基因修饰牙龈成纤维细胞及脱细胞真皮基质制备牙周组织工程复合物

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (43): 6906-6912.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.43.004

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基因修饰牙龈成纤维细胞及脱细胞真皮基质制备牙周组织工程复合物

钟泉¹，李艳芬¹，闫福华²

1福建医科大学附属口腔医院牙周科，福建省福州市 350002；2南京市口腔医院，南京大学医学院附属口腔医院，江苏省南京市 210008

收稿日期:2015-07-18 出版日期:2015-10-15 发布日期:2015-10-15
通讯作者: 闫福华，博士生导师，教授，主任医师，南京市口腔医院，南京大学医学院附属口腔医院，江苏省南京市 210008
作者简介:钟泉，男，1981年生，湖北省京山县人，汉族，2009年福建医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事牙周病的防治研究。
基金资助:
福建省自然科学基金资助项目(2012J05143)；国家自然科学基金资助项目(30471892)

Fabricating periodontal tissue engineering compound by gene modified gingival fibroblasts and acellular dermal matrix

Zhong Quan¹, Li Yan-fen¹, Yan Fu-hua²

¹Department of Periodontology, Affiliated Stomatological Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 35002, Fujian Province, China; ²Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China

Received:2015-07-18 Online:2015-10-15 Published:2015-10-15
Contact: Yan Fu-hua, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu Province, China
About author:Zhong Quan, M.D., Attending physician, Department of Periodontology, Affiliated Stomatological Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 35002, Fujian Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Fujian province, No. 2012J05143; the National Natural Science Foundation of China, No. 30471892

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究发现人血小板源性生长因子B基因转染的牙龈成纤维细胞能够在体外快速增殖，且能够向胞外分泌血小板源性生长因子BB蛋白。

目的：了解人血小板源性生长因子B基因修饰牙龈成纤维细胞植入脱细胞真皮基质后，在体内形成牙周组织工程化复合物的能力。

方法：将人血小板源性生长因子B基因转染与未转染的Beagle犬牙龈成纤维细胞分别接种于脱细胞真皮基质上，观察细胞在脱细胞真皮基质上的生长情况。将人血小板源性生长因子B基因转染犬牙龈成纤维细胞-脱细胞真皮基质复合物(实验组)、犬牙龈成纤维细胞-脱细胞真皮基质复合物(对照组)及脱细胞真皮基质(空白组)分别植入裸鼠背部皮下，植入后2，4，8周，取背部标本进行组织学观察。

结果与结论：人血小板源性生长因子B基因转染与未转染的犬牙龈成纤维细胞均能在脱细胞真皮基质上良好生长。植入后8周，空白组周围的细胞大面积进入脱细胞真皮基质内，部分脱细胞真皮基质出现完全自体化，尽管细胞进入较多，但新生成的胶原纤维较少，细胞只是占据原有的胶原支架生长；对照组开始出现大面积新生胶原纤维，脱细胞真皮基质上原有的胶原纤维逐步被新生的胶原替代，但原有的胶原结构得到保留；实验组出现大面积完全矿化，可见沿原有胶原支架排列的矿化颗粒。表明接种人血小板源性生长因子B基因修饰牙龈成纤维细胞的脱细胞真皮基质在体内获得了成骨性能。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 脱细胞真皮基质, 牙周组织工程, 人血小板源性生长因子B, 转基因技术, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that human platelet-derived growth factor-B (PDGF-B)-transfected gingival fibroblasts are capable of rapid proliferation in vitro, which can secrete platelet-derived growth factor BB proteins.

OBJECTIVE: To explore the ability of PDGF-B-modified gingival fibroblasts in the acellular dermal matrix in vivo to form periodontal tissue engineering compound.

METHODS: Gingival fibroblasts from Beagle dogs transfected with or without PDGF-B gene were implanted into the acellular dermal matrix. Cell growth on the acellular dermal matrix was observed. PDGF-B gene-transfected gingival fibroblasts/acellular dermal matrix composite (experimental group), gingival fibrobalsts/acellular dermal matrix composite (control group) and acellular dermal matrix (blank group) were implanted subcutaneously into the nude mice, respectively. At 2, 4, 8 weeks after implantation, skin tissues were taken and observed histologically.

RESULTS AND CONCLUSION: PDGF-B gene-modified gingival fibroblasts and non-transfected gingival fibroblasts both grew and proliferated well in the acellular dermal matrix. At 8 weeks after implantation, in the blank group, the surrounding cells largely entered into the acellular dermal matrix, but produce less new collagen fibers, and the cells only grew on the original collagen scaffold; in the control group, a great amount of collagen fibers formed, the original collagen fibers in the acellular dermal matrix were replaced by newly formed collagens, but the original collagen structure was reserved; in the experimental group, a large scale of permineralization formed, and mineralized nodes were arranged along the original collagen scaffold. These findings indicate that PDGF-B gene modified gingival fibroblasts can acquire osteoplastic abilities in the acellular dermal matrix in vivo.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Platelet-Derived Growth Factor, Fibroblasts, Tissue Engineering

钟泉，李艳芬，闫福华. 基因修饰牙龈成纤维细胞及脱细胞真皮基质制备牙周组织工程复合物[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(43): 6906-6912.

Zhong Quan, Li Yan-fen, Yan Fu-hua. Fabricating periodontal tissue engineering compound by gene modified gingival fibroblasts and acellular dermal matrix[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(43): 6906-6912.

图/表（结果） 7

2.1 牙龈成纤维细胞在脱细胞真皮基质上的生长情况在培养板内的脱细胞真皮基质膜边缘，可见伸展开的牙龈成纤维细胞(图1A)，在某些比较薄的区域，使用倒置相差显微镜能够观察到细胞在脱细胞真皮基质表面和内部伸展、贴附的影像(图1B)。

PDGF-B 基因转染的牙龈成纤维细胞接种至脱细胞真皮基质上后，因细胞分泌增强型绿色荧光蛋白，故而整个脱细胞真皮基质发出绿色荧光(图1C)。

两种细胞在脱细胞真皮基质上均生长良好，未发现细胞异常死亡现象。

2.2 牙龈成纤维细胞接种至脱细胞真皮基质表面24 h 后的组织学表现脱细胞真皮基质的真皮面空隙较大，细胞进入到空隙内生长分化，成网状结构(图2A)。脱细胞真皮基质的表皮面结构致密，细胞在表皮面生长，见细胞呈线性排列生长(图2B)。

2.3 牙龈成纤维细胞接种至脱细胞真皮基质表面24 h后的电镜表现电镜下，脱细胞真皮基质的表皮面组织致密(图3A)，可见毛囊去除后散在的圆形孔隙(图3B)；脱细胞真皮基质的真皮面组织疏松(图3C)，可见大量形态不规则孔隙(图3D)；接种细胞后，细胞可黏附在其致密的表皮面(图3E)，部分细胞能够通过毛囊孔进入到脱细胞真皮基质内部(图3F)；由于真皮面存在孔隙更多，大量细胞能通过孔隙进入到脱细胞真皮基质内部生长(图3G、H)。

2.4 不同材料在裸鼠体内形成组织工程化复合物的表现

标本大体观察：术后2周时，3组脱细胞真皮基质基本无差异；与植入前相比，其透明度有所下降，质地仍然较为柔软。

术后4周时，空白组脱细胞真皮基质开始变得具有弹性，透明度进一步下降；对照组质地较空白组坚韧，颜色变为白色；实验组除色泽变化以外，其表面开始出现散在的乳白色小点，质地类似于软骨基质。

术后8周时，空白组出现部分白色区域，有些组的脱细胞真皮基质开始吸收、变小；对照组基本全部变为白色，质地更为坚韧，触摸有韧带感；实验组脱细胞真皮基质上出现大面积的乳白色区域，整个脱细胞真皮基质开始变硬。

组织学表现：由于实验前并未预计到转染组细胞会向成骨方向分化，因此所有标本均未进行脱钙处理。为确保切片正常进行，研究者采用修片后使用5%的稀盐酸涂布切面的即刻脱钙法，进行边脱钙、边切片。由于矿化组织未实施脱钙，因此凡是矿化的部位伊红着色均较浅，这部分结构于苏木精复染后呈现深紫色。研究者还发现，伊红染色时，脱细胞真皮基质原有的胶原纤维也不易着色——即原有的支架胶原呈现蓝紫色，而新形成的胶原纤维呈现粉红色——这种色泽上的差异便于研究者区分新、旧两种胶原的位置和数量。

术后2周时，空白组表面开始被纤维包裹(图4A)；对照组表层牙龈成纤维细胞开始形成类结缔组织(图4B)，脱细胞真皮基质原有的胶原被包裹、替代；实验组表层开始出现染成深紫色的矿化成分(图4C、D)。

术后4周时，空白组周围细胞开始进入脱细胞真皮基质内部，借助其原有的胶原支架，开始“自体化”(图5A)；对照组除有既往表现外，其内部开始出现类似牙周膜样、具有方向性的纤维结构(图5B)；实验组内部开始矿化，矿化部分借助了脱细胞真皮基质原有的胶原支架结构，矿化不全的部分仍可被伊红着色(图5C、D)。

术后8周时，空白组周围鼠细胞大面积进入脱细胞真皮基质内，部分脱细胞真皮基质出现完全自体化，尽管细胞进入较多，但新生成的胶原纤维(鲜红色)仍然较少，细胞只是占据原有的胶原支架生长(图6A)；对照组开始出现大面积新生胶原纤维，脱细胞真皮基质上原有的胶原纤维逐步被新生的胶原替代，但原有的胶原结构得到保留(图6B)；实验组出现大面积完全矿化，可见沿原有胶原支架排列的矿化颗粒(图6C、D)。

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引言

材料方法

1.1 设计对比观察实验。

1.2 时间及地点于2008年10月至2009年2月在福建医科大学口腔医学院中心实验室及解放军南京军区福州总医院比较医学科完成动物实验与细胞实验，于2012年12月至2013年4月期间在福建医科大学口腔医学院中心实验室完成部分标本的组织学实验。

1.3 材料

实验动物：成年雄性比格犬1只，体质量10 kg；6周龄雄性裸鼠，体质量15-20 g，均购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SCXK(沪)2007-0005。

1.4 实验方法

Beagle犬牙龈成纤维细胞在脱细胞真皮基质表面的培养：Beagle犬牙龈成纤维细胞的培养与鉴定参考文献[6]。

牙周组织工程复合物实验的的材料、试剂和仪器：
材料、试剂与仪器	来源
DMEM	Gibco
胎牛血清	Hyclone
脱细胞真皮基质	北京桀亚莱福生物技术有限公司
超净工作台	上海力申科学仪器公司
倒置相差荧光显微镜	Olympus
细胞培养箱	Heraeus
石蜡组织切片机	Thermo
S-3400扫描电镜	Hitachi

通过肉眼识别脱细胞真皮基质的表皮面和真皮面。将Beagle犬牙龈成纤维细胞接种至脱细胞真皮基质的表皮面和真皮面，接种24 h后经体积分数4%甲醛固定，一部分标本经脱水后，使用扫面电镜观察脱细胞真皮基质表面结构，以及细胞在脱细胞真皮基质表面生长的情况；另外一部分标本，经梯度脱水，浸蜡，包埋，制备5 µm超薄切片，常规苏木精-伊红染色，镜下观察其组织学结构。

PDGF-B基因修饰牙龈成纤维细胞与脱细胞真皮基质构建组织工程化复合物：将1 cm×1 cm的脱细胞真皮基质膜剪成5 mm×5 mm的大小，浸没于含DMEM培养液的平皿中，应注意使真皮面朝上。浸泡30 min后吸去培养液，再次加入新鲜的培养液备用。

PDGF-B基因转染牙龈成纤维细胞的方法和转染效率的控制参考文献[3]。取转染效率在20%以上的细胞组作为转染组。将转染与未转染细胞通过胰酶和EDTA消化，离心，重悬后形成5×10⁹ L^-¹的细胞悬液。

将5 mm×5 mm的脱细胞真皮基质膜转移到24孔板中，向每张膜的真皮面上滴加30 µL的细胞悬液(转染与未转染细胞)，使得每张膜上接种的细胞为1.5×10⁵个。于 37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中孵育2 h取出，每孔中加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液1 mL，24 h后观察细胞展开情况。接种48 h后进行体内植入实验。

将18只裸鼠随机均分为3组，分别于背部皮下植入接种PDGF-B基因转染牙龈成纤维细胞的脱细胞真皮基质膜(实验组)、接种牙龈成纤维细胞的脱细胞真皮基质膜(对照组)与脱细胞真皮基质膜(空白组)，每只植入2张膜，术后1-3 d严密观察，防止裸鼠因感染而死亡。术后2，4，8周引颈法处死裸鼠各2只，取背部标本，组织学切片、苏木精-伊红染色观察。

1.5 主要观察指标观察正常细胞和在转染PDGF-B基因细胞在脱细胞真皮基质膜表面生长的情况，以及两种细胞与脱细胞真皮基质膜复合后在体内形成相关组织复合物的差异性。

讨论

组织工程技术在口腔医学领域的应用日益广泛^[7]。这种技术使用具有增殖和分化潜能的种子细胞与支架材料复合工程化后，植入机体组织病损部位，种子细胞在支架材料逐渐降解吸收的过程中，形成具有正常形态和功能的相应组织，达到修复重建的目的。支架材料(或者称为细胞外基质)是组织工程技术应用的基础，在实施修复的过程中，它不仅直接支持细胞和组织，还能影响细胞的形态，调控细胞的正常代谢、迁移、增殖。一种理想的支架材料应具备良好的生物相容性和表面活性，良好的可塑性及生物降解性，并且具备三维立体结构及高度的多孔性，以便于种子细胞的植入和黏附，同时也保证营养成分的渗入以及代谢产物的排出^[8]。

脱细胞真皮基质主要来源于人或某些哺乳动物细胞(如猪、牛)的皮肤^[9]。制备脱细胞真皮基质时，通过化学和物理的方法可将皮肤内具有抗原性的细胞成分(如表皮细胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中的血管内皮细胞、成纤维细胞等)去除，同时保留完整的胶原成分和组织原有的基本结构。与其他的膜型支架材料不同，脱细胞真皮基质具有极性^[10]，但这一特性似乎并未得到临床医师和研究人员的重视。

依据脱细胞真皮基质的原有组织结构，可以将脱细胞真皮基质的两面分为表皮面和真皮面。表皮面组织致密，光滑，脱细胞处理后仅见少许孔隙——这些孔隙是原有毛囊占据的间隙。由于表皮面保留了部分基底膜的结构，这些结构十分适合上皮细胞的黏附和迁移。真皮面组织粗糙，电镜下见许多大小不一的孔隙，这些孔隙则有利于成纤维细胞和血管细胞的黏附和增殖。刘德伍等^[11]将皮肤的角朊细胞和成纤维细胞分别接种于脱细胞真皮基质的表皮面和真皮面，结果发现两种细胞在各自表面上生长、代谢良好。赖红昌等^[12]将人牙龈角质细胞接种至脱细胞真皮基质的表皮，以构建组织工程化的牙龈，研究发现，牙龈角质细胞能够在脱细胞真皮基质的表皮面良好地生长。体内研究方面，Novaes等^[13]将犬牙龈成纤维细胞接种至脱细胞真皮基质上，并将其植入上颌第1、2前磨牙根方的骨膜下，结果发现工程化的脱细胞真皮基质能够形成新的结缔组织瓣。本实验中，研究者将牙龈成纤维细胞与脱细胞真皮基质进行复合，通过扫描电镜和组织学观察表明，真皮面更适合牙龈成纤维细胞的增殖和分化——无论转染和未转染的牙龈成纤维细胞均在脱细胞真皮基质的表层和内部形成了相应的组织。

研究表明，桀亚脱细胞真皮基质中含有极为微量的成纤维细胞碎片^[14]，但由于成纤维细胞本身抗原性较低的原因，这些碎片并不引起宿主的免疫反应——这与本实验研究的结论一致：实验将脱细胞真皮基质和Beagle犬牙龈成纤维细胞复合，不论是在体外培养还是接种于裸鼠皮下，牙龈成纤维细胞均能良好生长——脱细胞真皮基质极弱的抗原性似乎并不造成细胞的免疫排斥反应。

研究者还发现，脱细胞真皮基质还能被脂肪细胞黏附、降解。空白组中的一张脱细胞真皮基质在与裸鼠背部皮肤的脂肪接触之后，在4周内，其内部的胶原结构基本被降解，脱细胞真皮基质几乎完全脂肪化。这一现象提示：在利用脱细胞真皮基质实施口腔洞型缺损的修复(如颊、腭部创伤或肿瘤术后)时，应注意修净创面附近的脂肪组织，否则脱细胞真皮基质将可能无法起到覆盖创面的目的。部分脂肪化的脱细胞真皮基质和完全脂肪化的脱细胞真皮基质，见图7。

某些来源于骨外组织的细胞，如成纤维细胞、周细胞、肌细胞等，在诱导因子的持续作用下，可向成骨细胞转化并保持成骨能力，这些细胞被称为诱导性骨祖细胞^[15]。Matsumura等^[16]认为牙龈成纤维细胞在某些诱导条件下，可表现出成骨潜能。体外培养时，使用特定的诱导培养基可上调牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶表达水平，促进其向成骨方向转化^[17]。张韶君等^[18]使用重组人骨形态发生蛋白2对人牙龈成纤维细胞进行长期体外培养，发现在重组人骨形态发生蛋白2的持续作用下，牙龈成纤维细胞的碱性磷酸酶水平能够得到显著提高，20 d时可形成明显的矿化结节。进一步的研究发现，转基因技术也能使一些原本不具备成骨能力细胞向成骨方向转化。Jin等^[19]将骨形态发生蛋白7基因通过腺病毒载体转染大鼠皮肤成纤维细胞，并将转染细胞体外扩增后与胶原凝胶复合植入手术制备的大鼠牙周骨缺损区，术后表明缺损区有新生骨和牙骨质生长，其结构与牙周组织缺损的生理性愈合接近。赵川江等^[20]研究发现，将人釉原蛋白基因导入人牙龈成纤维细胞后，其碱性磷酸酶的表达量显著提高。因此，有学者认为非骨源性的成纤维细胞在被具有诱导骨形成能力的活性肽外源基因导入修饰后，不仅表达功能性目的蛋白，通过旁分泌途径对邻近细胞产生诱导分化作用，并且成纤维细胞本身还能向成骨样细胞分化^[21]。尽管还有一些其他研究结果也佐证了这一结论的正确性，但实际上并非所有的细胞转染成骨源性多肽都能获得成骨细胞的表型。Rutherford等^[22]将骨形态发生蛋白7通过腺病毒转染人的牙龈角化上皮细胞，接受转染的角化上皮细胞并未获得成骨表型；Hakki等^[23]将骨涎蛋白基因转移至牙周膜细胞，通过体内外实验研究发现，这种基因修饰的牙周膜细胞并不能促进矿化。

有学者报道PDGF-BB蛋白能够促进牙周韧带细胞和成骨细胞的增殖和分化，促使根分叉区的骨缺损快速愈合，但PDGF-B本身不属于成骨源性多肽基因，转染成纤维细胞后也未见成骨表型的转化^[24]。Anusaksathien等^[25]使用腺病毒作为载体，将PDGF-B转染人的牙龈成纤维细胞，发现转染的细胞能成功修复体外制备的牙龈缺损模型，但并未报道转染细胞具有成骨分化的能力。

本实验中发现，Beagle犬牙龈成纤维细胞在转染后，在裸鼠皮下可形成一定的类骨质，其原因可能是：①尽管进行细胞培养的组织块全部从牙面上切除，但由于Beagle犬游离龈较窄，游离龈根方的牙龈成纤维细胞可能保留了牙周膜细胞的某些分化潜能；研究者还发现，并不是整张的脱细胞真皮基质上都出现了类骨质，在类骨质的周围还存在少许结缔组织样结构。②脱细胞真皮基质和裸鼠背部微环境的诱导作用。脱细胞真皮基质已被用于引导骨组织再生术，适合骨膜细胞和软骨细胞在其内部生长分化；脱细胞真皮基质/脱钙骨基质微粒复合体具有很强的骨诱导作用，适合作为骨组织工程的支架材料^[26]。另外，裸鼠背部骨骼肌表层的微环境可能为矿化沉淀提供了离子和营养支持。③PDGF-BB的持续分泌促进了具有分化潜能细胞的大量增殖，大量分化的细胞可能在局部聚集形成矿化结构。
当前，脱细胞真皮基质在牙周手术中的应用日益广泛。使用脱细胞真皮基质可进行根面覆盖、增加角化龈的宽度、纠正和预防牙槽嵴的形态异常、消除牙龈色素沉着、引导骨组织再生术等治疗；与传统的上皮下结缔组织移植瓣相比，脱细胞真皮基质具有取材量不受限制、手术时间较短、术区少(无供瓣区)、术后不适较轻、并发症较少等优点。鉴于脱细胞真皮基质的以上这些优点，结合本实验的结果，研究者为脱细胞真皮基质在牙周组织再生中的应用提供2个可能的思路：①将脱细胞真皮基质的微粒作为单纯的支架材料，与成骨源性的细胞(或骨充填材料，如羟基磷灰石等)复合，用以修复根分叉区的骨缺损。②使用基因修饰的牙龈成纤维细胞(或牙周韧带维细胞)与脱细胞真皮基质进行复合，将具有成骨能力的真皮面与根面或骨缺损区进行接触，使基因修饰的牙龈成纤维细胞(或牙周韧带维细胞)形成新的牙槽骨，同时分泌大量PDGF-BB蛋白，促进根面附近的牙周膜再生；另一方面，致密的表皮面与龈瓣接触，超出龈缘的部分利于牙龈上皮细胞的迁移和黏附，形成新生的牙龈覆盖根面，而龈缘以下的脱细胞真皮基质则可作为一种可吸收的屏障膜，防止上皮细胞和正常的牙龈成纤维细胞向缺损处长入，从而实现完全的牙周组织再生。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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