洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.010

摘要/Abstract

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文题释义：
洛伐他汀：属于他汀类药物，是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂，主要用于临床治疗高脂血症，也是临床研究时间较长、获得研究资料较多、治疗效果确切的他汀类药物之一。近年来，越来越多的研究报道了洛伐他汀对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、促进凋亡、诱导分化等作用，而对正常细胞的毒副作用较小。
CD133：是一种相对分子质量为120 000的跨膜蛋白，是神经干细胞的特异标志物。目前肿瘤干细胞的表面标记缺乏较高的特异性，CD133能否作为胶质瘤干细胞的特异标志物还存在争议，但其仍然在胶质瘤干细胞分选中被广泛应用。实验以CD133为干细胞标记物，使用流式细胞仪分选技术从人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87中分选出CD133⁺胶质瘤干细胞，分选前后CD133⁺细胞的比例相差显著，分选后CD133⁺细胞的比例达到85%。

摘要
背景：越来越多的研究报道洛伐他汀对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、促进凋亡、诱导分化等作用，而对正常细胞的毒副作用较小，但其对胶质瘤干细胞的影响尚未见报道。
目的：探讨洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响。
方法：利用流式细胞仪分选技术从人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87中分选出胶质瘤干细胞；MTT法检测洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖的影响；流式细胞仪检测洛伐他汀对胶质瘤干细胞凋亡的影响；Western blot检测洛伐他汀对胶质瘤细胞Ki67、Bax及Bcl-2表达的影响。
结果与结论：①利用流式细胞仪分选技术成功从人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87中分选出CD133⁺胶质瘤干细胞，分选后CD133阳性细胞比率为85%；②洛伐他汀能够浓度(5，10，20 μmol/L)和时间(24，48，72，96 h)依赖性地抑制胶质瘤干细胞的增殖；③10 μmol/L洛伐他汀干预48 h能够诱导胶质瘤干细胞的凋亡；④洛伐他汀能够浓度(5，10，20 μmol/L)依赖性地抑制胶质瘤细胞中Ki67的表达；⑤10 μmol/L洛伐他汀能够提高胶质瘤细胞中Bax的表达，同时降低Bcl-2的表达；⑥Ki67，Bax，Bcl-2蛋白表达的变化进一步验证了洛伐他汀能够浓度和时间依赖性地抑制胶质瘤干细胞的增殖，诱导胶质瘤干细胞的凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0002-7168-6017(闻公灵)

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胶质瘤干细胞, 他汀类药物, 洛伐他汀, CD133⁺胶质瘤细胞, 增殖, 凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Increasing evidence has shown that lovastatin with less toxicity to normal cells has crucial effects on proliferation, apoptosis and differentiation of various cancer cells. However, its roles in glioma stem cells remain unclear.
OBJECTIVE: To explore the effect of lovastatin on proliferation and apoptosis of glioma stem cells.
METHODS: Flow cytometric sorting was used to separate glioma stem cells from human glioblastoma cell line U87. Effects of lovastatin on the proliferation and apoptosis of glioma stem cells were determined by MTT and flow cytometry, respectively. Furthermore, expression levels of Ki67, Bax and Bcl-2 in glioma stem cells treated with lovastatin were detected using western blot analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The CD133-positive glioma stem cells were sorted from human glioblastoma cell line U87 with a positive percentage of 85%. MTT assay showed that lovastatin inhibited the proliferation of glioma stem cells in dose (5, 10, 20 μmol/L)- and time (24, 48, 72, 96 hours)-dependent manners. Flow cytometry analysis showed that 10 μmol/L lovastatin (48 hours) induced apoptosis in glioma stem cells. In addition, the expression level of Ki67 was decreased by lovastatin treatment in a dose-dependent manner, and the Bcl-2 and Bax expression levels were reduced and increased by 10 μmol/L lovastatin treatment, respectively. In conclusion, lovastatin can inhibit cell proliferation and induce apoptosis of glioma stem cells, and lovastatin may be a potential drug for treatment of brain tumors.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lovastatin, Glioma, Neoplastic Stem Cells, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

闻公灵，温昌明，王彦平，康梅娟，周静，张保朝. 洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(32): 4778-4784.

Wen Gong-ling, Wen Chang-ming, Wang Yan-ping, Kang Mei-juan, Zhou Jing, Zhang Bao-chao. Effect of lovastatin on proliferation and apoptosis of glioma stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(32): 4778-4784.

图/表（结果） 1

2.1 U87胶质瘤干细胞分选结果 流式细胞仪分选之前，人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87中CD133阳性细胞比率为0.5%，分选后CD133阳性细胞比率为85%，分选前后差异有非常显著性意义，胶质瘤干细胞纯度较高，可以进行后续实验。

2.2 洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖的影响 图1结果显示，不同浓度洛伐他汀(5，10，20 μmol/L)处理胶质瘤干细胞48 h后，各组细胞的增殖率分别为对照组的85%(P < 0.05)、76%(P < 0.05)及56%(P < 0.05)，说明5-20 μmol/L洛伐他汀均能显著抑制胶质瘤干细胞的增殖，且药物浓度越高，细胞的增殖率越低。图2结果显示，10 μmol/L洛伐他汀处理胶质瘤干细胞24，48，72，96 h后细胞的增殖率分别为86%(P < 0.05)、78%(P < 0.05)、65%(P < 0.05)及45%(P < 0.05)，说明随着时间的延长洛伐他汀对胶质瘤干细胞的抑制性越强，细胞的增殖率越低。

实验又进一步使用Western blot检测不同浓度洛伐他汀(5，10，20 μmol/L)处理胶质瘤干细胞48 h后Ki67的表达情况，由图3结果可知，随着药物浓度的升高，Ki67的表达量逐渐降低，处理组的蛋白相对表达量分别为对照组的76%(P < 0.05)、53%(P < 0.05)及31%(P < 0.05)，说明5-10 μmol/L洛伐他汀能够剂量依赖性抑制胶质瘤细胞中Ki67的表达。Ki67是细胞增殖的标记性蛋白，Ki67蛋白表达水平的降低，意味着细胞增殖速度的降低，洛伐他汀能够抑制Ki67的表达，进一步验证了其能够抑制胶质瘤干细胞的增殖^[20-21]。

2.3 洛伐他汀对胶质瘤干细胞凋亡的影响 图4结果显示，对照组即未使用洛伐他汀处理的细胞凋亡率为3.36%，10 μmol/L洛伐他汀处理48 h后，细胞凋亡率为31.62%，与对照组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)。

实验进一步检测10 μmol/L洛伐他汀处理胶质瘤干细胞48 h后细胞中凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2的表达情况，图5结果显示，10 μmol/L洛伐他汀能够提高Bax的表达(P < 0.05)，同时降低Bcl-2的表达(P < 0.05)。在细胞凋亡过程中，Bax属于促凋亡蛋白，Bcl-2属于抗凋亡蛋白，Bax的增加及Bcl-2的减少说明洛伐他汀促进了胶质瘤干细胞的凋亡，进一步验证了流式细胞仪的检测结果，即洛伐他汀能够诱导胶质瘤干细胞的凋亡^[22-25]。

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引言

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，以恶性居多^[1]。恶性胶质瘤侵袭性强、致死率高，严重威胁着人类的健康^[2]。目前对胶质瘤的治疗手段主要包括手术、化疗和放疗以及基因治疗、免疫治疗等，其中手术切除是治疗胶质瘤最基本、最直接的方式^[3]。即使施以手术、放化疗及新的治疗方法，神经系统恶性胶质瘤患者的生存期仅有1年左右，多数患者在治疗后正常的脑组织还会受到继发性损害^[4]。

洛伐他汀(Lovastatin)属于他汀类药物，是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制剂，主要用于临床治疗高脂血症，也是临床研究时间较长、获得研究资料较多、治疗效果确切的他汀类药物之一^[5-6]。近年来，越来越多的研究报道了洛伐他汀对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、促进凋亡、诱导分化等作用，而对正常细胞的毒副作用较小^[7-10]。国风等^[7]研究显示，洛伐他汀能够抑制NB4白血病细胞的增殖，诱导NB4细胞的凋亡，使细胞周期阻滞在G₁/S期，显著抑制Bcl-2的表达，但洛伐他汀不影响NB4细胞的分化。目前，洛伐他汀作用于肿瘤细胞的详细分子机制还不是很清楚。

肿瘤干细胞学说认为，肿瘤是由一小群具有无限增殖潜能及自我更新能力的干细胞样细胞及由其产生的分化程度不均一的细胞团组成，这群干细胞样细胞在肿瘤组织中少数存在，可以驱使肿瘤形成和生长，在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用，被称之为肿瘤干细胞，而肿瘤中的大多数细胞是这一小群细胞的分化细胞，失去了自我更新能力而具有一定分化特征的非干细胞样细胞，该学说的提出，对人们了解肿瘤的本质及寻找有效治疗肿瘤的药物有重大意义^[11-13]。

Ignatova等^[14]在2002年报道了胶质瘤干细胞的存在，随后越来越多的研究证实了在实体胶质瘤组织和胶质瘤细胞中存在胶质瘤干细胞。虽然胶质瘤干细胞在胶质瘤中的比例较低，但在肿瘤的发生、发展、复发、转移及抗药性中起着关键的作用^[15]，并不断有研究人员从原代培养的胶质瘤细胞或者稳定培养的恶性胶质瘤细胞系中分离出了胶质瘤干细胞^[16-17]。目前，人们对胶质瘤干细胞的分离培养方法主要有两种，一种是利用流式细胞仪或免疫磁珠对CD133阳性或ABCG2阳性等细胞进行富集，得到含量较高的胶质瘤干细胞。另一种方法是使用无血清培养基培养，通过非胶质瘤干细胞凋亡而干细胞成球的特性筛选出胶质瘤干细胞^[17-19]。

该研究首先使用流式细胞仪分选技术从人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87中分选出CD133⁺胶质瘤干细胞，采用MTT法检测不同浓度洛伐他汀干预不同时间对胶质瘤干细胞增殖的影响，流式细胞仪检测洛伐他汀对胶质瘤干细胞凋亡的影响，Western blot检测洛伐他汀处理前后胶质瘤干细胞中Ki67、Bax及Bcl-2的表达情况。

材料方法

1.1 设计 细胞分子生物学体外实验。

1.2 时间及地点 2014年3月至2015年1月在南阳市中心医院完成。

1.3 材料 人胶质瘤细胞系U87购自中国科学院上海细胞生物学研究所。洛伐他汀购自Sigma公司，溶于二甲基亚砜中配成100 μmol/L母液，-20 ℃的冰箱保存备用，使用时用DMEM/F12无血清培养基(含B27、碱性成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子)配成工作浓度(分别为5，10，20 μmol/L)。

1.4 实验方法

1.4.1 U87胶质瘤细胞的培养及传代 人胶质瘤细胞系U87接种于含体积分数为10%小牛血清的DMEM完全培养基，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂，相对湿度95%的培养箱中培养。每2 d或3 d传代1次，根据细胞密度1︰3-1︰5进行传代。首先倒去原培养液，加入PBS清洗，弃废液后加入1 mL胰蛋白酶进行消化，再次使用PBS清洗，离心收集细胞，加入含体积分数为10%小牛血清的DMEM完全培养基培养。

1.4.2 U87胶质瘤干细胞的分选 取第3代U87胶质瘤细胞加入胰蛋白酶消化，清洗离心后调整细胞密度为1×10⁷于80 μL HBSS缓冲液中，加入20 μL FcR阻断剂及10 μL CD133/2(293C3)流式分选抗体，混匀后避光冰浴10 min，HBSS缓冲液清洗细胞并离心，最后细胞溶于1 mL HBSS缓冲液中，进行流式细胞仪分选。

1.4.3 U87胶质瘤干细胞的鉴定 将分选后的细胞继续标记CD133/1(AC133)-PE流式抗体，流式细胞仪检测分选后U87胶质瘤干细胞的纯度，操作过程与分选过程相似。

1.4.4 U87胶质瘤干细胞的培养 U87胶质瘤干细胞使用无血清培养基进行培养，无血清培养基为DMEM/ F12(20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，20 μg/L表皮细胞生长因子，B27 100 μL)，置于37 ℃体积分数5% CO₂，相对湿度95%的培养箱中培养，2 d或3 d换液1次。

1.4.5 MTT法检测细胞增殖 使用DMEM/F12无血清培养基(含B27、碱性成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子)悬浮细胞，以5×10⁵/孔细胞密度接种于96孔板中，每孔体积100 μL，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂的恒温培养箱中培养约24 h，待细胞贴壁。实验组每孔加入不同浓度的洛伐他汀(5，10，20 μmol/L)，对照组加入等体积的DMEM/F12无血清培养基，并设置5个重复孔，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养24，48，72，96 h，检测时每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，37 ℃避光反应4 h，每孔加入100 μL二甲基亚砜，振荡10 min，用全自动酶标仪读取每孔在490 nm处的吸光度值，计算细胞增殖率。

细胞增殖率=(实验组吸光度值-空白调零组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白调零组吸光度值)

1.4.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 以DMEM/F12无血清培养基(含B27、碱性成纤维细胞生长因子及表皮细胞生长因子)调整细胞浓度为2×10⁸ L^-¹，每孔1 mL接种于6孔低黏附板中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱培养24 h后，实验组每孔加入10 μmol/L洛伐他汀，并设置5个重复孔，对照组加入等体积的DMEM/F12无血清培养基，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养48 h，PBS清洗，加入Binding Buffer使细胞重悬，再加入Annexin V-FITC和Propidium Iodide各5 μL混匀，避光反应20 min，上流式细胞仪进行凋亡检测。

1.4.7 Western blot检测蛋白表达 将洛伐他汀处理后的细胞用预冷的PBS清洗2次，弃去废液后加入80 μL RIPA裂解液，冰上裂解5 min，转移至EP管中，离心去上清。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。取50 μg定量后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，按照12%分离胶和5%浓缩胶配置SDS-PAGE。将电泳分离后蛋白样品转入PVDF膜，一抗室温孵育2 h，清洗后，再用二抗孵育1 h，ECL显色。

1.5 主要观察指标 ①U87胶质瘤干细胞分选结果；②洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响；③洛伐他汀对胶质瘤干细胞中Ki67、Bax及Bcl-2表达的影响。

1.6 统计学分析 所有数据分析使用SPSS 13.0统计学软件，计量数据以x(_)±s表示，组间差异比较采用Student’s t 检验或单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

恶性胶质瘤是中枢神经常见的原发性肿瘤，在所有颅内肿瘤中占50%左右。胶质瘤干细胞是胶质瘤组织或细胞中一小部分具有自我更新、无限增殖及分化成瘤等特性的细胞^[26-27]，是胶质瘤细胞形成的成瘤细胞，由于胶质瘤干细胞的干性特征使其被认为是胶质瘤发生、发展、转移及复发的根源^[28-29]。因此，关于胶质瘤干细胞理论和机制研究及寻找新的有效针对胶质瘤干细胞的药物对治疗神经胶质瘤及脑瘤具有重要意义^[30]。

CD133是一种相对分子质量为120 000的跨膜蛋白，是神经干细胞的特异标志物^[31-32]。目前肿瘤干细胞的表面标记缺乏较高的特异性，CD133能否作为胶质瘤干细胞的特异标志物还存在争议，但其仍然在胶质瘤干细胞分选中被广泛应用^[27^，^33]。实验以CD133为干细胞标记物，使用流式细胞仪分选技术从人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87中分选出CD133⁺胶质瘤干细胞，分选前后CD133⁺细胞的比例相差显著，分选后CD133⁺细胞的比例达到85%。该研究以CD133⁺胶质瘤干细胞为研究对象考察了洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响。

洛伐他汀已被报道对多种肿瘤细胞具有抑制作用^[34-37]。周永等^[34]研究显示，4-16 μmol/L洛伐他汀处理人乳腺癌MCF-7细胞24-72 h后，细胞的增殖明显受到抑制，抑制率达到75.8%，且抑制有时间和剂量效应，洛伐他汀还能使MCF-7细胞停滞在G₀/G₁期，洛伐他汀处理72 h使细胞周期停滞的细胞数达到80%左右，另外洛伐他汀还能促进MCF-7细胞的分化和恢复细胞间隙连接通讯。Marcelli等^[35]研究发现，30 μmol/L洛伐他汀处理前列腺癌LNCaP细胞48 h可以诱导细胞凋亡。有研究报道，洛伐他汀可以联合5-氟尿嘧啶或顺铂作为化疗药物增加结肠癌细胞的化疗敏感性，诱导细胞凋亡^[36]。还有研究报道，洛伐他汀可以抑制胆管癌QBC939细胞的增殖、迁移并诱导细胞凋亡，洛伐他汀与血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(KRN633)联合应用具有协同抑制效应^[37]。他汀类药物对胶质瘤细胞的影响也有报道，在体外瑞舒伐他汀可以显著抑制胶质瘤U251细胞增殖并诱导细胞凋亡^[38]。

实验首先使用不同浓度洛伐他汀处理胶质瘤干细胞，结果发现洛伐他汀能够剂量和时间依赖性地抑制胶质瘤干细胞的增殖。另外，细胞凋亡的检测结果显示洛伐他汀可以显著诱导胶质瘤干细胞的凋亡。洛伐他汀还可以显著抑制Ki67蛋白的表达，提高Bax的表达，降低Bcl-2的表达，这些蛋白表达的变化进一步验证了洛伐他汀对胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响。胶质瘤干细胞在胶质瘤组织中的数量较少，但大量研究发现其在肿瘤发生、发展、复发、转移及抗药性中起着关键的作用^[15]。越来越多的研究者开始针对干细胞展开对胶质瘤的靶向治疗，如microRNA对胶质瘤及其干细胞的靶向作用^[39]，放疗对胶质瘤的影响^[40]，胞内信号通路对胶质瘤干细胞的抑制作用等^[41]。该研究结果为抑制胶质瘤干细胞的生长提供了理论支持，也为胶质瘤干细胞的治疗提供了依据。

综上所述，利用流式细胞仪分选技术成功地从人类恶性胶质母细胞瘤细胞系U87中分选出CD133⁺胶质瘤干细胞，比例达到85%，洛伐他汀能够浓度和时间依赖性地抑制胶质瘤干细胞的增殖，诱导胶质瘤干细胞的凋亡。但是，目前关于洛伐他汀对胶质瘤干细胞抑制作用的机制还未知晓，仍需大量的研究工作。