硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架修复周围神经损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.015

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
神经支架材料：①必须为神经恢复提供所需的三维空间，即要保证神经导管具有合适的强度、硬度和弹性，使神经具有再生的通道；②要保证其有理想的双层结构：外层提供必要的强度，为毛细血管和纤维组织长入提供营养的大孔结构；内层则可起到防止结缔组织长入而起屏障作用的紧密结构。
硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架：以硫酸肝素、胶原蛋白作为其原始材料，并且在相应的条件下经过液氮浸泡、冷冻及干燥后成型，获得的支架内部结构与原始神经内部结构具有相类似的孔道系统。支架在制备过程中，先从冰晶状态析出，经过冷冻、干燥后能够获得多孔内部结构材料，并且孔隙的大小能够根据冷冻的速率进行控制。

摘要
背景：神经组织工程支架材料必须具有轴向排列结构，才有利于再生轴突的定向生长，保证损伤神经获得有效修复和再生。
目的：观察硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架修复周围神经损伤的效果。
方法：制作硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架，观察支架内部结构，检测支架孔隙率；将许旺细胞接种于硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架上，观察细胞黏附性。切除32只大鼠左侧坐骨神经，随机分2组，每组16只，实验组于神经缺损处植入接种许旺细胞的硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架，对照组植入自体坐骨神经，植入后16周，进行有髓神经纤维直径、髓鞘厚度、有髓神经纤维密度及神经组织百分比及电生理检测。
结果与结论：①神经组织工程支架由沿着轴向平行排列的微管组成，微管直径为180 µm，支架孔隙率为91%；许旺细胞与硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架具有良好的生物相容性；②植入后16周，两组髓鞘厚度、有髓神经纤维密度、运动神经传导速度及潜伏期、感觉神经传导速度及潜伏期比较差异无显著性意义，实验组有髓神经纤维直径、神经组织百分比、运动神经与感觉神经波幅显著低于对照组(P < 0.05)；③结果表明：硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架可有效修复周围神经损伤，但效果弱于自体神经修复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-4163-0151(甘晓)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 神经组织工程支架, Ⅳ型胶原蛋白, 硫酸肝素, 周围神经损伤, 修复

Abstract:

BACKGROUND: Nerve tissue-engineered scaffolds must have axially aligned structures, that can promote oriented growth of new axons, to guarantee the effective repair and regeneration of damaged nerves.

OBJECTIVE: To investigate the effect of heparin sulfate/collagen nerve tissue-engineered scaffolds on peripheral nerve injury repair.

METHODS: Heparin sulfate/collagen nerve tissue-engineered scaffolds were prepared, and its internal structure and porosity was observed and measured. Then rat Schwann cells were seeded on the scaffolds to observe cell adhesion. Afterwards, 32 rats undergoing removal of left sciatic nerve were randomly divided into two groups (n=16 per group), and the rats were implanted by heparin sulfate/collagen nerve tissue-ergineered scaffolds as experimentd group, and the rats were implanted by autdogous sciatic nerve as control group. At 16 weeks after implantation, diameter, thickness of myelin sheath as well as density of myelinated nerve fiber, the percentage of neural tissue and electrophysiology was detected, respectively.

RESULTS AND CONCLUSION: The tissue-engineered scaffolds whose porosity was 91% were composed of microtubules arranging parallelly along the axial direction, and the microtubule diameter was 180 µm; the scaffolds had good biocompatibility with the Schwann cells. In addition, at 16 weeks after implantation, no significant differences were found in myelin sheath thickness, myelinated nerve fiber density, as well as conduction velocity and latency of motor and sensory nerves between two groups; compared with the control group, diameter of myelinated nerve fiber, percentage of neural tissue and amplitude of motor and sensory nerves in the experimental group were significantly decreased (P < 0.05). To conclude, the heparin sulfate/collagen nerve tissue-engineered scaffold can effectively repair peripheral nerve injury, but its effect is weaker than that of autologous nerve repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Tissue Scaffolds, Spinal Cord Injuries, Peripheral nerves, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

甘晓，南吴力. 硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架修复周围神经损伤[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(25): 3744-3749.

Gan Xiao, Nan Wu-li. Heparan sulfate/collagen nerve tissue-engineered scaffolds repair peripheral nerve injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(25): 3744-3749.

图/表（结果） 5

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引言

脊髓损伤和周围神经缺损发病率较高，且发生率呈现上升趋势^[1]，目前临床上尚未找到一种很好的解决方法。临床上对于周围神经缺损修复的治疗主要是促进损伤轴突再生，重建躯体和内脏功能，让大脑重新获得躯体的感觉信息。自体神经移植是修复周围神经缺损的金标准，在临床上取得了一定的疗效，但由于存在造成供区受损、来源有限及供受神经不匹配等一些列问题的制约，在一定程度上影响了其临床应用。近年来，组织工程及神经科学在临床上得到广泛应用，且效果理想^[2]。组织工程是应用生命科学和工程学的原理和技术，在正确认识哺乳动物正常及病理两种状态下组织结构与功能关系的基础上，研究开发用于修复、维护人体各组织或器官损伤后功能和形态的生物替代品^[3]。因此，当前研究能够替代脊髓损伤和周围神经缺损的神经移植组织工程材料成为热点话题，为临床上脊髓损伤和周围神经缺损修复提供了新的思路和方向。

理想的支架材料应与神经内部结构相类似，这将更加有利于神经的再生^[4-7]。这是由于神经的再生有着自身的特殊要求，由于神经轴突的生长不同于其他组织，必须沿着一定的方向生长，这样才能够满足修复再生的要求，从而最大限度地恢复肢体丧失的功能。传统的材料内部并没有规律性的孔隙，当置入机体后由于基质内缺乏一定的规律性孔道，阻碍了神经轴突的进一步生长。因此，选择作为神经组织工程修复材料的基体必须具有轴向排列结构，这样将更加有利于再生轴突的定向生长，保证损伤神经获得有效修复和再生。实验主要探讨新型神经组织工程支架的制备方法及其在周围神经损伤修复中的应用效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计观察性试验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至7月在南阳市中心医院创伤外科实验室完成。

1.3 材料

实验动物：六七周龄SD大鼠32只，雌雄随机，体质量0.16-0.40 kg，平均(0.20±0.01) kg，由郑州大学医学院动物实验中心提供，饲养严格遵守相关标准进行饲养，合格证号为SCXK(粤)2007-0010。将32只大鼠随机分为实验组与对照组，每组16只。对大鼠进行等条件喂养，实验中对大鼠的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》中相关规则^[8-9]。

1.4 实验方法

神经组织工程支架的制备：准确称取100 mgⅠ型胶原蛋白、15 mg Ⅳ型胶原蛋白及1 mg硫酸肝素，将上述材料混合于5 mL浓度为0.05 mol/L的醋酸溶液中，4 ℃下在搅拌器内2 000 r/min搅拌30 min，负压抽真空后，将其放置在4 ℃冰箱内过夜，获得凝胶状悬浊液。将硫酸肝素/胶原蛋白悬浊液注入到内径为3 mm、长为10 cm的硅胶管中，采用铅丝夹住密封两端，以2×10^-5 m/s的速度浸入到液氮中，然后将其放入到-80 ℃冰箱中(时间控制在30-60 min)中^[10-11]。将硅胶管冻体切成2.0 cm节段，冻干24 h，制成成型硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架。将获得的支架放置在紫外线发生器下进行消毒，让硫酸肝素与胶原蛋白充分融合，备用^[12]。

许旺细胞的分离、培养、纯化及鉴定：取实验组16只大鼠，在-20 ℃下进行低温麻醉，待麻醉生效后浸入碘酒、乙醇中进行消毒，取右侧坐骨神经、脊神经节，并将其剪成0.5 mm³的组织块，将其接种在6孔细胞培养板中，放置在含有胎牛血清的细胞中进行培养，待许旺细胞从组织块中生长出并贴壁后进行纯化，进行S-100细胞免疫组织化学染色^[13-14]。将对数生长期的许旺细胞制作成浓度为2×10⁹ L^-1细胞悬液，采用负压抽吸方法接种于长10 mm的硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架中^[15-16]。

周围神经缺损动物模型建立及分组处理：入选32只SD大鼠禁食12 h，术前肌肉注射0.5 g阿托品，采用3.6%水合氯醛进行全身麻醉，待麻醉生效后进行消毒、铺巾，充分暴露左侧坐骨神经，切除10 mm周围神经，建立周围神经缺损模型，实验组植入接种许旺细胞的硫酸肝素/胶原蛋白神经组织工程支架，对照组植入自体神经组织，创面缝合后采用油纱、无菌纱布双层敷料覆盖创面、包扎，根据大鼠情况给予抗生素预防感染，待大鼠清醒后，送回笼中饲养^[17-18]。

1.5 主要观察指标

神经组织工程支架结构：观察神经组织工程支架外观、内部结构等。将材料采用刀片切成横断面、纵截面，在物理显微镜下观察材料的表面状况、内部结构。

神经组织工程支架材料孔隙率的测定：采用液体替代法测定材料的孔隙率。将已知质量m₁、体积V的支架样品浸润到可密闭的容器中，采用负压抽吸方法排除材料孔隙内的气体，直到无气泡从材料中溢出位置，让材料的孔隙内充满水。此时，将材料取出，采用滤纸将表面的液体吸干，再次称质量，2次质量差即为孔隙体积，从而算出材料孔隙率。

神经缺损修复实验：植入后16周，观察两组有髓神经纤维直径、髓鞘厚度、有髓神经纤维密度及神经组织百分比及电生理检测结果。

神经组织工程支架与细胞黏附：将神经组织工程支架放置在24孔板中，支架上接种1×10⁶的大鼠原代许旺细胞，并加入培养液，放入孵育箱中进行培养，在电镜下观察细胞与支架的黏附程度。

1.6 统计学分析采用SPSS 18.0软件对采集到的数据进行分析，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较。P < 0.05提示存在统计学差异。

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讨论

脊髓损伤及周围神经缺损是临床上常见的创伤并发症，发病率较高，发病后主要以偏瘫、神经功能损伤等为主，影响患者的正常生活和工作^[19]。目前，临床上对于脊髓损伤及周围神经缺损尚缺乏理想的治疗方法，常规方法虽然能够改善患者症状，但疗效欠佳，患者神经功能恢复预后较差^[20-21]。近年来，组织工程技术构建在脊髓损伤及周围神经缺损中广为应用，由于具有良好的生物相容性，使得该技术成为治疗脊髓损伤及周围神经缺损的研究重点。相关研究结果显示，周围神经导管上负载生长因子，能够有效提高患者神经缺损的修复效果^[22-23]。当前，临床上研究较多的生物支架材料更多的以冷冻干燥的方法制备，该法能够获得高定向性的大孔聚乳酸支架材料，制备的材料能够有效促进周围和中枢神经轴突的再生，并且能够帮助其恢复受损的神经组织^[24-25]。但这种材料在降解时容易产生酸性产物，并不利于神经的再生^[26-27]。由此实验首次采用硫酸肝素复合胶原蛋白制备神经组织工程支架，并将其运用于大鼠坐骨神经缺损中。神经组织工程支架在制备过程中以硫酸肝素、胶原蛋白作为其原始材料，并且在相应的条件下经过液氮浸泡、冷冻及干燥后成型，获得的支架内部结构与原始神经内部结构具有相类似的孔道系统^[28-29]。支架在制备过程中，先从冰晶状态析出，经过冷冻、干燥后能够获得多孔内部结构材料，并且孔隙的大小能够根据冷冻的速率进行控制^[30-32]。神经轴突生长和其他组织生长不同，它的生长必须沿着一定的方向定向生长，才能够保证缺损神经组织的修复再生^[33-34]。由于传统修复材料内部结构缺乏定向性，在一定程度上阻碍了神经轴突的继续生长，不能保证所有的神经均能够有效、规律的引导轴突定向生长。由此看出，仿生神经组织工程支架是理想的脊髓损伤及周围神经缺损修复材料^[35]。

硫酸肝素是一种蛋白聚糖，存在细胞表面和细胞间质中，属于细胞外基质比较重要的部分。高度仿生神经组织工程支架一硫酸肝素作为原材料能够快速、可逆的与碱性成纤维细胞生长因子相互结合，从而能够形成相对比较稳定的储存池。根据研究结果显示，碱性成纤维细胞生长因子生物学活性的多样性主要依赖于细胞外基质中的硫酸肝素，当细胞外基质中的硫酸肝素与碱性成纤维细胞生长因子相互结合后，能够对碱性成纤维细胞生长因子进行保护，避免受到热、酸、蛋白酶等因素影响加快其降解速度。因此，临床上在高度仿生神经组织工程支中引入硫酸肝素，能够修复神经缺损组织，提高周围环境中的神经营养因子，促进神经组织更好的再生且能够维持稳定的内环境。实验中，将复合材料植入实验大鼠缺损坐骨神经处，可以发现许旺细胞在支架内的结构也表现为纵行平行排列，并且其组织与实验大鼠坐骨神经损伤远端内的许旺细胞增强十分相似，其生长环境更加符合缺损组织再生环境。观察细胞在支架上的黏附及生长情况，是评价支架生物相容性及细胞毒性最重要的方法，实验中，培养1 d后能够看见，大鼠神经细胞分布在支架的各个孔隙管道中；第3天，细胞沿着支架表面及细胞管道聚集生长，并且能够分泌出外基质，沉积在支架表面(观察期间新型支架结构保持完好)。由此看出，研究中制备的新型神经组织工程支架具有良好的生物相容性。

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