病毒转染骨髓基质干细胞在不同移植点对颅脑损伤的保护

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.36.009

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
病毒转染：是指将外源病毒导入真核细胞的技术，用病毒将带有目的基因的载体整合到细胞的基因组中，以达到长期稳定表达目的基因的目的。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。
神经生长因子：是神经营养因子中最早被发现，目前研究最为透彻的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。神经生长因子包含α、β、γ3个亚单位，活性区是β亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，与人体神经生长因子的结构具有高度同源性，生物效应也无明显的种间特异性。

摘要
背景：骨髓基质干细胞可分化为神经细胞，能促进神经组织修复，但具体机制还未完全阐明。
目的：探讨β神经生长因子重组腺病毒转染骨髓基质干细胞移植对颅脑损伤的保护作用机制。
方法：①利用β神经生长因子重组腺病毒载体系统转染体外培养的大鼠骨髓基质干细胞，然后用β-巯基乙醇对骨髓基质干细胞进行定向诱导分化；②选取210只SD大鼠，随机分为5组：诱导转染骨髓基质干细胞组、诱导未转染骨髓基质干细胞组、诱导剂+培养基组、颅脑损伤组、假手术组，每组42只。制备颅脑损伤模型，按照不同时间点(12，24，36，48，72 h)进行相应的移植物治疗，分别于移植当天，移植1，2，3，4周采用NSS评分法进行神经功能评分；③选取75只SD大鼠，同上随机分为5组，每组15只。颅脑损伤模型制备24 h后进行相应的移植物治疗。移植当天，移植1，2，3，4周对各组动物进行NSS 评分。移植当天，移植2，4周，分别处死各组5只动物，获得脑组织标本，检测超氧化物歧化酶、丙二醛水平。
结果与结论：①在48 h内移植，移植后1，2周诱导转染骨髓基质干细胞组的NSS评分均显著低于诱导未转染骨髓基质干细胞移植组和颅脑损伤组(P < 0.05)；各移植时间点，移植后3，4周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组的NSS评分均显著低于诱导未转染骨髓基质干细胞移植组和颅脑损伤组(P < 0.05)；②在大鼠损伤后24 h移植，移植第1周诱导转染骨髓基质干细胞组NSS评分显著低于颅脑损伤组(P < 0.05)，移植第2，3，4周诱导转染骨髓基质干细胞移植组与诱导未转染骨髓基质干细胞移植组NSS评分均显著低于颅脑损伤组(P < 0.05)；③移植后2周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组的超氧化物歧化酶水平均显著高于诱导剂+培养基移植组和颅脑损伤组(P < 0.05)，丙二醛水平显著低于上述两组(P < 0.05)；④结果表明，β神经生长因子重组腺病毒转染骨髓基质干细胞在不同时间点移植治疗颅脑损伤大鼠，可以发挥出一定的神经保护作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-4229-7570(刘红林)

关键词: 干细胞, 移植, 颅脑损伤, 骨髓基质干细胞, 病毒转染, 大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow stromal cells can differentiate into nerve cells to promote nerve tissue repair, but the exact mechanism has not been fully elucidated.
OBJECTIVE: To explore the influence of adenovirus-mediated β nerve growth factor transfection on bone marrow stromal stem cell transplantation fighting against brain injury in rats.
METHODS: (1) Rat bone marrow stromal stem cells were cultured in vitro, transfected with the adenovirus-mediated β nerve growth factor and directionally induced using β-mercaptoethanol. (2) A total of 210 Sprague-Dawley rats were randomized into induction+tranfection group, induction+non-transfection group, induction+medium group, model group, and sham group (n=42 per group). Rat skull injury models were made, and given corresponding treatments at different time points (12, 24, 36, 48, 72 hours). Neurological function of rats was evaluated based on neurological severity scores on the day that the rats were given transplantation, and 1, 2, 3, 4 weeks after transplantation. (3) Another 75 Sprague-Dawley rats were also divided into five groups (n=15 per group) as above, followed by model establishment and corresponding treatments at 24 hours after modeling. Neurological severity scores were recorded at the same day, 1, 2, 3, 4 weeks after transplantation. Five rats from each group were sacrificed to detect levels of malondialdehyde and superoxide dismutase in the rat brain at the same day, 2 and 4 weeks after transplantation, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: If the cells were transplanted within 48 hours after modeling, the neurological severity scores in the induction+transfection group decreased significantly compared with the induction+non-transfection group and model group at 1 and 2 weeks after transplantation (P < 0.05). If the cells were transplanted at different time, the neurological severity scores in the induction+transfection group were decreased significantly compared with the induction+non-transfection group and model group at 3 and 4 weeks after transplantation (P < 0.05). If the cells were transplanted within 24 hours after modeling, the neurological severity scores in the induction+transfection group decreased significantly compared with the model group at 1 week after transplantation (P < 0.05), and the neurological severity scores in the induction+transfection group and induction+non-transfection group both were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). Two weeks after cell transplantation, the level of superoxide dismutase was significantly higher in the induction+transfection group than the induction+medium group and model group (P < 0.05), but the level of malondialdehyde was significantly lower (P < 0.05). All these findings indicate that adenovirus-mediated β nerve growth factor transfer plays a certain neuroprotective role in bone marrow stromal stem cell transplantation for brain injury in rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Stem Cell Transplantation, Craniocerebral Trauma, Transfection, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

刘红林，刘志军，陈小兵，胡文忠，丁丙谦. 病毒转染骨髓基质干细胞在不同移植点对颅脑损伤的保护[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(36): 5378-5384.

Liu Hong-lin, Liu Zhi-jun, Chen Xiao-bing, Hu Wen-zhong, Ding Bing-qian. Transplanting virus-transfected bone marrow stromal stem cells at different time against brain injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(36): 5378-5384.

图/表（结果） 2

2.1 动物数量分析 入组的动物均进入结果分析，未出现死亡和脱落现象。

2.2 骨髓基质干细胞培养结果 培养2 d后，细胞开始贴壁，呈梭形，培养7 d后，细胞呈漩涡状排列(图1)。

2.3 移植转染骨髓基质干细胞不同时间点NSS评分 各组移植不同时间点NSS评分均显著高于假手术组 (P < 0.05)。12，24，36，48 h移植点在移植后1，2周，转染骨髓基质干细胞组的NSS评分均显著低于未转染骨髓基质干细胞移植组和颅脑损伤组(P < 0.05)。不同移植时间点在移植后3，4周，转染骨髓基质干细胞移植组的NSS评分均显著低于未转染骨髓基质干细胞移植组和颅脑损伤组(P < 0.05)，见表1。

2.4 移植不同来源骨髓基质干细胞大鼠的NSS评分 移植后不同时间，各组大鼠的NSS评分均显著高于假手术组(P < 0.05)。移植后1周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组评分显著低于颅脑损伤组(P < 0.05)。移植后2，3，4周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组与诱导未转染骨髓基质干细胞移植组评分均显著低于颅脑损伤组(P < 0.05)，见表2。

2.5 移植不同来源骨髓基质干细胞大鼠超氧化物歧化酶、丙二醛水平 随着移植时间的延长，假手术组超氧化物歧化酶、丙二醛水平基本保持不变，其余各组均出现一定的变化，见图2，3。经统计学比较，移植后不同时间，各组超氧化物歧化酶水平均显著低于假手术组，丙二醛水平均显著高于假手术组(P < 0.05)；移植后2周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组的超氧化物歧化酶水平均显著高于诱导剂+培养基组与颅脑损伤组，丙二醛水平显著低于上述两组(P < 0.05)。移植后4周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组和诱导未转染骨髓基质干细胞移植组的超氧化物歧化酶水平均显著高于诱导剂+培养基组与颅脑损伤组，丙二醛水平显著低于上述两组(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2015年9至12月在河南大学淮河医院实验室完成。

1.3 材料 纳入健康SD大鼠285只用于动物体内实验，清洁级，10周龄，体质量300-400 g，由北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司提供，许可证号SYXK(京)2015-0008。健康SD大鼠10只用于骨髓基质干细胞培养，5周龄，体质量300-400 g，由北京北中联合医学研究院提供，许可证号SYXK(京)2015-0006。研究相关方案符合动物伦理学要求。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓基质干细胞培养与病毒转染 取10只大鼠的股骨，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔。收集冲洗液，置于200目不锈钢网上过滤，收集细胞悬液，离心后去掉上清，细胞重悬后接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中，每2 d或3 d换液1次，取第3代细胞进行后续实验^[5]。构建β神经生长因子重组腺病毒高效表达载体系统，对骨髓基质干细胞进行转染^[6]。利用反转录多聚酶链式反应从小鼠颌下腺总mRNA中扩增β神经生长因子全长cDNA片断，定向克隆于携带巨细胞启动子和绿色荧光蛋白的腺病毒穿梭质粒pAdtrack中，在细菌BJ5183中与缺陷型腺病毒基因组padeaSy-1进行同源重组。体外环境下，用含体积分数为20%胎牛血清、1 mmoI/L β-巯基乙醇的L-DMEM培养液对细胞进行预诱导24 h，PBS洗涤，添加含2%二甲基亚砜、200 μmoL/cm² BHA的无血清L-DMEM诱导5 h，在第10小时加入神经元细胞培养基(H-DMEM+体积分数为10%胎牛血清+2%二甲基亚砜)，将骨髓基质干细胞诱导分化为神经元样细胞^[7]，调整细胞浓度为1×10¹² L^-¹备用。

1.4.2 不同移植点骨髓基质干细胞对各组大鼠神经功能的影响 选取210只SD大鼠，随机分为5组：诱导转染骨髓基质干细胞组、诱导未转染骨髓基质干细胞组、诱导剂+培养基组、颅脑损伤组、假手术组，每组42只。参照文献[8]方法制备颅脑损伤模型，按照不同时间点(12，24，36，48，72 h)于硬膜下注射相应的移植物4 μL，分别于移植当天、移植1周、移植2周、移植3周、移植4周采用NSS评分法进行神经功能评分。

1.4.3 不同来源骨髓基质干细胞对颅脑损伤大鼠功能影响^[9] 选取75只SD大鼠，随机分为5组：诱导转染骨髓基质干细胞组、诱导未转染骨髓基质干细胞组、诱导剂+培养基组、颅脑损伤组、假手术组，每组15只。按照上述方法制备大鼠颅脑损伤模型，模型制备24 h后进行相应的移植物治疗。移植当天、移植1周、移植2周、移植3周、移植4周对各组动物进行NSS评分。移植当天、移植2周、移植4周，分别处死各组5只动物，获得脑组织标本，检测超氧化物歧化酶、丙二醛水平。

1.5 主要观察指标 ①大鼠NSS神经功能评分；②大鼠脑组织中丙二醛与超氧化物歧化酶水平。

1.6 统计学分析 使用SPSS 18.0软件进行处理，组内比较予以配对t 检验，组间比较予以单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

对于颅脑损伤，一直缺乏十分有效的治疗方案^[10]。随着干细胞理论和技术的不断发展，干细胞移植成为治疗颅脑损伤的重要方法^[11-14]。骨髓基质干细胞具有来源广泛和操作简单以及分化能力强等特点，成为应用十分广泛的细胞类型^[15-20]。

腺病毒载体具有宿主范围广、病毒滴度高、插入量大等特点，是一种应用十分广泛的病毒载体^[21-24]。实验选择利用β神经生长因子重组腺病毒载体系统转染大鼠骨髓基质干细胞，对颅脑损伤大鼠进行治疗。β神经生长因子是一种重要的神经营养因子，可以有效地促进神经元分化^[25-26]。实验发现，各组不同时间的NSS评分均显著高于假手术组，12，24，36，48 h移植点在移植后1，2周，转染骨髓基质干细胞组的NSS评分均显著低于未转染骨髓基质干细胞移植组和颅脑损伤组(P < 0.05)。不同移植时间点在移植后3，4周，转染骨髓基质干细胞移植组的NSS评分均显著低于未转染骨髓基质干细胞移植组和颅脑损伤组(P < 0.05)。

实验分析了移植不同来源骨髓基质干细胞大鼠NSS评分，结果显示，移植后不同时间，各组大鼠的NSS评分均显著高于假手术组(P < 0.05)。移植后1周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组评分显著低于颅脑损伤组(P < 0.05)。移植后2，3，4周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组与诱导未转染骨髓基质干细胞移植组评分均显著低于颅脑损伤组(P < 0.05)。上述结果表明，病毒转染骨髓基质干细胞在不同移植点移植治疗颅脑损伤大鼠，可以发挥出良好的保护作用，可能是因为β神经生长因子可以上调一些抗氧化物酶的活性，发挥出良好的清除氧自由基的作用，进而达到保护神经细胞的效果，促进神经功能改善^[27-30]。

丙二醛是一种内皮衍生因子，在出现脑细胞缺血、缺氧情况时，丙二醛水平显著上升，并发挥出重要的生物学活性^[31-36]。超氧化物歧化酶是一种金属酶，可以对超氧阴离子产生催化作用，对其组织细胞损伤作用产生影响，达到消除自由基的目的^[37-39]。实验结果显示，移植后不同时间，各组超氧化物歧化酶水平均显著低于假手术组，丙二醛水平均显著高于假手术组(P < 0.05)；移植后2周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组的超氧化物歧化酶水平均显著高于诱导剂+培养基组与颅脑损伤组，丙二醛水平显著低于上述两组(P < 0.05)。移植后4周，诱导转染骨髓基质干细胞移植组和诱导未转染骨髓基质干细胞移植组的超氧化物歧化酶水平均显著高于诱导剂+培养基组与颅脑损伤组，丙二醛水平显著低于上述两组(P < 0.05)，提示病毒转染骨髓基质干细胞可以有效下调丙二醛水平，上调超氧化物歧化酶水平，达到理想保护脑组织细胞的目的。

综上所述，β神经生长因子重组腺病毒感染骨髓基质干细胞在不同时间点移植治疗颅脑损伤大鼠，可以发挥出一定的神经保护作用。