改性牙本质粘接剂对抗变形链球菌的性能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.015

中国组织工程研究

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改性牙本质粘接剂对抗变形链球菌的性能

刘梅天，聂红兵，张金婷，周海静

西北民族大学口腔医学院，甘肃省兰州市 730030

收稿日期:2012-09-04 修回日期:2012-10-24 出版日期:2013-05-21 发布日期:2013-05-21
通讯作者: 聂红兵，教授，西北民族大学口腔医学院，甘肃省兰州市 730030
作者简介:刘梅天★，女，1974年生，甘肃省白银市人，汉族， 2008年兰州大学口腔医学院毕业，硕士，副教授，主要从事口腔修复与材料学研究。 liumt2009@163.com
基金资助:
甘肃省自然科学基金资助项目(096RJ ZA108)

Antibacterial activities of modified dentin adhesive agent against Streptococcus mutans

Liu Mei-tian, Nie Hong-bing, Zhang Jin-ting, Zhou Hai-jing

Stomatological School of Northwest University for Nationality, Lanzhou 730000, Gansu Province, China

Received:2012-09-04 Revised:2012-10-24 Online:2013-05-21 Published:2013-05-21
Contact: Nie Hong-bing, Professor, Stomatological School of Northwest University for Nationality, Lanzhou 730000, Gansu Province, China
About author:Liu Mei-tian★, Master, Associate professor, Stomatological School of Northwest University for Nationality, Lanzhou 730000, Gansu Province, China liumt2009@163.com
Supported by:
the Natural Science Foundation of Gansu Province, No. 096RJ ZA108

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究证实粘接修复技术治疗龋病过程中，龋洞预备后残留的细菌可在牙体组织与修复体之间继续生存较长时间，诱发继发龋或牙髓的慢性炎症。
目的：评价经甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡单体改性树脂基粘接剂对变形链球菌的抗菌性能。
方法：制备含质量分数0(阴性对照)，1%，2%，3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体的实验性GLUMA Comfort Bond粘接剂样本，以Clearfil Protect bond粘接剂为阳性对照；分别涂布在复合树脂试件表面并固化，在变形链球菌液体培养基中进行培养，培养18 h后检测菌液的A值、pH值。
结果与结论：GLUMA Comfort Bond粘接剂对变形链球菌生长及产酸能力无明显抑制作用，Clearfil Protect bond粘接剂对变形链球菌生长及产酸能力有明显抑制作用。含1%，2%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体的GLUMA Comfort Bond粘接剂对变形链球菌生长及产酸能力的抑制作用与阴性对照组相当(P > 0.05)，含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体的GLUMA Comfort Bond粘接剂固化后对变形链球菌生长及产酸能力的抑制作用与阳性对照组相当(P > 0.05)。表明添加了3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体的实验性抗菌粘接试件具有良好的抗菌性能。

关键词: 生物材料, 组织工程口腔材料, 抗菌活性, 甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡, 复合树脂, 变形链球菌, 单体, 粘接剂, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: During the treatment of dental caries with bonding repair technique, residual bacteria following the preparation of cavities can survive a long time between the tooth structure and dental prosthesis, which can cause secondary caries or chronic inflammation of the pulp.
OBJECTIVE: To evaluate the antibacterial effects of resin-based adhesive modified with the antibacterial monomer 12-methacryloyloxydodecylpyridinium bromide against Streptococcus mutans.
METHODS: Experimental antibacterial adhesive specimens (GLUMA Comfort Bond) covered with different concentrations of antibacterial monomers (0 as negative control, 1%, 2%, 3%, 4% 12-methacryloyloxydodecylpyridinium bromide) were prepared, and their antibacterial effects were investigated by the measurement of bacteria liquid absorbance, pH value which contained experimental antibacterial adhesive specimens after 18-hour culture. Clearfil Protect Bond was used as positive control.
RESULTS AND CONCLUSION: There was statistical difference in antibacterial effects between the negative control and positive control. The experimental adhesive specimens incorporated with 1% and 2% monomers showed antibacterial activities against Streptococcus mutans similar as the negative control (P > 0.05). There was no statistical difference in antibacterial effects between the positive control and experimental adhesive specimens incorporated with 3% and 4% monomers (P > 0.05). These findings indicate that experimental adhesive specimens containing 3% and 4% 12-methacryloyloxydodecylpyridinium bromide monomers showed better antibacterial activities.

Key words: biomaterials, tissue-engineered oral materials, antibacterial activity, 12-methacryloyloxydodecylpyridinium bromide, composite resin, Streptococcus mutans, monomer, adhesive, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

刘梅天，聂红兵，张金婷，周海静. 改性牙本质粘接剂对抗变形链球菌的性能[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.015.

Liu Mei-tian, Nie Hong-bing, Zhang Jin-ting, Zhou Hai-jing. Antibacterial activities of modified dentin adhesive agent against Streptococcus mutans[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.21.015.

图/表（结果） 2

2.1 甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡改性抗菌树脂粘接剂对变形链球菌生长能力的抑制作用见表1。

A 值比较：阴性对照组与阳性对照组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；含1%，2%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组之间，含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组之间比较差别均无显著性意义；含1%，2%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组与含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组之间比较差异有显著性意义(P均<0.05)，含1%，2%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组与阴性对照组之间比较差异无显著性意义，与阳性对照组之间比较差别有显著性意义(P < 0.05)，含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组与阴性对照组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，与阳性对照组之间比较差异无显著性意义。

实验结果表明，随着粘接剂中甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡单体浓度的增高，对变形链球菌生长的抑制作用增强，甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡改性抗菌剂中抗菌剂含量等于3%，4%时，对变形链球菌生长的抑制作用与阴性对照组之间差异有显著性意义，与阳性对照组之间的差异无显著性意义。

2.2 甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡改性抗菌树脂粘接剂对变形链球菌产酸能力的抑制作用见表2。

pH值比较：阴性对照组与阳性对照组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；含1%，2%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组之间，含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组之间比较差异均无显著性意义；含1%，2%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组与含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；含1%，2%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组与阴性对照组之间比较差异无显著性意义，与阳性对照组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)；含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体实验组与阴性对照组之间比较差异有显著性意义(P < 0.05)，与阳性对照组之间比较差异无显著性意义。

实验结果表明，随着粘接剂中甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡浓度的增高，对变形链球菌产酸能力的抑制作用增强，改性抗菌树脂粘接剂中甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡含量为3%，4%时，对变形链球菌产酸能力的抑制作用与阴性对照组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡含量为1%，2%时，对变形链球菌产酸能力的抑制作用与阴性对照组比较差异无显著性意义。

参考文献

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引言

由于龋病充填修复治疗后继发龋的发病率高^[1-2]，大部研究集中在直接充填材料的治疗效果方面，如释氟充填材料的再矿化作用就是一个典型代表，但是抗菌效能是充填材料的另一个重要特性，因为灭活致龋菌是根除龋病病因的一个直接手段。如果用具有抗菌性能的粘接系统修复龋洞，粘接界面残留的细菌会被杀死，因此，研制具有抗菌性能的粘接系统应该是提高龋病修复治疗质量的有效手段。

甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡，是一种由抗菌物质季铵十二烷基吡啶与可聚合的甲基丙烯酰基团合成的抗菌黏结单体，结构式见图1所示^[3]。

此季铵化合物产生抗菌效果的机制被认为是阳离子与细菌细胞壁成分的结合破坏了细胞膜，使细胞质成分泄漏，固化前液态的甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡具有很强的杀菌活性，它是惟一一种经证实自身具有抗菌活性的单体[4-8]。张金婷等^[4]进行体外实验研究甘草、黄芪浸出液对口腔常见致龋菌的抑制效果，并与国外致龋菌抑菌产品(MI)进行比较。实验选用陇产甘草、黄芪为原料，以变形链球菌、乳酸杆菌为实验菌株，利用其选择性培养基进行液体培养，在培养基中添加不等量的药物，测培养24 h后菌液的A值、pH值，用SPSS13.0对数据进行统计分析。结果显示，甘草、黄芪浸出液分别对变形链球菌、乳酸杆菌的生长、产酸均有抑制效果，与国外同类抑菌产品相比无显著性差异；说明甘草、黄芪浸出液对口腔主要致龋菌有抑制作用。大量实验研究证实添加了甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡的复合树脂、自酸蚀处理剂及粘接剂固化前后都具有抗菌活性。材料固化后，甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡与其他单体发生聚合，抗菌基团则通过共价键固定于聚合体网络之中，见图2所示，它不会从材料中释出，只是接触性抑制材料表面的细菌，因而可能长效抗菌^[9-12]。

甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡是20世纪90年代日本可乐丽公司(Kuraray Co. Ltd.)发明的专利产品，此产品购买难度大，成本高。Clearfil Protect bond是目前惟一一种上市的、含甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡的抗菌自酸蚀粘接系统，甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体的含量为5%，大量实验已经证实其对口腔常见致龋菌的抑制作用[13-16]。常用作树脂基粘接材料基质的单体双酚A双甲基丙烯酸缩水甘油酯、稀释单体的甲基丙烯酸羟乙酯等均无抗菌活性。所以，实验将含甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡单体的Clearfil Protect bond添加入商品树脂基粘接剂GLUMA Comfort Bond中后形成实验性抗菌粘接剂，检测固化后粘接剂对主要致龋菌变形链球菌生长能力和产酸能力的抑制作用，目的是能研制一种国内能普遍应用的抗菌树脂粘接剂。

材料方法

设计：验证型实验。
时间及地点：实验于2011年10月至2012年2月在西北民族大学口腔重点实验室完成。
材料：甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体( Kuraray, Japan)。
Clearfil Protect bond：购自Kuraray, Japan，是目前惟一一种上市的含甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体的自酸蚀粘接系统，甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体的含量为5%。
GLUMA Comfort Bond：格鲁玛通用型粘接剂(贺利氏古莎齿科有限公司) ，一种光固化单组分牙本质牙釉质通用粘结剂，使用安全方便；采用独特的4-Meta黏结增强剂，能与自然牙体组织中的钙离子形成化学键，显著增强黏结力，也能与贵金属合金或银汞形成化学结合。
甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡单体改性牙本质粘接剂对变形链球菌抗菌性能实验的主要仪器：
Main instruments:

卡瑞斯玛复合树脂：贺利氏古莎齿科有限公司，产品标准：GB11749-89，《牙科复合树脂充填材料》；产品性能结构及组成：该产品为光固化补牙树脂，应用德国贺利氏古莎公司生产的卡瑞斯玛树脂，进行分包装。
菌株：实验菌株为变形链球菌(Mutans Streptococci, MS)的临床分离菌株，由西北民族大学口腔国家民委重点实验室提供，细菌培养基采用改良轻唾培养基。将复苏48 h后的菌株接种于改良轻唾培养基中，在含体积分数80%N2、20%CO2、37 ℃条件下培养18 h，涂片检查为纯培养后，用Vitek细菌比浊仪调整菌悬液浓度为1.0×108 CFU/mL^[17]，备用。
实验方法：
粘接剂的改性：选择GLUMA Comfort Bond粘接剂作为抗菌改性的对象，并且作为阴性对照材料。将Clearfil Protect bond加入到GLUMA Comfort Bond粘接剂中，制备含甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌剂分别为1%，2%，3%，4%的改良抗菌粘接剂作为实验组，以Clearfil Protect bond抗菌型自酸蚀粘接系统为阳性对照组。
抗菌粘接剂试件制备：利用96孔细胞培养板的板盖作为模具，见图3，制备直径8 mm的复合树脂试件，将6组粘接剂分别涂在圆形树脂试件的表面，覆盖聚酯薄膜后光照固化20 s。固化后的试件置于无菌蒸馏水内，室温振荡2 h以洗脱未聚合的树脂单体成分。环氧乙烷熏蒸消毒，分装备用^[18]。

改良抗菌粘接剂的抑菌实验：在10 mL离心管中加 8.0 mL的选择性培养液，取培养好的细菌菌液100 μL接种其中，将制备好的6组试样置入离心管中，37 ℃、 200 r/min 培养18 h，测A600值。A600是追踪液体培养物中微生物生长的标准方法。以未加菌液的培养液作为空白液，之后定量培养后的含菌培养液。A是optical density(吸光度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用A值表示，1A=log10(1/trans)，其中trans为检测物的透光率T值。光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。可以看出，A600指的是某种溶液在600 nm波长处的吸光度值。通过吸光度值的定义可以知道，吸光度值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率T值成反比，在数值上来说，它们之间是对数关系。A值高则菌浓度高，A值低则菌生长被抑制；1 500 r/min，10 min离心后测上清液的pH值。变形链球菌通过产酸致龋，抑制了细菌的产酸则抑制细菌的致龋性；因此，pH值高则抑制产酸能力强，pH值低则抑制产酸能力弱。每组5个试样，实验重复3次[18]。
主要观察指标：各组树脂基粘接剂试件的抗菌能力。
统计学分析：用SPSS 13.0软件进行统计学处理，各组总体均数用单因素方差分析比较( ANOVA)，分别比较抗菌粘接剂抑制口腔致龋菌变形链球菌的效果，采用t 检验，P=0.05。

讨论

复合树脂修复体有两个重要组成部分，充填树脂和充填前用于窝洞的粘接剂，这两部分在阻止细菌的危害方面发挥不同的作用，抗菌复合树脂阻止细菌和菌斑在修复体表面及其周围的聚集，抗菌粘接剂主要是对龋洞的消毒和杀灭通过微渗漏而浸入的细菌。

将甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡加入到复合树脂基质中，抗菌剂不能从材料中释放出来，只对接触到其表面的细菌起接触性抑菌作用，其抗菌作用达不到充填材料的周围，所以不会导致口腔内菌群失调并且具有长期抗菌效果，有报道显示在基质中加入含甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡的复合树脂在水中浸泡3个月以后，仍对变异链球菌的聚集有抑制作用，并且抗菌性强度不变[19]。不释放抗菌剂的抗菌复合树脂机械性能和固化行为均无变化[20-21]，在水中老化以后其性能也无变化。同一种复合树脂不加甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡与加入甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡后在水中浸泡3个月的拉伸强度、压缩强度、弹性模量相同^[22]。
自1995年就有研究将甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡加入到自酸蚀剂和粘接剂中，有研究报道了含甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡的自酸蚀剂和粘接剂对变异链球菌和乳酸杆菌的抑制作用^[23-24]。由于甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡具有强的杀菌作用，加入甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡后，粘接剂在甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡固化前后均可获得强的抑菌作用，此粘接剂用于窝洞充填时寄生在洞壁的细菌和通过微渗漏浸入的细菌都会被杀死，杀菌原理与含甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡复合树脂表面接触性抑菌原理一致。

实验中不含抗菌单体的粘接剂固化后对变形链球菌无明显的抗菌效果，而添加了含3%，4%甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡的实验性抗菌粘接试件对变形链球菌生长和产酸能力均具有良好的抑制作用。由于进口抗菌粘接材料价格昂贵，在临床中不易普遍使用。利用在高分子网络基质中固定有机抗菌基团研制的抗菌材料具有杀菌速度快、抗菌效能持久、分散均匀、色泽良好等优点，同时因其是将抗菌功能基团通过化学键的形式牢固键合在树脂基质中，因此克服了普通有机抗菌剂热稳定性差、容易分解溶出、分解产物有毒等缺点[24-26]。在普通粘接剂中加入甲基丙烯酰氧十二烷基溴吡抗菌单体制取抗菌粘接系统方法简便，但抗菌高分子单体的添加对粘接剂材料理化性能的影响，以及对树脂与牙体组织结合力的影响，细胞毒性反应和对牙髓组织的反应有待进一步研究[27-30]。

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Antibacterial activities of modified dentin adhesive agent against Streptococcus mutans

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