银屑病患者与正常人皮肤间充质干细胞的生物学特性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.021

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
皮肤间充质干细胞：为皮肤微环境的重要组成成分之一，不仅参与了细胞外基质重塑而且精确地协调细胞生长因子表达、协调角质形成细胞有序正常地进行有丝分裂和迁移，有效维护了皮肤组织的发育和再生。
银屑病的发病机制：银屑病的病因与发病机制非常复杂，在遗传因素的基础上，各种环境因素诱导机体的神经-内分泌系统异常，对皮肤中各种免疫细胞的调控失常，导致炎症性细胞因子的释放，进一步使机体的先天性与获得性免疫功能发生障碍，更多的炎症性细胞因子释放，引诱相关炎症细胞浸润，这种神经-内分泌-免疫-炎症网络的逐级放大最终导致了银屑病特有的慢性炎症过程的形成与维持。

摘要
背景：研究皮肤来源间充质干细胞可以反映银屑病的发病情况。
目的：分析银屑病皮肤间充质干细胞的生物学特性。
方法：利用酶消化法分离培养银屑病组与正常对照组(健康人)皮肤间充质干细胞，流式细胞术检测细胞免疫表型，分别用成软骨、成脂、成骨诱导体系鉴定细胞多向分化能力，细胞计数法绘制第3代细胞增殖曲线，用ELISA法检测细胞培养上清液中转化生长因子β1和表皮生长因子水平。
结果与结论：①倒置相差显微镜下观察银屑病组与正常对照组细胞形态均存在异质性；②细胞表面抗原CD29、CD90、CD44、CD73及CD105呈高表达，CD45、CD34及HLA-DR呈低表达；③成脂、成骨、成软骨诱导后皮肤间充质干细胞可向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化；④银屑病组皮肤间充质干细胞增殖速度明显快于对照组，但最终两组细胞数量趋于一致，并没有明显的差异；⑤银屑病组皮肤间充质干细胞分泌表皮生长因子和转化生长因子β1水平与患者病情严重程度无相关性(P > 0.05)。与对照组比，银屑病组细胞培养上清液中表皮生长因子水平明显偏高，转化生长因子β1水平明显偏低，差异有显著性意义(P < 0.01)；⑥结果表明，银屑病患者皮肤间充质干细胞形态存在异质性，细胞生物学活性异常。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2674-3315(张晶)

关键词: 干细胞, 分化, 皮肤间充质干细胞, 银屑病, 生物学特性, 脂肪细胞, 成骨细胞, 软骨细胞, 表皮细胞生长因子, 转化生长因子β1

Abstract:

BACKGROUND: Skin-derived mesenchymal stem cells may reflect the onset of psoriasis.
OBJECTIVE: To analyze the biological characteristics of skin-derived mesenchymal stem cells in psoriasis patients.
METHODS: Skin-derived mesenchymal stem cells from 30 patients with psoriasis and 20 healthy controls were isolated and cultured by trypsin. Flow cytometry was used to detect the cellular immune phenotypes CD34, CD44, CD29, CD45, CD90, CD105, CD73 and HLA-DR. The mesenchymal stem cells were induced by the corresponding cartilage, osteogenic and osteogenic inducing agents, to identify the multi-directional differentiation ability. The cell proliferation curve was plotted at passage 3, and the levels of transforming growth factor-β1 and epidermal growth factor in culture supernatant were detected by ELISA assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Under an inverted phase contrast microscope, primary skin-derived mesenchymal stem cells isolated from patients with psoriasis and normal controls both exhibited heterogeneity. In the two groups, CD29, CD90, CD44, CD73 and CD105 were highly expressed, and CD45, CD34, and HLA-DR were lowly expressed. Under certain conditions, skin-derived mesenchymal stem cells were induced to differentiate into adipocytes, osteoblasts or chondrocytes. Proliferation of skin-derived mesenchymal stem cells in the psoriasis group was significantly faster than that in control group, but the final number of cells in the two groups tended to be consistent. The levels of transforming growth factor-β1 and epidermal growth factor in the psoriatic skin had no correlation with the severity of the disease (P > 0.05). Compared with the control group, the epidermal growth factor level in the cell supernatant was significantly higher in the psoriasis group (P < 0.01), while the level of transforming growth factor-β1 was significantly lower (P < 0.01). These results showed that there is heterogeneity in the morphology of skin-derived mesenchymal stem cells from psoriasis patients, and the biological activity of mesenchymal stem cells is abnormal.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Psoriasis, Skin, Mesenchymal Stem Cells, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

张晶，王生，康康，王建美. 银屑病患者与正常人皮肤间充质干细胞的生物学特性[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4852-4858.

Zhang Jing, Wang Sheng, Kang Kang, Wang Jian-mei. Biological characteristics of mesenchymal stem cells from psoriatic skin versus normal skin[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4852-4858.

图/表（结果） 1

2.1 皮肤间充质干细胞的形态学特征 在倒置相差显微镜下观察，早期聚集的单个细胞未见贴壁，呈小圆形，银屑病组和正常对照组分离的原代细胞经过3 d培养后，可见少量长梭形细胞贴壁(图1A)。随着培养时间的延长贴壁细胞逐渐变大、增多，继续培养3 d后，可见细胞呈集落状态生长，形状多为短梭形，有少数呈三角状，极少数呈现出多角形，待细胞融合90%左右时，细胞生长连接紧密，呈梭形排列，重叠生长，形成漩涡状(图1B)。两组细胞形态相似，均包含两种形态的细胞成分(图1C)。

第3代细胞培养3 d，大部分间充质干细胞呈现为长梭形或成纤维细胞样形态，细胞贴壁生长面积较大，细胞核居中，细胞浆丰富，其中散在分布少量的圆形细胞并没有贴壁生长，而是黏着在贴壁细胞表面，体积较小，但细胞核非常大，折光性较强，多成对出现，形状如“花生荚”(图1D)。

2.2 皮肤间充质干细胞表面标记物鉴定结果 选取银屑病组与正常对照组第3代皮肤间充质干细胞鉴定细胞表面标记物，流式细胞仪检测结果显示：表面抗原CD29、CD90、CD44、CD73及CD105呈高表达，CD45、CD34及HLA-DR呈低表达。

2.3 皮肤间充质干细胞成脂诱导分化 第3代皮肤间充质干细胞经成脂诱导剂诱导分化14 d后，细胞由原来的长梭形变为椭圆形，细胞内有多个大小不等的脂滴样物质形成，且细胞核增大，油红O染色呈现出亮红色(图2A，B)，阴性对照组细胞无脂滴形成，油红O染色阴性(图2C)。

2.4 皮肤间充质干细胞成骨诱导分化 第3代细胞成骨诱导分化后可见局灶性细胞表面散布淡红染物。经成骨诱导剂培养21 d后，茜素红S染色后可见红色钙结节形成，阴性对照组未见钙结节形成，茜素红S染色表现为阴性，见图3。

2.5 皮肤间充质干细胞成软骨诱导分化 第3代皮肤间充质干细胞经成软骨诱导剂诱导分化14 d后，甲苯胺蓝染色后于倒置显微镜下观察，可见软骨细胞团块呈现为深蓝紫色结节，高倍镜下观察软骨细胞变宽大，胞核饱满，胞质丰富。阴性对照组细胞仍为长梭形，甲苯胺蓝染色呈现为阴性，见图4。

2.6 皮肤间充质干细胞生长增殖能力 银屑病组第3代皮肤间充质干细胞于接种前4 d细胞增殖速度明显快于正常对照组，第6天后细胞数量达最大值后趋于恒定；正常皮肤间充质干细胞增长平稳，同样于第6天细胞数量趋于恒定。
2.7 皮肤间充质干细胞培养上清液中表皮生长因子和转化生长因子β1水平 与对照组比，银屑病组细胞培养上清液中表皮生长因子水平明显偏高，差异有显著性意义(P < 0.01)，而转化生长因子β1水平明显偏低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见表1。

依据Pearson相关分析银屑病组皮肤间充质干细胞分泌表皮生长因子水平与PASI评分无相关性(r=0.132，P > 0.05)，银屑病组皮肤间充质干细胞分泌转化生长因子β1水平与PASI评分无相关性(r=-0.701，P > 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计 随机分组对照实验。

1.2 时间及地点 于2011年5月至2014年7月在河北医学大学附属唐山市工人医院实验室完成。

1.3 对象 2011年5月至2013年6月就诊于河北医学大学附属唐山市工人医院皮肤科的寻常型银屑病患者30例，其中男17例，女13例；年龄20-65岁，平均年龄为(39.41±12.86)岁；病程1-15年，平均病程为(6.91±4.77)年；所有患者均经过临床和病理检查诊断，患者病情依据银屑病皮损面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index，PASI)标准评分进行评估，PASI分值范围为4.1-16.5，平均(11.3±3.06)分。

正常对照组为2011年5月至2013年6月就诊于河北医学大学附属唐山市工人医院整形外科的健康人20例，年龄、性别与银屑病患者相匹配，经过临床和病理检查诊断均无银屑病史，也没有其他免疫性疾病。

研究方案已经通过河北医科大学附属唐山市工人医院伦理委员会审评及批准，所有项目测试均经过供试者知情同意，并签署知情同意书，且所有入选者自身均没有血液系统疾病和其他免疫性疾病，患者入组前3个月内均没有用过免疫抑制制剂、糖皮质激素或维甲酸类制剂等。

1.4 方法

1.4.1 皮肤间充质干细胞的分离 无菌条件下取银屑病患者皮损处皮肤组织以及健康人在整形外科手术切除的正常皮肤组织(大小为1.0 cm×1.0 cm)，用体积分数为75%乙醇消毒处理2次，再用PBS充分清洗3-5次，除去皮下组织和角质层，将真皮层组织放置于含培养基的培养皿中，用剪刀将皮肤组织剪成小块(约0.15 cm× 0.15 cm)，放于小试管中，加入Dispase Ⅱ中性蛋白酶，密封，37 ℃消化3.0-4.0 h，使真皮和表皮分离，弃去表皮，收集真皮部分，加入培养基，切碎真皮组织，收集于EP管中，用吸管反复吹打组织至其成黏稠状，用200目不锈钢筛网滤过，滤液静置于冰上20 min，滤过液以1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，沉淀中加培养基重悬细胞。

1.4.2 皮肤间充质干细胞的培养 将上述稀释细胞以2.0×10⁶/cm²密度接种于含培养基(含体积分数为4%胎牛血清、8 mL/L B27添加剂、8 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、80 mg/L链霉素和80 U/mL青霉素)的培养瓶中，混匀，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱中孵育3 d，弃去悬浮细胞(死细胞)，将贴壁细胞继续培养，加入新配制的上述培养基，每3 d半量更换培养液1次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞贴壁生长近90%时，弃去细胞上清液，用PBS润洗细胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液，待细胞回缩变形达80%以上时，加入含血清的培养液终止消化，以 1 500 r/min离心5 min，弃去上清液，加入培养基混匀细胞制成细胞悬液，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。

1.4.3 皮肤间充质干细胞的表面标记物鉴定 第3代细胞生长达90%融合状态时，加入0.25%胰蛋白酶消化液，用含血清的培养液终止消化，收集细胞，用PBS洗涤2次，取9支试管，每管加入1.0×10⁵个细胞，用PBS润洗后，稀释至100 μL，按试管序号依次加入PE标记的单克隆抗体CD29，CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105及HLA-DR各10 μL，第9支试管中加入10 μL PBS作为阴性对照，置于室温避光孵育30 min，用PBS洗去多余的荧光抗体，经流式细胞仪检测细胞免疫表型及细胞纯度。

1.4.4 皮肤间充质干细胞分化为脂肪细胞及鉴定 第3代皮肤间充质干细胞以2×10⁵/cm²密度接种于24孔板，当细胞融合达90%左右时，随机选6孔加入成脂诱导剂A(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基、0.2 mmol/L吲哚美辛、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.5 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄噪呤)于培养箱中培养3 d，弃去上层培养液，加入成脂诱导剂B(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基、10 mg/L胰岛素)于培养箱中培养1 d，依此培养方法连续循环操作4次，成脂诱导培养第14天时，PBS洗涤3次，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，再用60%异丙醇溶液作用30 min，PBS洗涤3次，油红O染液染色30 min，PBS润洗2次，置于显微镜下观察并采集图像，另设置未诱导分化阴性对照组。

1.4.5 皮肤间充质干细胞分化为成骨细胞及鉴定 第3代将皮肤间充质干细胞以2×10⁵/cm²密度接种于24孔板，当细胞融合达90%左右时，随机选6孔加入成骨诱导剂(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 μmol/L L-抗坏血酸、0.1 μmol/L地塞米松)于培养箱中培养21 d(每隔3 d换培养液1次)，使用PBS洗涤3次，40 g/L多聚甲醛固定 30 min，PBS洗涤3次，茜素红S染液染色30 min，PBS润洗2次，置于显微镜下观察并采集图像，另设置未诱导分化阴性对照组。

1.4.6 皮肤间充质干细胞分化成软骨细胞及鉴定 收集2×10⁶个第3代皮肤间充质干细胞，以1 500 r/min离心 3 min使其成为细胞凝聚团，悬浮培养于聚丙烯锥形试管中，加入成软骨诱导剂(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基、0.1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-谷氨酰胺、1%胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠培养基添加剂、100 mg/L丙酮酸钠、0.1 μmol/L地塞米松、10 μg/L 转化生长因子β3、50 mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸酯，10 mmol/L β-甘油磷酸钠)诱导培养14 d(每隔3 d全量换液)，用PBS洗涤细胞3次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤3次，常规石蜡包埋细胞团，片厚5 μm，依次用二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，甲苯胺蓝溶液染色30 min，水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，置于显微镜下观察并采集图像，另设置未诱导分化阴性对照组。

1.4.7 皮肤间充质干细胞生长增殖能力 随机选择银屑病患者(银屑病组)与健康供试者(正常对照组)各8例，培养皮肤间充质干细胞，第3代皮肤间充质干细胞以2.5×10⁴接种于24孔培养板，每个样品平行接种3个复孔，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，分别于第1，2，3，4，5，6，7天用细胞计数仪计数细胞数量。以细胞计数平均值为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长增殖曲线。

1.4.8 皮肤间充质干细胞培养上清液的收集及检测用无因子添加的DMEM培养基重悬第3代皮肤间充质干细胞，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养3 d，收集细胞培养上清液，以1 500 r/min低温离心 5 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，收集上清。按照ELISA试剂盒操作说明书，用双抗体夹心法分别检测皮肤间充质干细胞培养上清液中的表皮生长因子和转化生长因子β1水平。

1.5 主要观察指标 ①皮肤间充质干细胞的表面标记物；②皮肤间充质干细胞的成脂、成骨、成软骨分化能力；③皮肤间充质干细胞生长增殖能力；④皮肤间充质干细胞培养上清液中表皮生长因子和转化生长因子β1水平。

1.6 统计学分析实验数据符合正态分布，采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料以x(_)±s表示，组间比较釆用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

银屑病俗称牛皮癣，是一种常见的慢性、炎症性皮肤病，病程较长且易复发。国内多个流行病统计发病率为2%-3%，总患病率约为0.59%，高发年龄段为20-30岁和40-50岁，40岁之前占发病者的67.6% ^[13-17]。调查发现，世界不同人群银屑病患病率存在显著差异，欧洲最高，且白人发病高于亚洲人种^[18-24]。银屑病的病因仍未完全研究清楚，可能是多种因素相互作用导致该病的发生。

间充质干细胞具有多向分化潜能，源于中胚层，且可存在于多个脏器和组织，不仅可从脂肪、骨髓、肌肉、脐血等中获取，还可从皮肤组织中获得^[25-29]。皮肤间充质干细胞是皮肤微循环的重要组成成分，其参与重塑细胞外基质、协调细胞生长因子表达以及使细胞进行正常的有丝分裂与迁移，可以对皮肤细胞的发育、再生起到维护作用^[30-34]。实验结合临床银屑病患者破损皮肤常表现有表皮异常增殖、早期真皮改变等病理症状，推测银屑病患者皮肤异常可能与其皮损微环境的改变有关。

实验在体外利用胰蛋白酶分离、培养30例银屑病患者与20例正常健康人的皮肤间充质干细胞，流式细胞仪免疫表型检测结果显示：表面抗原CD29、CD90、CD44、CD73及CD105呈高表达，CD45、CD34、及HLA-DR呈低表达。细胞多向分化潜能测定结果表明：成脂、成骨、成软骨诱导后皮肤间充质干细胞可向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化。银屑病组皮肤间充质干细胞增殖速度明显快于对照组，但最终两组细胞数量趋于一致，并没有明显差异。银屑病组皮肤间充质干细胞分泌表皮生长因子和转化生长因子β1水平与患者病情严重程度无相关性(P > 0.05)。与对照组比，银屑病组细胞培养上清液中表皮生长因子水平明显偏高，差异有显著性意义(P < 0.01)，而转化生长因子β1水平明显偏低，差异有显著性意义(P < 0.01)。结果发现银屑病患者皮肤间充质干细胞生物学活性存在异常，细胞因子分泌水平异常，这提示其可能参与银屑病的发病，为后期银屑病的治疗提供理论依据。