骨髓间充质干细胞修复系膜增生性肾炎：作用及机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.005

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

系膜增生性肾小球肾炎：根据光镜所见的一种病理形态学诊断的肾炎，是一组以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征的肾小球疾病。原发性系膜增生性肾炎又可分为4种：①系膜沉积物以IgA为主；②系膜沉积物以IgM为主；③有其他形式的Ig及(或)C3沉积；④没有Ig或C3沉积。

转化生长因子β：属于一组新近发现的调节细胞生长和分化的转化生长因子β超家族。这一家族除转化生长因子β外，还有活化素、抑制素、缪勒氏管抑制质和骨形成蛋白。转化生长因子β的命名是根据这种细胞因子能使正常的成纤维细胞的表型发生转化，即在表皮生长因子同时存在的条件下，改变成纤维细胞贴壁生长特性而获得在琼脂中生长的能力，并失去生长中密度信赖的抑制作用。

背景：骨髓间充质干细胞可以向肾脏实质细胞分化，因而可能具有修复肾脏损伤的作用。

目的：探讨骨髓间充质干细胞修复系膜增生性肾小球肾炎的效果及作用机制。

方法：30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，分别为正常组、模型组以及治疗组。模型组和治疗组尾静脉注射小鼠抗大鼠Thy1.1单克隆抗体制备系膜增生性肾小球肾炎模型，造模后1周，治疗组大鼠经尾静脉注射2×10⁶个骨髓间充质干细胞，其他2组注射等量生理盐水。细胞移植后2周，检测尿蛋白定量、尿素氮、肌酐水平，苏木精-伊红染色观察各组肾组织病理改变，免疫组化检测肾组织转化生长因子β1表达。

结果与结论：①模型组和治疗组的尿蛋白定量、尿素氮、肌酐水平均显著高于正常组(P < 0.05)，治疗组尿蛋白定量、尿素氮、肌酐水平均显著低于模型组(P < 0.05)；②模型组大鼠肾小球系膜细胞弥漫性增多伴基质增加，部分肾小球硬化，间质存在炎性细胞浸润；治疗组肾小球增生和系膜增殖程度较模型组明显减轻，炎性细胞浸润现象也明显减轻；③模型组和治疗组转化生长因子β1表达水平显著高于正常组(P < 0.05)，治疗组转化生长因子β1表达水平显著低于模型组(P < 0.05)；④结果表明，骨髓间充质干细胞移植可以修复系膜增生性肾炎损伤，其部分机制可能与其抑制肾组织的转化生长因子β1过高表达有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5974-0562(廖丹)

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 系膜增生性肾炎, 骨髓间充质干细胞, 细胞移植, 旁分泌, 转化生长因子β1

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells are likely to repair renal injury by differentiating into renal parenchymal cells.
OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of bone marrow mesenchymal stem cells in the renal repair after mesangial proliferative glomerulonephritis.
METHODS: Thirty Sprague-Dawley rats were randomized into normal group, model group and treatment group (n=10 per group). Model group and treatment group were treated with tail vein injection of mouse anti-rat monoclonal antibody Thy1.1 to prepare mesangial proliferative glomerulonephritis models. One week after modeling, rats in the treatment group were given 2×106 bone marrow mesenchymal stem cells via the tail vein, and rats in the other two groups were given the same volume of normal saline. Two weeks after transplantation, urinary protein, urea nitrogen, creatinine levels were detected; hematoxylin-eosin staining was used for observing pathological changes of the renal tissue under microscope; and the expression of transforming growth factor beta 1 was detected by immunohistochemistry method.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of urinary protein, urea nitrogen and creatinine as well as the expression of transforming growth factor beta 1 in the renal tissue arranged in descending order were listed as follows: model group > treatment group > control group, and there were significant differences among three groups (P < 0.05). In the model group, diffuse glomerular hyperplasia was observed with the presence of increased extracellular matrix, partial glomerular sclerosis, and interstitial infiltration of inflammatory cells; in the treatment group, glomerular hyperplasia, mesangial proliferation and inflammatory cell infiltration were all mitigated compared with the model group. Therefore, bone marrow mesenchymal stem cell transplantation may contribute to renal repair after mesangial proliferative glomerulonephritis, by inhibiting overexpression of transforming growth factor beta 1 in the kidney.
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Glomerulonephritis, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Transforming Growth Factor beta1, Tissue Engineering

廖丹，张林，代小雨，汪嘉莉，杜晓炯. 骨髓间充质干细胞修复系膜增生性肾炎：作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(14): 2015-2020.

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图/表（结果） 6

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照组动物实验。

1.2 时间及地点实验于2015年10至12月在绵阳市中心医院完成。

1.3 材料健康雄性SD大鼠30只，体质量300-400 g，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司，许可证号SYXK(京)2015-000810。研究相关方案提交医学伦理部门审核，符合相关伦理学要求。

骨髓间充质干细胞株由上海拜力生物科技有限公司提供。

骨髓间充质干细胞修复系膜增生性肾炎实验所用主要试剂与仪器：
试剂及仪器	来源
DMEM培养液	Gibico公司
乙醚	上海杰美基因医药科技有限公司
胰酶	德国RECI公司
中性甲醛	重庆市华雅干细胞技术有限公司
免抗鼠转化生长因子β1	无锡易纯净化设备有限公司
冰箱	美国伯腾仪器有限公司(BioTek)
离心机	北京东南仪诚实验室设备有限公司
切片机	上海安谱实验科技股份有限公司
IMP-2000 图像分析系统	郑州科利科仪实验设备有限公司
超净工作台	重庆市劲康生物技术有限公司
光学显微镜	Tecan集团奥地利有限公司

1.4 实验方法

1.4.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞培养^[8-11] 将骨髓间充质干细胞株从液氮中取出，放入水浴锅中轻轻摇动让细胞快速溶解，用吸管将冻存管中的细胞悬液移至加入DMEM培养液的离心管中，离心，弃上清，添加2-4 mL DMEM培养液进行细胞重悬。将细胞悬液接种至培养瓶中，加入适量培养液，放入37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中进行培养，第2天进行换液，以后每3 d换液1次，待细胞长到80%-90%汇合时进行传代。

1.4.2 系膜增生性肾小球肾炎模型制备及细胞移植 30只SD大鼠随机分为3组，每组10只，分别为正常组、模型组以及治疗组。模型组和治疗组参照文献[12]制备系膜增生性肾小球肾炎模型。每只大鼠以6.67 μg/g用量一次性经尾静脉注射小鼠抗大鼠Thy1.1单克隆抗体(质量浓度为0.8 g/L)。模型制备后1周，治疗组大鼠经尾静脉注射2×10⁶个骨髓间充质干细胞，其他2组注射等量生理盐水。于模型诱导后测定24 h尿蛋白定量、尿素氮及血肌酐水平，同时处死大鼠，光镜下观察上述时间点肾脏病理改变。

1.4.3 尿蛋白定量、尿素、肌酐检测^[13] 细胞移植后2周，采集各组大鼠的尿液进行尿蛋白定量检测。乙醚麻醉后眶内静脉采血，检测尿素氮、肌酐水平。

1.4.4 苏木精-伊红染色^[14] 上述指标检测后处死各组大鼠，取肾组织，经体积分数为10%甲醛溶液固定，乙醇逐级脱水、石蜡包埋，制备肾组织病理切片，行苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察肾组织病理学改变。

1.4.5 免疫组化法检测肾组织转化生长因子β1表达^[15-16] 取肾组织石蜡切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水，滴加体积分数为3%H₂O₂室温孵育，5% BSA室温封闭，添加一抗(免抗鼠转化生长因子β1)过夜，DAB显色，置于光学显微镜下观察。采用IMP-2000图像分析系统计算肾小球转化生长因子β1阳性面积与肾小球总面积的比值。

1.5 主要观察指标 ①各组大鼠尿蛋白、尿素氮、肌酐水平。②各组大鼠肾组织病理学改变。③各组大鼠肾组织转化生长因子β1表达。

1.6 统计学分析使用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组内比较进行配对t 检验，组间比较进行单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

系膜增生性肾小球肾炎是一种肾小球疾病，大部分对激素治疗敏感，预后良好^[17]，但有部分患者会反复复发，导致疾病迁延不愈，严重影响身体健康，少数患者甚至转为慢性肾炎，最后出现肾功能衰竭^[18]。无论是激素还是免疫抑制剂都有较严重的不良反应，长期应用对患者的健康同样有严重的影响^[19-20]。肾病的病理类型属于微小病变，目前认为是由于细胞免疫异常导致的疾病。有研究证实骨髓间充质干细胞可促进肾小球内皮细胞损伤后的再生及修复，但具体的作用机制尚不清楚^[21]。骨髓间充质干细胞具有调节细胞免疫，抑制异常细胞免疫的功能，已经在治疗移植物抗宿主病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等疾病中获得了较大进展^[22-23]。骨髓间充质干细胞属于一种多能干细胞，可用于治疗某些难治性疾病及相关组织器官的修复^[24]。

实验应用骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠系膜增生性肾炎，移植后2周，模型组和治疗组的尿蛋白定量、尿素氮、肌酐水平显著上升(P < 0.05)，治疗组的尿蛋白定量、尿素氮、肌酐水平均显著低于模型组(P < 0.05)，提示系膜增生性肾炎大鼠会出现明显的肾功能异常，经骨髓间充质干细胞治疗后，各项指标可以得到显著改善。经苏木精-伊红染色观察也发现，治疗组肾小球增生和系膜增殖现象较模型组明显减轻，炎性细胞浸润现象也明显减轻，提示骨髓间充质干细胞可能参与肾小球损伤的修复，改善系膜增生性肾小球肾炎症状。分析出现这一结果的原因，可能是因为注射的骨髓间充质干细胞可分化成肾脏固有的功能细胞参与损伤修复^[25-27]。

骨髓间充质干细胞还具有旁分泌作用，可以分泌各种细胞因子促进肾小球损伤的修复^[28]。有研究表明，骨髓间充质干细胞可以分泌细胞生长因子来抑制T淋巴细胞的活化、增殖等异常免疫反应^[29-30]，进而抑制体内过度的免疫反应，阻止免疫复合物以及其他致炎因子的产生，从根本上治疗肾炎，起到消除蛋白尿、保护肾脏的作用^[31-33]。实验结果显示，模型组和治疗组转化生长因子β1表达水平均显著上升，可见转化生长因子β1是导致大鼠肾损伤进展的重要原因。免疫组化观察可见正常组肾小球上皮细胞和肾小管上皮细胞有少量转化生长因子β1表达，模型组肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞有大量转化生长因子β1表达，治疗组较模型组转化生长因子β1表达较少。骨髓间充质干细胞通过旁分泌作用，可以下调肾组织中转化生长因子β1的表达，达到延缓肾功能进展的效果。

综上所述，骨髓间充质干细胞移植可以修复系膜增生性肾炎损伤，从细胞水平上通过新生各种肾实质细胞来恢复系膜增生性肾炎肾脏的各种生理功能，具有良好的临床应用前景^[34]。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程