超声对金黄色葡萄球菌生物膜的体外破坏作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.03.011

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

生物膜：由依靠胞外产物而吸附于固体表面的微生物集落构成，并能结合有机和无机成分；形成包含复杂的理化过程和生物群落的相互作用。生物膜系统是真核细胞特有的系统，由细胞器膜，细胞膜和核膜构成，这些生物膜的组成成分和结构相似，结构和功能密切相关，表现着协调统一性。

超声波：是一种频率高于20 000 Hz的声波，它的方向性好，穿透能力强，易于获得较集中的声能，在水中传播距离远，可用于测距、测速、清洗、焊接、碎石、杀菌消毒等。在医学、军事、工业、农业上有很多的应用。超声波因其频率下限大于人的听觉上限而得名。

背景：有研究表明，超声增强抗生素杀菌能力的效力表现为强度依赖性，即超声强度越高其效力越大。

目的：观察不同强度超声对金黄色葡萄球菌及其生物膜的破坏作用。

方法：采用引导片培养法体外培养金黄色葡萄球菌生物膜，分为3组干预，对照组不作任何处理；低强度超声组采用强度为500 mW/cm、频率为200 kHz的脉冲超声波干预10 min；高强度超声组采用强度为40 W、频率1 MHz的连续超声波干预10 min。采用超声振荡-活菌计数法计数细菌菌落；采用碘化丙啶(PI)和FITC-ConA分别标记细菌DNA和多糖，激光扫描共聚焦显微镜检测生物膜成型情况。

结果与结论：高强度超声组细菌菌落低于对照组、低强度超声组(P < 0.05)，后两组间细菌菌落比较差异无显著性意义。低强度超声组红色荧光和绿色荧光的数量及密集程度与对照组无明显区别，高强度超声组的红色荧光和绿色荧光相对于前两组有明显减少。表明低强度超声不能杀灭细菌且对细菌生物膜的破坏作用微小，高强度超声能有效杀灭细菌，并且对细菌生物膜具有显著破坏作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

ORCID: 0000-0002-8676-6888(张伟)

关键词: 生物材料, 材料相容性, 抗菌抗病毒材料, 细菌生物膜, 金黄色葡萄球菌, 激光共聚焦显微镜, 免疫荧光技术, 超声空化

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the ultrasound enhances the on bactericidal activity of antibiotics in an intensity-dependent manner, that is, the higher the ultrasound intensity, the greater its effectiveness.

OBJECTIVE: To study the destructive effect of different intensities of ultrasound on Staphylococcus aureus and its biofilm.

METHODS: Staphylococcus aureus biofilms were cultured in vitro using guide sheet culture method and divided into three groups for intervention. The biofilm in the control group received no treatment. The biofilm in the low-intensity ultrasound group was intervened by pulsed ultrasound with an intensity of 500 mW/cm and frequency of 200 kHz for 10 minutes. The biofilm in the high-intensity ultrasound group was intervened by continuous ultalsound with an intensity of 40 W and frequency of 1 MHz for 10 minutes. Bacterial colonies were counted using ultrasonic oscillation-live bacteria counting method. DNA and polysaccharide of the bacteria were respectively marked using propidium iodide and FITC-ConA. The molding of the bilfilm was determined using laser scanning confocal microscope.

RESULTS AND CONCLUSION: The number of bacterial colonies in the high-intensity ultrasound group were lower than that in the control and low-intensity ultrasound groups (P < 0.05), and there were no significant differences between control and low-intensity ultrasound groups. There were no significant differences in the number and intensity of red fluorescence and green fluorescence between low-intensity ultrasound and control groups; however, the number and intensity of red fluorescence and green fluorescence in the high-intensity ultrasound group were significantly decreased compared with the low-intensity ultrasound and control groups. These results demonstrate that the low-intensity ultrasound cannot kill the bacteria and it has a tiny destructive effect on the biofilm of bacteria; however, the high-intensity ultrasound can effectively kill the bacteria and has a strong destructive effect on the bilfilm of bacteria.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

张伟，蔚芃，陈路. 超声对金黄色葡萄球菌生物膜的体外破坏作用[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(3): 364-369.

Zhang Wei, Wei Peng, Chen Lu . In vitro destructive effect of ultrasound on Staphylococcus aureus biofilms[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(3): 364-369.

图/表（结果） 1

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引言

随着医疗技术和生物材料技术的不断发展，不同种类的生物材料，如关节假体、骨科钢板与钢钉等进入了临床治疗中，并发挥着重要作用。这些金属内置物置入后一旦造成感染，后果往往是灾难性的。这些医学金属植入物感染难以治疗的原因，除了细菌侵蚀力强和机体抵抗力减弱以外，最主要的原因是感染细菌在无血供的金属内置物表面形成了细菌生物膜。细菌生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体^[1]。生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显著差异，主要表现在细菌对环境变化的反应能力显著降低，特别是对抗生素的敏感性明显下降，当感染部位的细菌聚集并产生生物膜后，使用正常剂量成百倍的药物也很难见效^[2]。据估计，大约65%人类细菌性感染是由细菌生物膜引起的^[3]。

细菌具有极强的黏附性，可黏附在物体表面，同时分泌大量蛋白、多糖和DNA等多聚物质将自身包裹，从而形成细菌生物膜。自1978年Costerton等^[4]首次提出生物膜这一观点后，学者们对细菌生物膜的形成、生物学特性及生物膜与人类疾病的关系进行了广泛研究。了解这种膜性结构的特征对于进一步了解细菌高耐药机制的产生有着重要意义。细菌生物膜的形成被认为是细菌产生耐药的重要原因之一，所以研究生物膜形成及耐药机制具备重大的科学意义和临床价值。本实验第一步则是培养金黄色葡萄球菌标准菌株的生物膜，并了解其形成过程。

细菌生物膜的耐药机制尚不十分明确，目前流行的推论有以下几点：①营养限制学说：认为生物膜高耐药性的机制主要由细菌的低代谢状态导致。当细菌生物膜重新获取氧分子及营养物质时，他们对抗生素的敏感性恢复到敏感状态。②20世纪80年代，学者们认为生物膜作为细菌的保护屏障，阻碍了抗生素的扩散能力，导致了细菌的高耐药性，被称为渗透限制。③生物膜中的细菌对抗生素的抗药性是由独特基因的表达水平控制的。从mRNA水平和蛋白水平探索细菌生物膜状态和浮游状态下基因表达的差异，是目前生物膜耐药性研究的一个热点。然而细菌生物膜耐药机制并非单一的，他会通过多重机制综合影响，共同产生。随着未来研究的不断深入，其耐药机制会更为清晰。

研究生物膜首先要建立起一个能够用于实验研究的体外生物膜模型，早期学者选用了微孔板法静态培养细菌生物膜，但操作复杂、实验干预条件较多，导致最终的误差增大，影响实验结果。随着研究技术的不断发展深入，也发展出了新的研究方法，加尔卡里生物膜装置(Calgarybiofilm divice，CDB)及Robbins装置。CDB依然属于静态培养类方法，但对于生物膜的处理相对较为方便。Robbins则是属于流动的培养装置，其准备过程相对比较复杂。本次实验则选择了近年来相对较为新颖的培养方法-引导波片法。该方法将生物膜形成固定在一盖玻片上，其准备及操作过程较为简单，且能有效控制和维持实验的各项参数。

怎样破坏生物膜成为了当今研究的一大热点。Alem等^[5]认为环氧化酶抑制剂非类固醇类抗炎药可能具有抑制细菌生物膜形成的作用，在白色念珠菌生物膜形成的不同阶段加入不同浓度的环氧酶抑制剂阿司匹林和前列腺素E2，发现其对生物膜形成的不同阶段均有抑制作用，且这种作用与药物浓度相关。然而又有研究表明，对于成熟稳定的生物膜，即使联合用药，抑菌率也只有50%-60%，说明在慢性感染治疗中只是联合用药仍然不够^[6]。Hana Culakova在研究PDR16基因突变对致病性光滑念珠菌在耐药和生物膜形成方面的影响时发现，PDR16基因在酿酒酵母和致病性酵母的多重耐药中起重要作用，PDR16基因突变后，与其相关的生物膜生成明显减少，且对联苯苄唑、伊曲康唑、酮康唑等药物的敏感性增加，敲除PDR16也将增加白念珠菌和光滑念珠菌对氟康唑的敏感性。甚至更多研发的新型药物也有比较显著的作用^[7]。物理方法破坏生物膜在实验室中备受青睐。20世纪90年代，Pitt等^[8]首次证实了低频超声可明显增强庆大霉素对细菌生物膜的杀菌效力。人们逐渐将超声应用到生物膜的研究中，并报道了相关机制，称之为“声学生物效应”^[9]。超声空化就是液体中的内源性或外源性微气泡(空化核)，在超声辐照作用下发生的振荡、膨胀、收缩及内爆等一系列动力学反应过程。理论与实验研究证实，超声空化能将声场的能量聚焦起来，于空化泡崩溃的瞬间，在液体中的极小空间内将聚集的能量释放，形成高温(> 5 000 K)、高压(> 5×10⁷Pa)的强力冲击波、射流等的极端物理效应。超声空化通常分为稳态空化与瞬态空化两类^[10]。由于液体内存在有微小的气泡，在声波的交变声压作用下，这些微小气泡就进入了振动状态；当声波频率与气泡共振频率接近时，气泡则进入共振状态，使振动的幅度逐步达到极致，但不会出现爆裂，此时，这种动力学现象被称为超声的稳态空化；当辐照液体的超声强度增加后，这些微小气泡的振荡过程就变得更为复杂和剧烈，在声波的负压半周期内，微小气泡迅速膨胀，且在声波正半周期内气泡被压缩致崩溃、内爆的过程，被称为瞬态空化。

本实验通过引导玻片法体外培养金黄色葡萄球菌标准株的细菌生物膜，加入不同强度的超声进行辐照干预，利用超声振荡-活菌计数法和激光共聚焦显微镜检测干预后生物膜的破坏情况及细菌灭杀情况，探索超声空化对细菌生物膜的破坏作用。

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材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点于2013年9月至2014年6月在川北医学院附属医院实验室完成。

1.3 材料标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)购自上海三踏生物科技有限公司。盖玻片购自四川赛普瑞斯仪器有限公司。

主要试剂：①胰酪胨大豆肉汤培养基(Tryptic Soy Medium，TSB)：北京三药科技开发公司生产，中国药品生物制品检定所监制，批号041216。②营养琼脂(Nutrient Agar Medium)：北京三药科技开发公司生产，中国药品生物制品检定所监制，批号：030905。③营养肉汤(Nutrient broth)。④SYTO9/PI荧光染料(L13152 Molecular Probes公司产品，批号631996)，荧光多糖染料FITC-ConA(Sigma公司，批号2910834)。

主要仪器：DHZ-032型恒温空气摇床(上海申能博彩仪器有限公司)；VC-750型超声波细胞粉碎机(美国Sonic公司)；立体压力蒸汽灭菌器(上海华线医用核子仪器有限公司)；Model-5410型匿温培养箱(美国NAPCO公司)；SPN302F型电子天平(奥豪斯国际贸易(上海)有限公司)；MS2型漩祸混合器(德国IKA公司)；CJ-IB型超净工作台(无净化一厂)；激光共聚焦显微镜 TCS SP2(德国 Leica 公司)；HIFU JC-200(重庆海扶技术有限公司)。

1.4 实验方法

引导玻片法建立体外模型^[11]：用接种环挑取新鲜的金黄色葡萄球菌于5 mL TSB肉汤中，37 ℃孵育24 h。使用TSB肉汤将孵育24 h后的菌液浓度调至10⁶ cfu/mL左右。在一无菌小三角瓶中加入10 mL TSB液，并将一盖玻片放入此三角瓶中，同时将10⁶ cfu/mL的菌液100 µL加入小三角瓶中。按照以上方法共制作30个，均分为对照组、低强度超声组与高强度超声组。将3组小三角瓶封口，放入恒温摇床中，37 ℃下120 r/min培养48 h。取出培养48 h的盖玻片，无菌生理盐水轻轻漂洗，去除浮游菌。观察平皿中菌落的生长状态。

超声干预：将两超声组的盖玻片浸入盛有脱气水的密闭容器内，在低频超声仪器的治疗头涂抹藕合剂，接于低强度超声组的容器底部进行辐照，超声强度为500 mW/cm²的脉冲波，频率为200 kHz，工作时间1 s，间歇时间1 s，辐照10 min；在高强度聚焦超声治疗头涂抹藕合剂，接于高强度超声组的容器底部进行辐照，超声强度40 W，连续超声，频率1 MHz，直线扫描方式辐照，扫线速度3 mm/s，扫线条数3条，扫线间隔5 mm，扫线长度10 mm，回数为2回，辐照10 min。对照组不行超声干预。

1.5 主要观察指标

超声振荡-活菌计数法计数细菌数：将漂洗后的盖玻片置于含有20 mL无菌生理盐水的小管中，超声波震荡功率180 W，时间1.5 min。取超声震荡后的菌液0.1 mL加入营养琼脂平皿中，均匀涂布，37 ℃孵育20-24 h。计数活菌数，计算每个盖玻片上生物膜内的细菌数。若直接将超声震荡后的菌液进行涂板，在孵育过夜后，平皿上的菌落生长会比较密集，从而无法算计出具体的菌落数，这并不易于做出相对准确地判断，因此在这一步骤中，将超声震荡后的菌液按10倍梯度的比例稀释至10^-⁴并涂板，孵育过夜，即可得到易于计数的菌落数。将计得的菌落数进行换算，即可作为判断生物被膜生长状态的定量指标，并便于进行比较，其换算公式如下：

膜片菌落数(cfu/cm³)=(肉眼可计菌落数×稀释倍数)/膜片体积(cm³)。

FITC-ConA和PI双染色观察细菌生物膜：细菌生物膜是由形成生物膜的细菌及细菌外基质组成，多糖是基质中最主要成分^[12]。FITC-ConA能与多糖结合而发出绿色荧光，PI可标记细菌的DNA而发出红色荧光，以此通过激光共聚焦显微镜可以在无损标本的情况下，观察细菌生物膜的形成及分布情况。实验步骤如下：取出3组盖玻片，PBS反复冲洗，去除未黏附的浮游细菌，吸水纸吸干多余水分，用2.5%的戊二醛固定1.5 h。用FITC-ConA (终质量浓度为50 mg/L)在4 ℃冰箱闭光染色30 min。再次洗片后用PI(终质量浓度为10 mg/L)于4 ℃闭光染色15 min。用PBS冲洗后吸干多余水分，40%甘油封闭于洁净载玻片，用激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像^[13]。

1.6 统计学分析将数据输入SPSS 11.5统计学软件，采用随机区组方差分析进行统计和分析。

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讨论

细菌生物膜的形成是一动态过程，从细菌的定植、黏附、聚集到分化成熟直至播散，共经历5个阶段。细菌首先在生物体或多聚物表面黏附，而后由于细菌之间相互作用聚集形成细菌团块，随着细菌的逐渐增多而形成成熟稳定的生物膜。最终，生物膜中部分细菌离开菌群向远处播散，从而启动又一个生物膜形成过程^[14]。细菌生物膜具有原核生物完整的成分，使其能够在不同的环境中生存。首先，细菌附着在有机或无机营养物质表面，并形成一个2-10 nm的蛋白吸附层，称之为调节膜。细菌产生的胞外聚合物与调节膜紧密结合，使细菌与机体免疫系统隔离，吞噬细胞和杀伤细胞及外源物质不能对细菌产生有效作用。

早期的细菌生物膜建立方式属于静态培养，以微孔板作为黏附载体，细菌可在孔板的底部形成被膜，并通过结晶紫染色法进行检测^[15]。微孔板法有着批量处理的优势，用于生物膜研究中可保持实验的一致性^[15-16]，同时配合不同种类的染色方法，可对生物膜的生长情况进行检测。尽管这类方法在早期应用广泛，但在恒温箱内液体易挥发、实验步骤繁琐等原因，可能造成较大的误差。学者们对生物膜体外模型的建立进行了大量研究，其培养方法不断得到改进^[17]。此次实验则选择了一种改良的建模方法，即引导片法^[11]，使用此方法可以较为动态、直观的观察生物膜生长情况，且引导片易于移动，方便各类操作。超声振荡-活菌计数法为首选方法，其结果稳定、重复性高。因此使用引导片法建立体外模型比较可靠。

在确定使用引导片法建立细菌生物膜体外模型之后，选择培养室温在37 ℃。37 ℃为人体正常体温，同时也是一般情况下细菌培养的最适温度。有实验表明，在标准菌株与临床菌株计数结果中，任何一个时间点上都能发现37 ℃环境下的细菌生长速率及黏附能力明显高于其余温度环境下的细菌。关于细菌生物膜的生长过程已有相关文献作出了较为详细的报道^[18]。细菌在黏附48 h后能形成初期的生物膜，在72 h后则逐步变为成熟生物膜^[19]，并被相关实验所证实。也依此为本次实验所用的环境、培养时间确定提供了依据。

超声作为热门手段被广泛应用于诸多实验中，其对正常组织损伤小，穿透性高，在对其聚焦、强度、频率的控制下可做到“以点打点，柔韧有余”。空化效应被分为稳态空化和瞬态空化。在稳态空化作用下，微泡是不会发生爆裂的，振动的微泡会产生剪切力和微射流，促进小分子物质穿透细胞膜或界膜^[20]，加速液体中物质的运输。有研究表明，超声增强抗生素杀菌能力的效力表现为强度依赖性，即超声强度越高则其效力越大^[21]。而超声的频率越高其抗菌效力会降低。这与低频高强度的稳态空化效应机制相符合。现已有文献报道，超声热效应与其增强抗生素抗菌效力无关联。在此次实验中，超声探头部位的散热器能使得干预时保持37 ℃的恒温状态，以此消除热效应的影响。低强度超声单独作用于悬浮液或生物膜时，并无明显的杀菌作用，反而会促进细菌的生长，这在实验的低强度超声组中得到了证实，在低强度超声辐照干预后，细菌活菌计数、显微镜中生物膜图像都有轻微增加，而没有对细菌生物膜造成明显的破坏作用。许多实验均报道超声辐照的同时加入抗生素，则其抗生素的杀菌效力得到恢复或提高。而Pitt等^[8]发现，若将悬浮菌液在超声辐照干预后才加入抗生素，其抗菌效力并未增强，说明低强度超声增强抗菌效力的能力是短暂可逆的。同时，Van Wamel等^[22]用高频摄像仪发现，超声空化效应导致细菌生物膜产生临时通道，抗生素能够穿过通道灭杀细菌；然而辐照一旦结束，通道在很短的时间内就会关闭，恢复其原有的高耐药性，这也被称之为“声孔效应”。

本次实验的高强度超声组选择的是高强度聚焦超声。高强度聚焦超声技术是利用超声声束的可汇聚性、穿透性等特点，将体外的低能量超声汇聚于体内靶点区，达到瞬间的空化效应、热效应等，使得靶区组织发生凝固性坏死，而极少损伤周围正常组织，从而达到无创目的，是一种先进的治疗技术，目前已在肿瘤治疗方面被广泛应用，同时也逐步引入其他领域，如溶栓、止血、基因传导和靶向药物^[23-27]。高强度聚焦超声对于细胞生物膜作用的机制主要为空化效应、热效应及机械效应。由于超声强度高，使得微泡激烈振荡，空化核随着超声的周期相发生膨胀、收缩，发生内爆并伴有强大的冲击波、高速微射流及自由基的产生，从而达到破坏细菌生物膜，甚至杀灭细菌效果。Bigelow等^[26]研究证实高强度聚焦超声能有效破坏体外大肠杆菌的生物膜结构。国内外也有报道高强度聚焦超声同样可以破坏体外铜绿假单胞菌的生物膜^[28]。实验所见，高强度聚焦超声干预后金黄色葡萄球菌生物膜中菌落数在一定程度上有减少趋势，细菌死亡率同步增加，但生物膜内所存活的细菌比例仍旧较大。其原因可能是由于所选取的高强度聚焦超声参数并未达到破坏生物膜的阈值所导致，使其杀灭细菌的能力有限。而在高强度聚焦超声干预后，细菌生物膜结构遭到破坏，部分细菌从中游离而出，成为浮游菌的方式存活，针对此类情况，可以考虑加入抗生素，或能达到良好效果。而生物膜内的细菌则可以利用强度稍低超声的空化作用，加强药物的传导作用^[29-31]。

目前，生物膜检测的主要手段是显微镜形态学观察和胞外基质染色方法。激光共聚焦显微镜拥有着比电镜等更为显著的优势^[32]，被公认为研究细菌生物膜的理想实验方法^[33-34]。激光共聚焦显微镜可以观察对细菌及生物膜内成分的染色，尽可能降低对细菌生物膜的破坏，并对细菌生物膜进行无损的断层扫描，获得生物膜的各类直观图，且能够进行3D图形重建，通过图形分析软件则可以对生物膜的厚度、均一性、分布情况等方面进行量化^[35]，从而达到对细菌生物膜形成过程行动态观察的效果，且使得操作更加简化，避免了一些不必要的失误，降低实验误差。在激光共聚焦显微镜应用于生物膜进行研究以来，人们对生物膜染色方法同时进行了研究发掘，将FITC-ConA和PI双重染色法最早应用于铜绿假单胞菌生物膜结果研究中^[36]。此法简易可行，逐渐用于其他细菌的研究。由于生物膜由细菌及其分泌的基质所组成，细菌生物膜基质的重要成分为多糖^[12^，^14]，且FITC-ConA能与多糖结合发出绿色荧光，而PI能进入细菌与DNA结合，发出红色荧光，从而实现了对细菌生物膜和多糖基质成分的显示。在本次实验流程中，通过激光共聚焦显微镜动态观察了生物膜形成过程及破坏后的结果，对照组在没有干预的情况下，可见红绿重叠的荧光有所分离，认为生物膜有播散的趋势；低强度超声组绿色荧光与对照组差异不大，有增加的迹象，考虑为低频超声的空化作用为稳态空化，并没有灭杀细菌的能力，生物膜在其声孔效应作用下形成的微小通道，同时使得膜内细菌能够与外界交流，重新激活，刺激了其生长，而在超声停止后迅速恢复，导致其生物膜的变化微乎其微；高强度超声组红绿荧光明显减少，提示细菌生物膜遭到破坏，细菌本身也被灭杀。

存在的问题及展望：利用激光共聚焦显微镜观察细菌生物膜的方法简单易行，适合应用到各类生物膜的研究实验中。但临床所见的细菌感染以混合感染为多，即常伴有多种细菌交叉感染，其生物膜形成的机制将更加复杂。本实验仅仅对一种细菌进行染色观察，且染料对细菌菌种并无特异性，因此，找寻特异性的染料更加深层次的研究细菌生物膜将是一个重要的问题。超声作用临床治疗手段已逐步涉及到医学的许多领域，通过其空化作用破坏细菌生物膜，对于细菌生物膜难治性感染的治疗提供了新的途径。无论是低强度超声配合抗生素的联合治疗，还是高强度超声的破坏及灭杀作用，仍需大量实验研究其最佳物理参数、适用范围及空化作用对临床菌株生物膜的有效性。

结论：引导片法培养细菌生物膜是一种简单易行的良好方法，操作简便，超声振荡-活菌计数法结果稳定。引导片在实验中移动方便且对模型损伤小，因此使用引导片法建立细菌生物膜的体外模型较为可靠。单纯的低频超声干预细菌生物膜，并不能有效破坏生物膜，反之会激活膜内细菌，促使其生长繁殖，在与抗生素同时使用的情况下能达到治疗的目的。高强度超声干预细菌生物膜，能有效破坏生物膜甚至灭杀细菌。激光共聚焦显微镜能动态直观地观察生物膜的形成过程和分布情况，同时对生物膜模型本身损伤较小，得到的结论较为稳定。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程