKH26标记结果 荧光显微镜观测PKH26标记后，在551 nm激光作用下，脂肪间充质干细胞膜完整，发出红色荧光；培养24 h后，呈梭形或多角形红色标记的脂肪间充质干细胞，联合组明显多于脂肪间充质干细胞组及人工虫草多糖组，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图4。

2.7 各组大鼠Hpa基因表达情况 模型组Hpa基因表达较正常组明显增加，脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组Hpa基因表达较模型组减少，联合组Hpa基因表达量明显减少，组间比较差异均有显著性意义(P < 0.05)。各组大鼠Hpa基因表达见图5。

参考文献

[1] 刘娇娇,徐虹,戴如凤,等.血管生成素样蛋白3参与肾病综合征高脂血症发生的初步探索[J].中华肾脏病杂志, 2015, 31(9): 669-673.

[2] 魏立新,邹和群,詹林达.HMG-CoA还原酶抑制剂对肾病综合征大鼠肝脏低密度脂蛋白受体表达的影响[J].华中科技大学学报(医学版),2007,36(2):265-268.

[3] 陈子安,隋昕,聂志勇,等.汞中毒致大鼠肾病综合征模型的建立[J].中国急救医学,2015,35(5): 449-454.

[4] 王静,吕洪财.补肾健脾方对肾病综合征模型大鼠性腺保护的研究[J].泰山医学院学报,2015,36(8):859-862.

[5] 田云,卢向阳,何小解,等.儿茶素微胶囊对肾病综合征大鼠肾功能的影响[J].中国临床康复,2004,8(33):7592-7594.

[6] 胡剑卓,邱细敏,江建锋.人工虫草多糖对阿霉素致肾病综合征大鼠的作用研究[J].中医临床研究,2015,7(20):6-8.

[7] 刘柳,高红宇,何晓峰,等.阿托伐他汀抑制Rac1减轻嘌呤毒素氨基核苷诱导的大鼠肾病综合征[J].医学分子生物学杂志,2015,12(5):249-253.

[8] Cohen C, El-Karoui K, Alyanakian MA,et al.Light and heavy chain deposition disease associated with CH1 deletion.Clin Kidney J. 2015;8(2):237-239.

[9] 王静,王娟.补肾健脾方对肾病综合征模型大鼠性腺功能及病理结构的影响[J].泰山医学院学报,2015,36(4): 384-387.

[10] 李丽,王长山,康晓明,等.肾病综合征大鼠血清IL-4和IL-12的动态变化及其意义[J].黑龙江医药科学,2015,38(2): 12-14.

[11] 宣伟东,唐大海,范正平.百瑞口服液对阿霉素肾病大鼠综合征的治疗作用[J].中国药业, 2014,23(9):8-10.

[12] Bautista J, Bella A, Chaudhari A, et al. Advanced chronic kidney disease in non-valvular atrial fibrillation: extending the utility of R2CHADS2 to patients with advanced renal failure. Clin Kidney J. 2015;8(2):226- 231.

[13] Wang Y, Yin HP, Lv XB, et al. Protection of chronic renal failure by a polysaccharide from Cordyceps sinensis. Fitoterapia. 2010;81(5):397-402.

[14] 葛斌,谢梅林,顾振纶,等.肾炎灵对阿霉素肾病大鼠肾脏的保护作用[J].苏州大学学报(医学版),2009,29(2):252-255.

[15] 郑京,陈雪兰,黄璐,等.骨髓间充质干细胞对阿霉素肾病大鼠的治疗作用及黏着斑激酶的影响[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,7(22):10148-10153.

[16] 周芳,张梅,李龙珠,等.冬虫夏草提取液对大鼠实验性肾脏缺血/再灌注后VEGF及肾功能影响[J].浙江临床医学, 2015, 17(10):1678-1680.

[17] 江雪莲,李敏,李莉,等.冬虫夏草提取液对肾移植大鼠肾缺血再灌注损伤免疫调节作用的影响[J].国际中医中药杂志,2015,37(10):904-908.

[18] Lin CY, Ku FM, Kuo YC, et al. Inhibition of activated human mesangial cell proliferation by the natural product of Cordyceps sinensis (H1-A): an implication for treatment of IgA mesangial nephropathy. J Lab Clin Med. 1999;133(1):55-63.

[19] 李蓉,孙书娟,江晓路.虫草多糖的分离纯化及结构鉴定[J].中国药师,2015,18(3): 407-409,419.

[20] 刘雪芹,于湄,张燕,等.人工虫草多糖对2型糖尿病小鼠胰岛素抵抗的影响[J].医药导报, 2011,30(1):5-8.

[21] 王蕾,于荣敏,张辉,等.人工培养蛹虫草多糖的分离纯化及其结构的初步研究[J].中国生化药物杂志,2003,24(1): 23-25.

[22] Kim HS, Kim JY, Kang JS, et al. Cordlan polysaccharide isolated from mushroom Cordyceps militaris induces dendritic cell maturation through toll-like receptor 4 signalings. Food Chem Toxicol. 2010;48(7):1926-1933.

[23] 龚晓健,李绍平.人工虫草多糖对小鼠免疫功能的影响[J].中国药科大学学报,2000,31(1):53-55.

[24] Chang Y, Hsu WH, Lu WJ, et al. Inhibitory Mechanisms of CME-1, a Novel Polysaccharide from the Mycelia of Cordyceps sinensis, in Platelet Activation. Curr Pharm Biotechnol. 2015;16(5):451-461.

[25] 唐惠玲,陈涛,王莹,等.虫草多糖荧光标记的方法学研究[J].药学与临床研究,2010,18(3):279-281.

[26] 宾文,宋丽艳,于荣敏,等.人工培养蛹虫草多糖的抗炎及免疫作用研究[J].时珍国医国药,2003,14(1): 1-2.

[27] Wang Y, Liu D, Zhao H, et al. Cordyceps sinensis polysaccharide CPS-2 protects human mesangial cells from PDGF-BB-induced proliferation through the PDGF/ERK and TGF-β1/Smad pathways. Mol Cell Endocrinol. 2014;382(2): 979-988.

[28] Chen W,Zhang W,Shen W,et al.Effects of the acid polysaccharide fraction isolated from a cultivated Cordyceps sinensis on macrophages in vitro. Cell Immunol. 2010;262(1): 69-74.

[29] 王琴,侯晓强,崔向军,等.黄芪白花蛇舌草汤对阿霉素肾病大鼠的治疗作用[J].长春中医药大学学报,2015,31(1): 6-9.

[30] 杨智,向爱国,金红,等.中药复方对肾病综合征大鼠肾功能影响的实验研究[J].湖南中医杂志,2007,23(2):82-83.

[31] 任健,张倩落,郑莉.人工虫草多糖对免疫低下小鼠免疫功能的影响[J].第四军医大学学报,2007,28(21):1967- 1969.

[32] 张芬芳,王喜栋,范焕芳,等.柴苓归芪汤加蚓激酶对实验性肾病综合征大鼠肾功能的保护作用[J].中西医结合学报, 2005,3(4):294-298.

[33] 姜燕.黄芪甲苷孵育的人脂肪源性干细胞对急性肾损伤模型小鼠的影响及机制研究[D].上海中医药大学,2014.

[34] 高加胜.温敏性氯化壳聚糖水凝胶增强脂肪间充质干细胞治疗急性肾损伤的疗效[J].福建医科大学,2012.

[35] 胡丹.人脂肪源间充质干细胞对顺铂致小鼠急性肾损伤的影响[J].新乡医学院,2012.

[36] 孙雅娟,李华,刘娜,等.Apical bud上皮诱导脂肪间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的研究[J].中华老年口腔医学杂志,2015,13(1):7-11.

[37] Guo J, Zou Y, Wu Z, et al. Protective effects of mesenchymal stromal cells on adriamycin-induced minimal change nephrotic syndrome in rats and possible mechanisms. Cytotherapy. 2014;16(4): 471-484.

[38] Dellepiane S, Ribaldone DG. Pathogenesis of nephrotic syndrome after hematopoietic stem cell transplantations. Minerva Med. 2016;107(3):183-184.

[39] Wong E, Lasica M, He SZ, et al. Nephrotic syndrome as a complication of chronic graft-versus-host disease after allogeneic haemopoietic stem cell transplantation. Intern Med J. 2016;46(6):737-341.

[40] Fuyama M, Ikeda H, Isoyama K. [A case of focal segmental glomerulosclerosis with nephrotic syndrome after hematopoietic stem cell transplantatation for aplastic anemia]. Nihon Jinzo Gakkai Shi. 2013;55(1): 83-89.

[41] Beyar Katz O, Kruzel Davila E, Zuckerman T, et al. Nephrotic syndrome after hematopoietic stem cell transplantation: a single center experience. Minerva Med. 2015;106(6):355-357.

[42] Beyar-Katz O, Davila EK, Zuckerman T, et al. Adult Nephrotic Syndrome after Hematopoietic Stem Cell Transplantation: Renal Pathology is the Best Predictor of Response to Therapy. Biol Blood Marrow Transplant. 2016;22(6):975-981.

[43] Dhakal B, Singavi A, Cohen EP, et al. Chronic GVHD and concurrent new-onset nephrotic syndrome in allogeneic transplant recipients. Incidence, pattern and therapeutic outcomes. Bone Marrow Transplant. 2015; 50(3):449-451.

引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 于2014年2月至2015年11月在河北医科大学动物实验室完成。

1.3 材料

实验动物：成年健康级SD大鼠52只，性别不限，由河北医科大学动物实验室提供。所有大鼠的饲养条件为：18-22 ℃，恒温，湿度为50%-70%，喂养饲料：颗粒型普通大鼠饲料及消毒无菌水，让其自由饮水和进食，实验前1 d禁食不禁水。50只大鼠进行分组实验，按随机数字表法取10只为正常组，余40只大鼠静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型后，均分为4组，每组10只。

材料及来源：人工虫草多糖购自济南市嘉格生物科技有限公司，L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素(青霉素、链霉素)购自Gibco公司，胰蛋白酶和CM-Dil购于Sigma公司，阿霉素购于美罗华。细胞培养瓶和培养皿购于上海百研生物科技有限公司，二氧化碳培养箱购于上海人和科技有限公司，荧光显微镜购于上海仪器厂，冷冻切片机购于Leica CM 1900，凝胶成像系统购于Bio-Rad，Gel doc RX，紫外分光光度计购于上海奥析原，全自动生化仪购自日立公司(型号7170S)，mRNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒购自美国Hyclone公司。

1.4 方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的体外培养 将2只SD大鼠麻醉后处死，固定在无菌操作台上，分离大鼠腹股沟及附睾处脂肪组织，操作中严格按无菌操作原则进行，用PBS将取下的脂肪组织冲洗2遍，然后用剪刀剪成肉糜样的细小颗粒，将剪碎后的脂肪组织置入离心管中，同时向离心管中加入2倍剂量的0.1%Ⅰ型胶原酶，用胶头滴管将二者吹打均匀，将离心管置于37 ℃条件下进行消化，120 min后，将等体积的低糖DMEM完全培养基注入离心管中，将离心机调至1 000 r/min，离心2 min，取出离心管，弃去上清液，加入PBS冲洗2遍，将冲洗后的上层的脂肪及上清一同弃去，保留离心管底部的沉积物，再次加入完全培养基，用胶头滴管将培养基连同沉淀一起吹打至悬浮状态，接种于培养皿中，将培养皿置于培养箱中培养72 h时，取出培养皿更换1次培养基，同时将未贴壁的细胞随一同弃去，之后每隔1 d更换1次培养基，直至贴壁细胞数达总量的80%-90%，取出培养基加入0.25%胰酶进行消化，并且按照1∶2的比例进行传代，选取体外培养至P3代生长旺盛的脂肪间充质干细胞进入实验研究。

1.4.2 实验分组 50只SD大鼠随机取10只为正常组，余40只SD大鼠静脉注射阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型后，随机均分为4组，模型组不作处理；脂肪间充质干细胞组尾部静脉注射脂肪间充质干细胞1×10⁷/d，连续 3 d；人工虫草多糖组灌胃人工虫草多糖2.5 g/(kg?d)，连续12周；联合组连续3 d尾静脉注射干细胞1×10⁷/d，同时灌胃2.5 g/(kg?d)人工虫草多糖连续12周。

1.4.3 大鼠肾病综合征模型建立 正常组大鼠一次性注射生理盐水，剂量为5 mg/kg，其余4组大鼠均于尾部一次性注射剂量为5 mg/kg的盐酸阿霉素建立阿霉素肾病大鼠模型。采用3.5%的水合氯醛麻醉，待大鼠完全麻醉(全身肌肉比较松弛)后，将其固定于染尘架上采用非暴露式气管内注入法灌注1 mL生理盐水SiO₂混悬液(配制成 40 g/L悬液，灭菌后加青霉素2 000 U/mL，以防止肾部感染)缓慢注入气管。

1.4.4 检测24 h尿蛋白、总胆固醇、三酰甘油、总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮及凝血指标变化 给药12周后，将大鼠置于清洁代谢笼内，留取24 h尿液，采用三氯乙酸法检测大鼠24 h尿蛋白含量。采用乙醚麻醉各组大鼠，待麻醉后，用毛细血管眼眶取血，取眼眶内静脉血样，室温下迅速离心，5 000 r/min，离心3 min，保留血清移去沉渣，-80 ℃冷冻保存。取血清采用全自动生化分析仪检测血清总胆固醇、三酰甘油、总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮及凝血指标变化。

1.4.5 苏木精-伊红染色观察病理学变化 大鼠给药12周后，采用乙醚腹腔麻醉后，断头处死，剖腹取肾脏，取左右双肾组织约2 mm大小的皮质, 放置于体积分数10%缓冲中性甲醛溶液中固定，冷冻切片机横向切片，明胶包被盖玻片，将厚度为8 μm的切片贴于盖玻片上，-20 ℃保存。盖玻片完全浸没于无水乙醇，静止0.5 h，放入PBS溶液，漂洗3次，浸入苏木精染液，15 min后，多次浸入蒸馏水，标本为深蓝色。浸入1%HCl，静止片刻，分色后，脱去多余蓝色浮色，标本此时转为淡紫红色，而细胞质为无色或灰蓝色。蒸馏水多次浸洗，15 min后，浸入淡氨水(2滴氨水加入到400 mL蒸馏水中)，10 min后，出现淡蓝色。蒸馏水再次浸洗15 min，浸没伊红染液，染色15 min，蒸馏水浸洗1次，逐级乙醇脱水、2次滴入二甲苯，均浸入1 min，最终用中性树胶封盖。光学显微镜观察并拍照。

1.4.6 荧光显微镜观测PKH26标记的脂肪间充质干细胞存活及分布 大鼠给药12周后，取左右双肾组织约2 mm大小的皮质，对组织切片进行荧光显微镜观察。每张切片在高倍镜(×200)下任取10个视野，计算每个视野中的PKH26阳性细胞数，取其均值作为各组的PKH26阳性细胞数，观察荧光显微镜下PKH26标记脂肪间充质干细胞的存活和分布。

1.4.7 RT-PCR检测Hpa基因表达 大鼠给药12周后，取左右双肾组织约50 mg的皮质，按Hyclone公司Trizol Total Isolation Reagent 说明书进行提取总RNA并以总RNA的mRNA为模板，参照说明书的反转录酶法反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。吸取2 μL的悬浮细胞液，正反向引物各加入1 μL悬浮细胞液。Hpa引物序列上游为5’-TTC GAT CCC AAG AAG GAA TCA AC-3’，下游为5’-GTA GTG ATG CCA TGT AAC TGA ATC-3’，扩增目的基因片段长度为585 bp。以GAPDH作为内参照，其引物序列上游为5’-ATC TGG CAC CAC ACC TTC TAC AAT GAG CTG CG-3’，下游为5’-CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC ACA TCT GC-3’，扩增目的基因片段长度为838 bp。反应循环条件如下：反转录37 ℃，94 ℃变性5 min，94 ℃ 20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃ 40 s，35循环，最终72 ℃延伸10 min。30个循环后进一步延伸72 ℃ 5 min。将PCR产物10 μL于2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶自动成像及分析系统，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带吸光度A值，计算Hpa与GAPDH的A值比值，各组实验均需重复3次。

1.5 主要观察指标 检测24 h尿蛋白、总胆固醇、三酰甘油、总蛋白、白蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮及凝血指标变化；苏木精-伊红染色观察病理学变化；荧光显微镜观测PKH26标记的脂肪间充质干细胞存活及分布；RT-PCR检测Hpa基因表达情况。

1.6 统计学分析 所有计量数据以x(_)±s表示，成组设计的均数之间采用t 检验方法，多组间的数据比较采用方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。实验数据的分析软件为SPSS 13.0。

讨论

冬虫夏草是中国传统中草药中的补益类中药，属于肉座菌目麦角菌科虫草属植物，冬虫夏草具有广泛的药理功效，是一种名贵的强壮滋补中药。但因其资源较少、价格又昂贵，使临床应用受到限制^[15-18]。近年来随着医药技术水平的不断提高，以及人工虫草培植技术的应用，为该药的临床应用提供了希望^[19-23]。实验研究表明，人工虫草多糖具有免疫调节、改善血脂和保护肾功能等作用^[24-27]。文章将人工虫草多糖应用到阿霉素肾病大鼠模型中，通过实验观察人工虫草多糖对阿霉素诱导的肾病综合征大鼠的作用机制。人类血小板同种抗原不相合的血小板输注可以产生同种免疫应答，导致血小板破坏。目前在临床上，人类血小板同种抗原再血小板输注中的意义已引起广泛重视。

近些年来随着干细胞治疗在动物实验中的不断研究应用，已为遗传性疾病、免疫缺陷及恶性肿瘤提供了新的研究手段^[28-31]。脂肪间充质干细胞具有较强的分化、增殖能力，已成为越来越多的研究者关注的对象^[32-36]。文章将脂肪间充质干细胞移植入阿霉素肾病综合征大鼠模型中，并将其与人工虫草多糖联合应用，其结果显示脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组及联合组的24 h尿蛋白定量及血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、肌酐、尿素氮均明显低于模型组，联合组又明显低于脂肪间充质干细胞组及人工虫草多糖组，而血清总蛋白、白蛋白和高密度脂蛋白的比较在脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组及联合组则明显高于模型组，联合组各项指标与脂肪间充质干细胞组及人工虫草多糖组比较，差异有显著性意义。可推测出脂肪间充质干细胞及人工虫草多糖具有减少蛋白尿、调节相关蛋白、调节机体免疫功能等作用。其可能通过提高整体能量与物质代谢，进而改善肾脏组织器官的功能。

此外文章对各组大鼠的凝血指标变化、病理学变化及大鼠肾组织中Hpa基因表达变化进行检测，结果显示，脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组大鼠的血液高凝状态较模型组明显缓解，联合组进一步缓解，各组间差异有显著性意义。联合组的病理改善情况明显优于脂肪间充质干细胞组和人工虫草多糖组，脂肪间充质干细胞组和人工虫草多糖组较模型组稍有改善，但不及联合组。模型组Hpa基因表达较正常组明显增加，脂肪间充质干细胞组、人工虫草多糖组Hpa基因表达较模型组减少，联合组Hpa基因表达量明显减少。结果证明人工虫草多糖及脂肪间充质干细胞均改善SD大鼠肾脏的凝血功能，这可能与人工虫草多糖的益肾、补精髓、发挥其扶正祛邪作用关系密切。联合组更显著的疗效证明其对肾功能的治疗作用，可能通过促进微血管循环，增加肾血流量，减轻肾小球滤过膜的损伤，减轻肾脏病理变化发挥治疗作用^[37-43]。

综述所述，文章利用阿霉素肾病大鼠模型研究人工虫草多糖联合脂肪间充质干细胞移植对肾病综合征的作用，取得较好效果，结果表明人工虫草多糖及脂肪间充质干细胞均可对肾病综合征大鼠发挥疗效，但将二者联合应用后可以更好的改善大鼠凝血功能，减轻肾脏组织病理损伤情况，促进大鼠肾功能恢复。文章结果为临床治疗肾病综合征提供了实验数据，但由于干细胞移植治疗的复杂性，其具体机制还需长期进一步探讨。